Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לשימוש קילוף פלסטיצידיות כמו פולימר במיקרועטיפת של תאים מונצח למסירה לטווח ארוך של מוצרים ביולוגיים לעיניים מכרסמים.
Abstract
Therapeutics הנוכחי רבים תחת פיתוח עבור מחלות של הקוטב האחורי של העין הם מוצרים ביולוגיים. תרופות אלה צריך להיות מנוהל לעתים קרובות, בדרך כלל באמצעות זריקות אמיתי. תאים בעלי כימוס המבטאים את הביוג'יק של הבחירה הופכים לכלי לייצור חלבון מקומי ושחרור (למשל, באמצעות אספקת סמים לטווח ארוך). בנוסף, מערכות כימוס לנצל חומרים חדירות המאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים. הדבר מתרחש בזמן שהוא מסווה את התאים מהתגובה החיסונית של המחשב המארח, תוך הימנעות מצורך בדיכוי מערכת החיסון המארחת. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באלגיאט כפולימר במיקרומניפולציה בשילוב עם שיטת ההתזה כטכניקת מיקרו-כימוס. ARPE-19 תאים, הנובעים באופן ספונטני קו התאים RPE האנושי, כבר בשימוש ניסויים תא לטווח ארוך בגלל הפונקציונליות שלה במשך החיים, והוא משמש כאן לעטיפת משלוח של קפסולות לעיני העכבר. כתב היד מסכם את הצעדים למיקרועטיפת תאים, לבקרת איכות ולמסירה בעינית.
Introduction
טיפולים מבוססי תא מייצגים טכניקות ביולוגיות מהפכנית שהוחלו רבות ברפואה. לאחרונה, הם הוחלו בהצלחה בטיפול במחלות ניווניות, מחלות עיניים, סרטן. תרפיות בתאים מכסות מגוון רחב של שדות מהחלפת תאים לאספקת סמים, ופרוטוקול זה מתמקד במקרה האחרון. מיקרו כמוסות מתכלות (MC) הראו יעילות כמערכת משלוחים, והם נעשים בשימוש נרחב בתחום הביו-רפואי. Alginate שימש במיקרוכימוס בשל תהליך הג הפשוט שלה, biodegradability, biocompatibility מעולה, ויציבות תחת vivo תנאים1,2,3,4.
שיטת ההתזה, כטכניקת מיקרועטיפת מיקרו, הייתה מנוצל בהצלחה לכשלי פפטידים וחלבונים באמצעות קילוף פלסטיצידיות (פולימר בסיס) ו פולי-l-האורלך (משני פולימר ציפוי). שני הפולימרים מצויים באופן טבעי ומשמשים בביותאימות שלהם5,6,7. עם זאת, האתגר העיקרי בטיפולים מבוססי התא הוא דיכוי של מערכת החיסון המארחת כדי למנוע תופעות לוואי הנגרמות על ידי תרופות מדכאים חיסוני. החדירות של קילוף פלסטיצידיות microcapsules נחשב תכונה מתאימה עבור עטיפת התאים, אשר מאפשר דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים תוך הסוואה אותם תגובה חיסונית מארח8,9,10.
בעין, תאים כימוס שימשו ניסויים קליניים למסירה מתמדת של מוצרים ביולוגיים (כלומר, גורמי גדילה11,12 ו פקטור גדילה האנטוניסטים13) לטיפול רטיניטיס פיגמנטוזה או ניוון מקולרי הקשורות לגיל. מטרות אחרות כגון מעכבי המשלים14 הם גם בחקר כרגע הגדרות טרום קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון ואושרו על ידי האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה טיפול בעלי חיים ועדת השימוש תחת מזהה פרוטוקול 00399.
1. תרבית תאים
- ליצור תאים האפיתל האדם פיגמנט הרשתית (arpe-19) קו התא באופן בלתי נשכח את הגן של הבחירה על פי פרוטוקולים שפורסמו14,15.
