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Bioengineering

माउस आई को जीवविज्ञान के वितरण के लिए समझाया सेल प्रौद्योगिकी

Published: March 30, 2020 doi: 10.3791/60162
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2,3,4
1Department of Cell Biology, University of South Carolina, 2Department of Ophthalmology, Division of Research, Medical University of South Carolina, 3Department of Neuroscience, Division of Research, Medical University of South Carolina, 4Division of Research, Ralph H. Johnson VA Medical Center

Summary

यहां प्रस्तुत कृंतक आंखों के लिए जीवविज्ञान के दीर्घकालिक वितरण के लिए अमर कोशिकाओं के माइक्रोएनकैप्सुलेशन में एक बहुलक के रूप में एल्गिनेट के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल है।

Abstract

आंख के पीछे के ध्रुव के रोगों के लिए विकास के तहत कई वर्तमान चिकित्सा जीव विज्ञान हैं। इन दवाओं को अक्सर प्रशासित करने की आवश्यकता होती है, आमतौर पर इंट्राविटरियल इंजेक्शन के माध्यम से। पसंद के जीवविज्ञान को व्यक्त करने वाली समझाया कोशिकाएं स्थानीय प्रोटीन उत्पादन और रिहाई (उदाहरण के लिए, दीर्घकालिक दवा वितरण के माध्यम से) के लिए एक उपकरण बन रही हैं। इसके अलावा, एन्कैप्सुलेशन सिस्टम सामर्य सामग्रियों का उपयोग करते हैं जो कोशिकाओं के अंदर और बाहर पोषक तत्वों, अपशिष्ट और चिकित्सीय कारकों के प्रसार की अनुमति देते हैं। यह मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से कोशिकाओं को मास्किंग करते समय होता है, मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के दमन की आवश्यकता से बचता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोएनकैप्सुलेशन तकनीक के रूप में इलेक्ट्रोस्प्रे विधि के साथ मिलकर माइक्रोएनकैप्सुलेशन में एक बहुलक के रूप में एल्गिनेट के उपयोग का वर्णन करता है। ARPE-19 कोशिकाओं, एक अनायास उत्पन्न मानव RPE सेल लाइन, दीर्घकालिक सेल चिकित्सा प्रयोगों में अपनी आजीवन कार्यक्षमता के कारण इस्तेमाल किया गया है, और यह यहां encapsulation और माउस आंखों के लिए कैप्सूल की डिलीवरी के लिए प्रयोग किया जाता है । पांडुलिपि सेल माइक्रोएनकैप्सुलेशन, गुणवत्ता नियंत्रण और नेत्र वितरण के चरणों का सारांश देता है।

Introduction

सेल-आधारित उपचार क्रांतिकारी जैविक तकनीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्हें चिकित्सा में व्यापक रूप से लागू किया गया है। हाल ही में उन्हें न्यूरोडीजेनेरेटिव डिजीज, आंखों की बीमारियों और कैंसर के इलाज में सफलतापूर्वक लगाया गया है । सेल उपचार सेल प्रतिस्थापन से दवा वितरण के लिए क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर, और इस प्रोटोकॉल बाद पर केंद्रित है । बायोडिग्रेडेबल एल्गिनेट माइक्रोकैप्सूल (एमसी) ने डिलीवरी सिस्टम के रूप में प्रभावशीलता दिखाई है, और वे बायोमेडिकल क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किए जा रहे हैं। अल्जिनेट का उपयोग माइक्रोएनकैप्सुलेशन में इसकी सरल जेलिंग प्रक्रिया, बायोडिग्रेडेबिलिटी, उत्कृष्ट जैव अनुकूलता और वीवो स्थितियों1,,2,,3,,4में स्थिरता के कारण किया गया है।

माइक्रोएनकैप्सुलेशन तकनीक के रूप में इलेक्ट्रोस्प्रे विधि का सफलतापूर्वक उपयोग एल्गिनेट (बेस पॉलिमर) और पॉली-एल-ऑर्निथिन (सेकेंडरी कोटिंग पॉलिमर) का उपयोग करके पेप्टाइड्स और प्रोटीन को समझाने के लिए किया गया है। दोनों पॉलिमर स्वाभाविक रूप से पाए जाते हैं और उनकी जैव अनुकूलता5,6,7के लिए उपयोग की जाती है । हालांकि, सेल आधारित उपचारों में मुख्य चुनौती इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के कारण दुष्प्रभावों से बचने के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली का दमन है। एल्गिनेट माइक्रोकैप्सूल की स्थायित्व को सेल एनकैप्सुलेशन के लिए एक उपयुक्त संपत्ति माना जाता है, जो कोशिकाओं के साथ और बाहर पोषक तत्वों, अपशिष्ट और चिकित्सीय कारकों के प्रसार की अनुमति देता है, जबकि उन्हें मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8,,9,,10से मास्किंग करता है।

आंखमें, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा या उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन के उपचार के लिए जीवविज्ञान (यानी, विकास कारक11,,12 और विकास कारक विरोधी13)के निरंतर वितरण के लिए नैदानिक परीक्षणों में एन्कैप्ड कोशिकाओं का उपयोग किया गया है। पूरक अवरोधक14 जैसे अन्य लक्ष्यों को भी वर्तमान में प्रीक्लिनिकल सेटिंग्स में खोजा जा रहा है।

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Protocol

सभी प्रयोगों नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान के अनुसार किया गया और प्रोटोकॉल आईडी ००३९९ के तहत दक्षिण कैरोलिना पशु देखभाल और उपयोग समिति के चिकित्सा विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. सेल कल्चर

  1. मानव रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं (एआरपीई-19) कोशिकाओं को प्रकाशित प्रोटोकॉल14,15के अनुसार पसंद के जीन को व्यक्त करते हुए उत्पन्न करें।
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में कोशिकाओं को बनाए रखें।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें ।
  4. हर 2-3 दिन में मीडियम को बदलें।
  5. मानक ऊतक संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग करके 70% -80% संगम तक पहुंचने के बाद कोशिकाओं को पारित करें।

2. सेल एनकैप्सुलेशन

  1. 2% w/v की अंतिम एकाग्रता के लिए डिओनाइज्ड (डीआई) पानी के साथ सोडियम एल्गिनेट मिलाएं और 0.2 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा शुद्ध करें।
  2. कोशिकाओं को ट्राइप्सिनाइज, सेंट्रलाइजकर के एल्गिनेट समाधान के साथ मिश्रित करने के लिए तैयार करें, और उन्हें 10 mM HEPES बफर लवपीस समाधान (पीएच = 7.4) के साथ धोएं। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, कोशिकाओं की गणना करें और अल्जिनेट समाधान में अंतिम सेल एकाग्रता को 1 x 106 में समायोजित करें।
    नोट: एन्कैप्सुलेशन प्रक्रिया को एक निष्फल हुड के अंदर चलाया जाना चाहिए।
  3. एल्गिनेट और कोशिकाओं के मिश्रण के ~ 300 माइक्रोन एलिकोस को 3 मिलीग्राम सिरिंज में लोड करें और इसे सिरिंज पंप से संलग्न करें। समाधान एक 30 जी कुंद टिप सुई के माध्यम से एक बाँझ जेलिंग स्नान करने के लिए पंप किया जाएगा एक सुई के लिए 7 मिमी पर सिरिंज टिप के नीचे एक बाँझ ५० mL बीकर में रखा एक सुई छिड़काव दूरी स्नान करने के लिए ।
  4. जेलिंग बाथ में 10 एमएम हेप्स बफर्ड नमकीन की मात्रा होती है जिसमें 100 मीटर कैल्शियम क्लोराइड (सीएसीएल2)और 0.5% डब्ल्यू/वी पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीईओ) होते हैं। पीएलओ एक द्वितीयक बहुलक कोटिंग है जिसे अन्वेषक की जरूरतों के अनुसार छोड़ा या बदला जा सकता है।
  5. वोल्टेज और प्रवाह दर को समायोजित करें और उन्हें 60 मिमी/घंटा प्रवाह दर पर एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया के दौरान स्थिर रखें और ~ 150 माइक्रोन के माइक्रोकैप्सूल आकार का उत्पादन करने के लिए 6.0 केवी प्रारंभिक वोल्टेज।
  6. एक उच्च वोल्टेज जनरेटर सुई टिप के एनोड तार (लाल) की क्लिप सुई से कनेक्ट करें और जमीन क्लिप (काले) को तांबे के तार से कनेक्ट करें जो जेलिंग बाथ में आधे रास्ते में डूबा हुआ है। अल्जिनेट + सेल मिश्रण (1 mL) का एक बैच लगभग 30 मिन लेता है समझाया कोशिकाओं (लगभग 25,000 माइक्रोकैप्सूल) तैयार करने के लिए।
  7. वाशिंग समाधान (10 एमएम हेप्स बफर नमकीन जिसमें 1.5 mM CaCl2,पीएच = 7.4) दो बार युक्त कोशिकाओं वाले गठित माइक्रोकैप्सूल धोएं। धोने के लिए पीबीएस का उपयोग न करें।
  8. 10% एफबीएस के साथ समझाया कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में डीएमईएम मीडिया की खुराक।
    नोट: एन्कैप्सुलेशन प्रोसेस इंस्ट्रूमेंट्स को फिगर 1में दर्शाया गया है ।