- לשמור על התאים ב-בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העוברי (FBS).
- מודאת התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- החליפו את המדיום כל 2 – 3 ימים.
- מעבר לתאים לאחר שהגיע 70% – 80% זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים התרבות רקמה.
2. עטיפת תא
- מערבבים נתרן קילוף פלסטיצידיות עם (DI) מים לריכוז הסופי של 2% w/v ולטהר על ידי סינון עם מסנן מזרק סטרילי 0.2 יקרומטר.
- הכן את התאים להיות מעורבים עם הפתרון קילוף פלסטיצידיות על ידי טריזיציזציה, תפרידו, ושטיפת אותם עם 10 מ"מ hepes מלוחים באגירה פתרון (pH = 7.4). באמצעות התקן האטה, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז התא הסופי כדי 1 x 106 בפתרון קילוף פלסטיצידיות.
הערה: תהליך עטיפת הכיסוי צריך להיות מופעל בתוך מכסה מחוטא. - טען ~ 300 μl ליטר של קילוף פלסטיצידיות ושילוב תאים לתוך מזרק של 3 מ ל ולצרף אותו משאבת מזרק. הפתרון יישאב באמצעות מחט של 30 גרם בוטה לאמבט המים סטרילי ממוקם בגביע 50 mL סטרילי מתחת לקצה המזרק ב 7 מ"מ עבור מחט למרחק ריסוס אמבט.
- האמבטיה מכיל נפח של 40 mL של מלוחים 10 מ"מ HEPES באגירה המכיל 100 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2) ו 0.5% w/v פולי-l-האורלך (אש ף). אש ף היא ציפוי פולימרי משני שניתן להשמט או לשנותו בהתאם לצורכי החוקר.
- להתאים את קצב מתח וזרימה ולשמור אותם קבוע במהלך תהליך אנקפסולציה ב 60 mm/h שיעור זרימה ו 6.0 kV מתח ראשוני כדי לייצר בגודל מיקרוקפסולות של ~ 150 μm.
- חבר את הקליפ של חוט אנאודה (אדום) של מחולל מתח גבוה מחט המחט ולחבר את התמונה הקרקע (שחור) לחוט הנחושת כי הוא שקוע באמצע אמבט המים. קבוצה אחת של קילוף פלסטיצידיות + התערובת התא (1 mL) לוקח כ 30 דקות כדי להכין את התאים כמוסות (כ 25,000 microcapsules).
- לשטוף את מיקרוקפסולות שנוצרו המכילים תאים עם פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl2, pH = 7.4) פעמיים. אין להשתמש ב-PBS לכביסה.
- מודטה את התאים שעברו אנקפסולציה עם 10% FBS שנוספו מדיה DMEM בתוך מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
הערה: מכשירים לעיבוד כימוס מתוארים באיור 1.
3. אישור שאנקפסולציה אינה משפיעה על הכדאיות בתאים
- לאחר הדגירה של תאים שעברו אנקפסולציה עבור 24 שעות במדיה, להכין מדגם קטן של 500 μL (~ 30 microcapsules) עבור כתמים.
- שטוף את מיקרוקפסולות 2x באמצעות פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl2) ולהכתים אותם עבור הכדאיות חי מת באמצעות ערכת שיטת חיים/מת.
- הכינו תערובת מכתיבת של calcein AM (acetoxyמתיל) ואתידיום הומודימר -1 בריכוזים סופיים של 2 μM ו-4 μM, בהתאמה.
- הוסף 2 מ ל של תערובת מכתים את התאים שעברו כימוס עבור 30 – 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT).
- עם שאיפה זהירה, מכתים את הפתרון כתמים ולשטוף את microcapsules 2x עם פתרון כביסה. השתמש במערכת מיקרוסקופ פלורסנט כדי להתבונן ולצלם את התאים שעברו אנקפסולציה.
הערה: תיעוד האנקפסולציה מתואר באיור 2.