3. पुष्टि है कि Encapsulation सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है

  1. मीडिया में 24 घंटे के लिए समझाया कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करने के बाद, धुंधला करने के लिए 500 माइक्रोन (~ 30 माइक्रोकैप्सूल) का एक छोटा सा नमूना तैयार करें।
  2. वाशिंग सॉल्यूशन (10 एमएम हेप्स बफरेड लवलाइन जिसमें 1.5 mM CaCl2)का उपयोग करके माइक्रोकैप्सूल 2x को धोएं और लाइव/डेड परख किट का उपयोग करके उन्हें लाइव-डेड व्यवहार्यता के लिए दाग दें।
  3. क्रमशः 2 माइक्रोन और 4 माइक्रोन की अंतिम सांद्रता पर कैल्सिन एएम (एसीटोक्सिमेथाइल) और एटिडिडियम होमोडिमर-1 का एक धुंधला मिश्रण तैयार करें।
  4. समझाया कोशिकाओं के लिए धुंधला मिश्रण के 2 mL जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर अंधेरे में 30-45 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
  5. सावधान आकांक्षा के साथ, धुंधला समाधान aspirate और धोने के समाधान के साथ माइक्रोकैप्सूल 2x धोने। समझाया कोशिकाओं का निरीक्षण और छवि के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करें।
    नोट: कॉन्फिडेक्शनका डॉक्यूमेंटेशन फिगर 2 में दर्शाया गया है ।

4. पुष्टि है कि कैप्सूल वितरण और जीवविज्ञान के वितरण के लिए उपयुक्त आकार रहे है

  1. माउस आई में इंट्राविटरियल इंजेक्शन आमतौर पर 2.5 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज से जुड़े 27 ग्राम कुंद-टिप सुई (210 माइक्रोन का आंतरिक व्यास) के साथ किया जाता है।
  2. 100 से 200 माइक्रोन तक कैप्सूल उत्पन्न करें, उन्हें सीरम-मुक्त मीडिया में पतला करें, और ध्यान से उन्हें हैमिल्टन सिरिंज में खींचें। पीबीएस एक उपयुक्त वाहन नहीं है, क्योंकि एल्गिनेट कैप्सूल पीबीएस में भंग हो जाएंगे।
  3. धीरे-धीरे एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कैप्सूल युक्त 1 μL बूंदों को बाहर निकालें और एक ईमानदार उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उनकी अखंडता का निर्धारण करें।
  4. तदनुसार वोल्टेज और प्रवाह दर को समायोजित करके कैप्सूल आकार (चरण 2.3 देखें) को समायोजित करें। छोटे माइक्रोकैप्सूल वोल्टेज बढ़ाने और प्रवाह दर8में थोड़ा कम करके एक nonlinear फैशन में उत्पादित कर रहे हैं । हमारे हाथों में, व्यास में 150 माइक्रोन के कैप्सूल सबसे उपयुक्त साबित हुए। कैप्सूल आकार का समायोजन अन्य मापदंडों को बदलते समय अल्जीनेट एकाग्रता को स्थिर रखने पर भी निर्भर करता है।
  5. वांछित जीवविज्ञान के स्राव की मात्रा निर्धारित करने के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में उपयुक्त आकार के कैप्सूल में कोशिकाओं का एक अलग सेट बनाए रखें। सुपरनेटेंट में जीवविज्ञान की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए संवेदनशील एलिज़ या पश्चिमी दाग का उपयोग करें।
  6. कैप्सूल की आवश्यक मात्रा निर्धारित करें जिन्हें चिकित्सीय के ज्ञात पीके/पीडी (फार्माकोकिनेटिक्स/फार्माकोडायनामिक्स) के आधार पर इंजेक्ट किए जाने की आवश्यकता होती है। हमारे हाथों में, माउस आंख प्रति 10 कैप्सूल सबसे प्रभावशाली साबित हुए।

5. माउस विट्रियस में कैप्सूल डिलीवरी

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करइंट्राविटरियल इंजेक्शन प्रदर्शन करें। प्रक्रिया के दौरान उपयोग की जाने वाली सर्जिकल सेट-अप और सामग्री के लिए चित्रा 3 देखें। 16 कहीं और इंट्रेक्सियस इंजेक्शन16के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पाया जा सकता है ।
  2. विशिष्ट संस्था की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित जाइलाज़ीन और केटामाइन (20 मिलीग्राम/किलोग्राम और 80 मिलीग्राम/किलो) या अन्य पसंदीदा एनेस्थेटिक्स के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें। एक अंगूठे चुटकी17का उपयोग कर संज्ञाहरण की उचित गहराई सुनिश्चित करें ।
  3. फेनिलेफ्रीन एचसीएल (2.5%) के साथ माउस विद्यार्थियों को फैलाना और एट्रोपाइन सल्फेट (1%) विट्रियस कक्ष की अच्छी दृश्यता के लिए अनुमति देने के लिए और प्रक्रिया के दौरान उन्हें हाइड्रेटेड रखने के लिए आंखों पर एक स्नेहक आंख जेल लागू करें।
  4. गाइड छेद के रूप में एक 26 जी सुई के साथ लिम्बस पर sclera पंचर, सुनिश्चित करें कि 1) सुई आंख और मेज और 2 के साथ एक ४५ डिग्री कोण पर है) beveled टिप ऊपर की ओर इशारा किया है लेंस पंचर से बचने के लिए ।
  5. ध्यान से एक 27 जी कुंद टिप दृश्य निरीक्षण के तहत एक ४५ ° कोण पर एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग कर कैप्सूल सुई सुई, सुई के साथ लेंस को छूने से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है । लेंस की चोट मोतियाबिंद के गठन का कारण बनेगी। कैप्सूल विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्र4A)का उपयोग करके विट्रियस में दिखाई देने चाहिए।
  6. सुई को पीछे हटाने के बाद इंजेक्शन साइट को डैक्सेथेसोन नेत्र एंटीबायोटिक मलहम के अलावा एंटीबायोटिक मलहम नियोमाइसिन और पॉलीमाइक्सिन बी सल्फेट के साथ इलाज करें।
  7. गोनियोटेयर हाइप्रोमेलोस डिमुलसेंट नेत्र समाधान (2.5%) दोनों आंखों के लिए वसूली अवधि के दौरान बाहर सुखाने से कॉर्निया को रोकने के लिए ।
  8. माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित एक हीटिंग पैड पर रखें और पूरी तरह से जागने तक मॉनिटर करें।
  9. समझाया ARPE-19 कोशिकाओं का एक सफल इंजेक्शन माउस के vitreous कक्ष में बरकरार कैप्सूल की उपस्थिति को प्रकट करना चाहिए मलबे की केवल मामूली मात्रा के साथ जब ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी या अन्य तरीकों(चित्रा 4B)द्वारा आंख इमेजिंग ।
  10. इंजेक्शन माउस आंख, सर्जरी के कारण वसूली के कुछ दिनों के बाद, अब हाथ में प्रयोगात्मक प्रतिमान के लिए तैयार है ।
    नोट: आंखों में कैप्सूल के सर्जिकल सेट-अप और प्रलेखन को क्रमशः चित्रा 3 और चित्रा 4में चित्रित किया गया है।