4. אישור כי קפסולות הם הגודל המתאים עבור משלוח ומשלוח של הביוג'יק
- זריקות מיוחדות בעין העכבר מבוצעות בדרך כלל עם המחט 27 G בוטה-עצה (הקוטר הפנימי של 210 μm) מצורף מזרק 2.5 μL המילטון.
- צור קפסולות החל מ 100 כדי 200 μm, לדלל אותם במדיה ללא סרום, ובזהירות למשוך אותם לתוך מזרק המילטון. Pbs אינו רכב מתאים, כמו קפסולות קילוף פלסטיצידיות להתמוסס ב-PBS.
- לאט להוציא 1 μL טיפות המכיל קפסולות על שקופית מיקרוסקופ ולקבוע את השלמות שלהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף.
- כוונן את גודל הקפסולה (ראה שלב 2.3) על-ידי התאמת קצב מתח וזרימה בהתאם. מיקרוקפסולות קטנות יותר מיוצרות בצורה לא לינארית על ידי הגדלת מתח ושיעור הזרימה היורדת מעט8. בידינו, קפסולות של 150 יקרומטר בקוטר הוכח להיות מתאים ביותר. התאמה של גודל קפסולה תלויה גם לשמור על קבוע ריכוז קילוף פלסטיצידיות תוך שינוי הפרמטרים האחרים.
- שמור על קבוצה נפרדת של תאים בכמוסות של הגודל המתאים במדיום ללא סרום, כדי לקבוע את כמות ההפרשה הביולוגית הרצויה. השתמש באליאס רגיש או בכתמים מערביים כדי לקבוע את ריכוז התכשירים הרפואיים ב-supernatant.
- לקבוע את הכמות הנדרשת של קפסולות כי צריך להיות מוזרק מבוסס על PK/PD הידוע (פרמקוקינטיקה/פרמקודינמיקה) של הריפוי. בידיים שלנו, 10 קפסולות לכל עין העכבר הוכיחו להיות יעיל ביותר.
5. משלוח כמוסה לתוך ויטאוס העכבר
- לבצע זריקות אמיתיות. בעזרת מיקרוסקופ מבתר ראה איור 3 להגדרה כירורגית וחומרים המשמשים במהלך הפרוצדורה. פרוטוקול מפורט לזריקות מיוחדות ניתן למצוא במקום אחר16.
- עכברים מורדם על ידי הזרקה תוך הצפק של xylazine וקטמין (20 מ"ג/ק"ג ו 80 מ"ג/ק"ג) או הרדמה מועדפת אחרים שאושרו על ידי הוועדה הספציפית לטיפול בבעלי חיים ושימוש. ודא את עומק ההרדמה המתאים באמצעות צביטה בבוהן17.
- להתרחב תלמידים העכבר עם phenylephrine HCL (2.5%) ו אטרופין גופרתי (1%) כדי לאפשר ניראות טובה של החדר האינדקטור ולמרוח ג'ל עין סיכה על העיניים כדי לשמור אותם מנוזלים במהלך ההליך.
- לנקב את sclera ב לימבוס עם מחט של 26 G כמו חור המדריך, וודא כי 1) המחט היא בזווית 45 ° עם העין והשולחן 2) קצה משופע מכוון כלפי מעלה כדי למנוע חדירה של העדשה.
- בזהירות להזריק את כמוסות באמצעות המחט 27 G בוטה-עצה מוצמד מזרק המילטון בזווית 45 ° תחת בדיקה חזותית, והקפד להימנע מלגעת העדשה עם המחט. פציעה של העדשה תוביל להיווצרות קטרקט. הקפסולות צריך להיות גלוי בתוך המיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מבתר (איור 4A).
- לאחר הנסיגה של המחט, לטפל באתר ההזרקה עם משחות אנטיביוטיות neomycin ו polymyxin B סולפטים בנוסף למשחה אנטיביוטית בטיפול אופטלמולוגי.