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Representative Results

एआरपीई-19 कोशिकाएं एक अनायास अमर मानव आरपीई सेल लाइन हैं जिन्हें आंखों में कैप्सूल के प्रत्यारोपण पर समझाने और दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए उत्तरदायी दिखाया गया है। अल्जिनेट एनकैप्सुलेशन के लिए उपकरण चित्रा 1में दिखाए गए हैं । इस अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया था कि अल्जीनेट में एन्कैप्सुलेशन पर, अल्गिनेट कैप्सूल में कोशिकाओं की पुष्टि उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग(चित्रा 2A)द्वारा की गई थी। कैप्सूल के अंदर कोशिकाओं पर लाइव-डेड परखों का प्रदर्शन किया गया, जो 90% व्यवहार्यता पोस्ट-एनकैप्सुलेशन(चित्रा 2B)का प्रदर्शन करता है। कैप्सूल के अंदर कोशिकाओं की दीर्घकालिक व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, कैप्सूल सोडियम साइट्रेट में भंग हो गए थे और कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया गया(चित्रा 2C)। स्वतंत्र प्रयोगों में पुष्टि करने के बाद कि स्थिर ट्रांससंक्रमित एआरपीई-19 कोशिकाओं ने14वांछित जीवविज्ञान को व्यक्त किया और स्रावित किया, और सुरक्षित रूप से एन्कैप्सलिंग कोशिकाओं के लिए मापदंडों की स्थापना के बाद, इंट्राओकुलर इंजेक्शन के लिए कैप्सूल का उत्पादन किया गया।

माउस आंख में इंट्राविटरियल इंजेक्शन के लिए 27 ग्राम कुंद-टिप सुई (210 माइक्रोन का आंतरिक व्यास) और सटीक वितरण प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता होती है ताकि 1 माइक्रोन की आवश्यक छोटी मात्रा को लगातार इंजेक्ट किया जा सके। 27 जी सुई के माध्यम से इंजेक्शन के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं हुए कैप्सूल के आकार की पुष्टि माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2ए)द्वारा की गई थी। 150 माइक्रोन के इष्टतम आकार की पहचान की गई थी। इंट्राविटरियल इंजेक्शन दृश्य निरीक्षण के तहत किया गया था, जिसने विट्रियस(चित्र4A)में कैप्सूल के दृश्य की अनुमति दी थी। इसी तरह, अक्टूबर इमेजिंग किया गया था, जिसने पुष्टि की कि माउस के विट्रेस चैंबर में अधिकांश कैप्सूल मलबे की अपेक्षाकृत मामूली मात्रा(चित्रा 4B)के साथ बरकरार थे। अनुवर्ती प्रकाशित प्रयोगों में, यह पुष्टि की गई कि वांछित जीवविज्ञान चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खुराक ों पर आंख में मौजूद था, जांच14के तहत रोग प्रक्रिया को बाधित करता था। इन परिणामों ने पुष्टि की कि समझाया कोशिकाओं को सुरक्षित रूप से जीवविज्ञान के दीर्घकालिक वितरण के लिए माउस आंखों में इंजेक्ट किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया उपकरण। सेट-अप में(ए)एक 3 मिलीग्राम सिरिंज,(बी)0.2 माइक्रोन फिल्टर,(C)एक 30 जी, 1/2 इंच कुंद-टिप सुई,(डी)एक इलेक्ट्रॉनिक सिरिंज चालक,(ई)एक उच्च वोल्टेज जनरेटर,(एफ)सिस्टम सेट-अप, और(जी)सुई टिप और गेलिंग समाधान सतह के बीच 7 मिमी तय दूरी शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल एनकैप्सुलेशन। (A)एआरपीई 19 कोशिकाओं से भरे माइक्रोकैप्सूल। (ख)लाइव/डेड परख: [एक] लाल फ्लोरोसेंट रंग मृत कोशिकाओं को इंगित करता है, और [ख] हरे फ्लोरोसेंट रंग जीवित कोशिकाओं को इंगित करता है । (ग)माइक्रोकैप्सूल से वसूली के बाद सुसंस्कृत कोशिकाएं एक छोटे क्लस्टर से शुरू होती हैं जो प्रवाह के लिए बढ़ती हैं । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सर्जिकल सेट-अप। एक वीडियो कैमरा (2) के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (1) प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । माउस (3) को एनेस्थेटिक की उचित मात्रा का प्रशासन करने के लिए तौला जाता है और हैंडलिंग और इंजेक्शन को कम करने के लिए एक छोटे मंच (4) पर रखा जाता है। आंखें माइड्रिटिक्स एट्रोपाइन और फेनिलेपिनेफ्रोरिन (5) के साथ फैली हुई हैं और उन्हें स्नेहक (6) के साथ हाइड्रेटेड रखा जाता है। एक गाइड छेद सिर्फ एक 26 जी सुई (7) का उपयोग कर लिम्बस के बाहर पंचर है । ग्लास सिरिंज (8), उचित रूप से पतला कैप्सूल (9) से भरा हुआ, माउस आंख के लिए 45 डिग्री कोण पर रखा जाता है और एक माइक्रोजोड़क (10) का उपयोग करके गाइड छेद के माध्यम से उन्नत होता है। सुई ट्रैक के साथ-साथ जारी किए जा रहे कैप्सूल की कल्पना की जा सकती है [(11); देखें चित्रा 4]। सुई के पीछे हटने पर कॉर्निया को संक्रमण से बचने के लिए इंजेक्शन साइट पर लगाए गए हाइप्रोमेलोज (12) और एंटीबायोटिक मरहम (13) के साथ गीला किया जाता है । प्रक्रिया के बाद, माउस को 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर रखा जाएगा और पूरी तरह से जागने तक निगरानी की जाएगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आंख में ARPE-19 देने के लिए समझाया सेल प्रौद्योगिकी । (ए)इंजेक्शन एक कुंद 27 जी एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी सुई का उपयोग कर किया जाता है । सुई ट्रैक का पालन किया जा सकता है क्योंकि सुई की नोक आंख में प्रवेश करती है, लेंस से बचने और कैप्सूल (एरोहेड) को माउस आंख के ऑप्टिकल सिस्टम द्वारा बढ़ाया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रकाश स्रोत का परिपत्र प्रतिबिंब। (ख)कैप्सूल (एरोहेड) ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग करके विट्रियस में चित्रित किया जा सकता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन पैनल बी को अन्नामलाई एट अल से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट किया गया था।14इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह सेल एन्कैप्सुलेशन तकनीक अपेक्षाकृत त्वरित और प्रदर्शन करने में आसान है; हालांकि, सटीक डाउनस्ट्रीम परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। कोशिकाओं को संगति से पहले पेट्री डिश में संस्कृति में बनाए रखा जाना चाहिए और उचित प्रवाह पर आयोजित किया जाना चाहिए । यदि संभव हो तो विनियमित वायु प्रवाह के साथ उचित वेंटिलेशन हुड में एनकैप्सुलेशन किया जाना चाहिए। हवा के वर्तमान के बहुत मजबूत कैप्सूल गठन को प्रभावित कर सकते हैं, विशेष रूप से दीर्घकालिक प्रयोगों में। कैप्सूल के भीतर कोशिकाओं के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए बाँझ बर्तन और समाधान महत्वपूर्ण हैं।

वर्तमान में, कैप्सूल के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए लाइव-डेड धुंधला का उपयोग एक पुष्टित्मक उपकरण के रूप में किया जाता है। प्रति कैप्सूल कोशिकाओं की संख्या और वर्तमान स्थिति (यानी, सामान्य रूप से प्रति कैप्सूल 12-20 कोशिकाएं) भी नेत्रहीन निर्धारित की जाती हैं। समझाया सेल बैचों के प्रत्येक बैच की व्यवहार्यता इस विधि द्वारा निगरानी की जाती है। कोशिकाओं की व्यवहार्यता को और निर्धारित करने के लिए, समझाया कोशिकाओं को भंग और फिर से संस्कारित किया जाता है। यह आगे कैप्सूल के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता और अखंडता को दर्शाता है, सफल सेलुलर एनकैप्सुलेशन को मान्य करता है।