- החלת להוריד פתרון אופטלמולוגי (2.5%) לשתי העיניים כדי למנוע מהקרניות להתייבש בתקופת ההחלמה.
- הניחו את העכבר על משטח חימום שנערך ב-37 ° c והצג עד הערה מלאה.
- הזרקה מוצלחת של כפולת arpe-19 תאים צריך לחשוף את הנוכחות של כמוסות שלמות בחדר אינדקטור של העכבר עם כמויות זעירות בלבד של פסולת בעת הדמיה של העין על ידי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית או שיטות אחרות (איור 4b).
- עין העכבר מוזרק, לאחר כמה ימים של התאוששות עקב הניתוח, הוא כעת מוכן הפרדיגמה הניסיונית בהישג יד.
הערה: הגדרת כירורגית ותיעוד של כמוסות בעין מתוארות באיור 3 ובאיור 4, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ARPE-19 תאים הם הונצח באופן ספונטני RPE תא האדם כי כבר הוכח להיות קלה כימוס והישרדות לטווח ארוך עם השרשה של קפסולות לתוך העין. כלים לעטיפת מסגרות האלגינג מוצגים באיור 1. במחקר זה, הוכח כי על כימוס ב קילוף פלסטיצידיות, התאים בקפסולות קילוף פלסטיצידיות אושרו על ידי דימות שדה בהיר (איור 2a). חי-מת בחני בוצעו על התאים בתוך הקפסולות, הוכחת 90% הכדאיות שלאחר כימוס (איור 2b). כדי להבטיח הכדאיות ארוכת טווח של התאים בתוך קפסולות, קפסולות היו מומס נתרן ציטראט ותאים היו אז מצופה מחדש (איור 2C). לאחר אישור בניסויים עצמאיים כי התאים היציבים ARPE-19 ביטא ומופרש הביולוגי כי היה רצוי14, ולאחר הקמת הפרמטרים עבור תאים encapsulating בבטחה, קפסולות הופקו להזרקה התוך-עינית.
זריקות intravitreal לתוך העין של העכבר דורש שימוש 27 G בוטה מחט עצה (הקוטר הפנימי של 210 μm) ומערכת המסירה מדויקת כדי להזריק בעקביות את הנפח הנדרש קטן של 1 μL. גודל קפסולות שלא נפגעו במהלך הפליטה דרך המחט 27 גרם אושרה על ידי מיקרוסקופ (איור 2A). זוהתה גודל אופטימלי של 150 יקרומטר. הזרקה בוצעה תחת בדיקה חזותית, אשר אפשרה ויזואליזציה של קפסולות ב-אינדקטור (איור 4a). כמו כן, הדמיה OCT התבצע, אשר אישר כי רוב הקפסולות בחדר הווירני של העכבר היו שלמים עם כמויות קטנות יחסית של פסולת (איור 4B). במהלך הטיפול שפורסמו, היה אישור כי הביולוגי הרצוי היה נוכח בתוך העין במינון רלוונטי מבחינה רפואית, מעכב את תהליך המחלה תחת חקירה14. תוצאות אלה אישרו כי תאים באנקפסולציה ניתן בבטחה להיות מוזרק לתוך עיני העכבר למסירה ארוכת טווח של מוצרים ביולוגיים.
איור 1: מכשירים לעיבוד כימוס. ההגדרה כוללת (a) מזרק 3 מ ל, (ב) 0.2 יקרומטר מסננים, (ג) A 30 G, 1/2 בגודל אינץ מחט בוטה, (ד) מזרק אלקטרונית נהג, (E) גנרטור מתח גבוה, (F) את המערכת הגדרת, ו (G) מרחק קבוע 7 מ"מ בין קצה המחט ומשטח הפתרון ג'לי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עטיפת תא. (A) מיקרוקפסולות מלאותבתאים arpe 19. (ב) חיים/שיטת המתים: צבע פלורסנט אדום מציין תאים מתים, ו [B] צבע פלורסנט ירוק מצביע על תאים חיים. (ג) תאים מתורבתים לאחר התאוששות ממיקרוקפסולות החל באשכול קטן הצומח לשטף. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרת כירורגית. מיקרוסקופ מבתר (1) עם מצלמת וידאו (2) משמש להמחיש את ההליך. העכבר הוא שקל (3) כדי לנהל את הכמות המתאימה של הרדמה והניח על פלטפורמה קטנה (4) כדי להקל על הטיפול וההזרקה. העיניים מורחבים עם mydriatics אטרופין ו פניליפפרין (5) ומוחזקים בשמן עם חומר סיכה (6). חור המדריך מנוקב ממש מחוץ לימבוס באמצעות מחט מספר 26 (7). מזרק זכוכית (8), טעון עם כמוסות מדולל כראוי (9), ממוקם בזווית 45 ° לעין העכבר מתקדם דרך חור המדריך, באמצעות מיקרומניפולציה (10). מסלול המחט, כמו גם כמוסות להשתחרר יכול להיות דמיינו [(11); ראה איור 4]. עם הנסיגה של המחט, הקרנית לחלח עם hypromellose אבד (12) ו משחה אנטיביוטית (13) להחיל על האתר ההזרקה כדי למנוע זיהום. בעקבות ההליך, העכבר ימוקם על כרית חימום 37 ° c ובמעקב עד הערה לגמרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: טכנולוגיית תאים כדורית לאספקת ARPE-19 לתוך העין. (א) זריקות מתבצעות באמצעות מחט בוטה 27 גרם המצורפת מזרק המילטון. מסלול המחט יכול להיות לאחר קצה המחט נכנס לעין, הימנעות העדשה ואת קפסולות (ראש חץ) יכול להיות דמיינו, מוגדל על ידי המערכת האופטית של עין העכבר. יש לציין כי ההשתקפות המעגלית של מקור האור. (ב) קפסולות (ראש חץ) ניתן לתמונה ב אינדקטור באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית. סרגלי קנה מידה = 200 μm. לוח B הודפס מראש באישור אננמאלאי ואח '14אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת עטיפת התאים הזאת מהירה וקלה יחסית לביצוע; עם זאת, יש לזכור נקודות מסוימות כדי להשיג תוצאות מדויקות של הזרם. יש לשמור על התאים בתרבות בצלחת פטרי לפני כימוס ומוחזק בשטף מתאים. כימוס יש לבצע במכסה אוורור נאות עם זרימת אוויר מוסדר, אם אפשר. חזק מדי של זרם אוויר יכול להשפיע על היווצרות כמוסה, במיוחד בניסויים ארוכי טווח. כלים ופתרונות סטריליים הם קריטיים לתחזוקה ארוכת טווח של תאים בתוך הקפסולה.
כיום, חי מת מכתים משמש ככלי confirmatory כדי לקבוע את הכדאיות של תאים בתוך הקפסולות. מספר התאים לכל כמוסה ותחת התנאי הנוכחי (כלומר, בדרך כלל 12 – 20 תאים לכל קפסולה) נקבעים גם הם באופן חזותי. הכדאיות של כל אצוות של אצוות תאים כדורית מפוקחת על-ידי שיטה זו. כדי לקבוע עוד יותר את הכדאיות של התאים, תאים שעברו אנקפסולציה מומסים ומתורבתים מחדש. זה עוד ממחיש את הכדאיות ואת היושרה של תאים בתוך כמוסות, אימות עטיפת הסלולר מוצלחת.
הפרמטרים המשמשים לעטיפת מעבר תאית הוקמו עבור סוג תא מסוים זה. הפרמטרים האמור לעיל הם אלה המשמשים את עטיפת התאים של ARPE 19 עבור ניסויים אלה. שיעור זרימה, ריכוז קילוף פלסטיצידיות, מתח מוחל, ציפוי משני של קפסולות הם כל המשתנים שניתן לכוונן לשימוש המתאים של קפסולות. כמו כן, כמות הקפסולות הנדרשות לניסוי נתון, צריכה להיקבע באופן אמפירי או מבוסס על ה-PK/PD הידוע של התכשירים הרפואיים. חשוב תמיד לבצע ניסויים שליטה הולמים, הוספת כמוסות ריקות כדי לשלוט על נוכחות של קפסולות וקפסולות נטען עם התאים ARPE-19 מנוכר לשלוט על הנוכחות של גורמים מופרש. Arpe-19 תאים יכולים גם להיות מנוכר באופן מצומצם עם פלבאמצע שליטה, כנוכחות של מספר קטן של קפסולות ב-אינדקטור קטן של העכבר (< 10 μl) מופיע כדי לשנות את הפיזיולוגיה הרגילה של העין. בהקשר זה, חשוב לדעת את סוד התאים apre-19 תחת תנאי אנקפסולציה (כמו גם בנוכחות של אינדקטור במצב מחלה מסוים), כמו החלבונים המופרשים עלול להפריע ליעילות הביולוגי תחת חקירה.
לבסוף, טכניקה זו יושמה כדי לספק הוכחה-העיקרון למסירה ארוכת טווח של מעכבי משלימים לטיפול ב-AMD וכלה לשפר את השיטה הנוכחית של זריקות ממשיות14. בשלב הנוכחי של פיתוח, מעכבי המשלים מוזרק לתוך הvitreous, בדרך כלל באמצעות זריקות חודשיות. זה כולל הזרקה של הגורם המשלים D חסימת מנורת הנוגדן18, אשר נכשלו בניסוי קליני שלב III כדי להפחית את ההתקדמות של ניוון גיאוגרפי, או את הגורם המשלים 3 apl מעכב-219, אשר כרגע בשלב III ניסוי קליני.
הזרקה החיסון הוא הקשה על ידי תופעות לוואי של ההזרקה עצמה (כלומר, הסיכון של התנתקות רשתית, עלייה בלחץ התוך-עיני, העין המרה, וכו '). בנוסף, רמות התרופה ישתנו באופן משמעותי במהלך החודש על הזריקות החודשיות האמיתי, ותגובות ריבאונד עשוי להיות צפוי. כחלופה, אסטרטגיות ריפוי גנטי מפותחים, כגון CD59 מסיסים המשלים20, אשר נמצא כרגע בשלב I הניסוי הקליני. תאים כמוסות גם מאפשרים את הייצור המתמשך של ביולוגי לפרקי זמן ארוכים וניתן להפסיק אותו (כלומר, הסבר של הקפסולה), במידת הצורך.
עד היום, בדקנו רק לייצור ביולוגי במהלך ~ 6 שבועות14. יצוין כי השיטה המתוארת כאן צריכה לשמש רק להוכחת עיקרון במודלים של בעלי חיים ולא לשימוש בחולים, כמו קפסולות קילוף פלסטיצידיות אינם יציבים מספיק כדי למנוע לחלוטין גריסה במהלך ההזרקה והם לא צפויים להימשך יותר מכמה שבועות. לעומת זאת, מכשיר מוצק כמו זה שפותח על ידי החברה יכול להימשך שנים21 כדי לספק את הגורמים הדרושים22,23,24. בנוסף, טכניקה חדשה זו יכולה גם להיות משולבת עם משלוח תרופות כימוע. בסך הכל, צפוי כי שדה זה המתעוררים להתפתח במהירות כאסטרטגיה חלופית עבור זריקות חוזרות של therapeutics של ריפוי גנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחקר היה נתמך בחלק על ידי מענקים הוענק B. R. על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01EY019320), המחלקה לענייני ותיקי (RX000444 ו BX003050), ואת הקרן דרום קרוליינה SmartState.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
- Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817 (2014).
- Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
- Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
- Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
- Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
- Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
- Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
- Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
- Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
- Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455 (2012).
- Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).
- Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313 (2007).
- Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
- Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
- Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).
- Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290 (2013).
- Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
- Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
- Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