सेलुलर एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस विशेष सेल प्रकार के लिए स्थापित किए गए हैं। ऊपर बताए गए पैरामीटर इन प्रयोगों के लिए एआरपी 19 कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाते हैं। प्रवाह दर, अल्जीनेट एकाग्रता, वोल्टेज लागू, और कैप्सूल की माध्यमिक कोटिंग सभी चर हैं जिन्हें कैप्सूल के उचित उपयोग के लिए समायोजित किया जा सकता है। इसी तरह, किसी दिए गए प्रयोग के लिए आवश्यक कैप्सूल की मात्रा को या तो अनुभवजन्य या जीवविज्ञान के ज्ञात पीके/पीडी के आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता है । गुप्त कारकों की उपस्थिति के लिए नियंत्रित करने के लिए अनट्रांससंक्रमित एआरपीई-19 कोशिकाओं से भरे कैप्सूल और कैप्सूल की उपस्थिति के लिए नियंत्रण करने के लिए हमेशा उचित नियंत्रण प्रयोग करना महत्वपूर्ण है। एआरपीई-19 कोशिकाओं को नियंत्रण प्लाज्मिड से भी स्थिर रूप से ट्रांस्रीड किया जा सकता है, क्योंकि माउस (<10 μL) के छोटे विट्रेस में भी थोड़ी संख्या में कैप्सूल की उपस्थिति आंख के सामान्य शरीर विज्ञान को बदलने के लिए प्रकट होती है। इस संदर्भ में, एनकैप्सुलेशन स्थितियों के तहत APRE-19 कोशिकाओं के स्राव को जानना महत्वपूर्ण है (साथ ही साथ किसी विशेष रोग की स्थिति में विट्रेस की उपस्थिति में), क्योंकि स्रावित प्रोटीन जांच के तहत जीवविज्ञान की प्रभावकारिता में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

अंत में, एएमडी के उपचार के लिए पूरक अवरोधकों के दीर्घकालिक वितरण के लिए और इंट्राविट्रियल इंजेक्शन14की वर्तमान विधि में सुधार करने के लिए इस तकनीक को सिद्धांत के प्रमाण प्रदान करने के लिए लागू किया गया था। विकास के वर्तमान चरण में, पूरक अवरोधकों को आमतौर पर मासिक इंजेक्शन का उपयोग करके विट्रस में इंजेक्ट किया जाता है। इसमें पूरक कारक डी अवरुद्ध एंटीबॉडी लैम्पालिज़ुमाब18का इंजेक्शन शामिल है, जो भौगोलिक शोष की प्रगति को कम करने के लिए एक चरण III नैदानिक परीक्षण में विफल रहा, या पूरक कारक 3 अवरोधक एपीएल-219,जो वर्तमान में एक चरण III नैदानिक परीक्षण में है।

इंट्राविटरियल इंजेक्शन इंजेक्शन के दुष्प्रभावों से ही बाधित होता है (यानी, रेटिना टुकड़ी का खतरा, इंट्राओकुलर प्रेशर में वृद्धि, एंडोथैल्माइटिस, आदि)। इसके अलावा, मासिक इंट्राविट्रियल इंजेक्शन पर महीने के दौरान दवा का स्तर काफी भिन्न होगा, और खुशहाली लौटने लगी प्रतिक्रियाओं की उम्मीद की जा सकती है। एक विकल्प के रूप में, जीन थेरेपी रणनीतियों को विकसित किया जा रहा है, जैसे घुलनशील सीडी59 पूरक अवरोधक20,जो वर्तमान में एक चरण में है जो मैं नैदानिक परीक्षण है। समझाया कोशिकाओं को भी समय की विस्तारित अवधि के लिए एक जीव विज्ञान के निरंतर उत्पादन के लिए अनुमति देते है और समाप्त किया जा सकता है (यानी, कैप्सूल के रोपण), यदि आवश्यक हो ।

आज तक, हमने केवल ~ 6 सप्ताह14के पाठ्यक्रम पर जीवविज्ञान के उत्पादन के लिए परीक्षण किया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां वर्णित विधि का उपयोग केवल पशु मॉडलों में सबूत-सिद्धांत के लिए किया जाना चाहिए न कि रोगियों में उपयोग के लिए, क्योंकि एल्गिनेट कैप्सूल इंजेक्शन के दौरान श्रेडिंग को पूरी तरह से रोकने के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर नहीं हैं और कुछ हफ्तों से अधिक समय तक चलने की उम्मीद नहीं है। इसके विपरीत, न्यूरोटेक द्वारा विकसित एक ठोस उपकरण22,23,,24आवश्यक कारकों को वितरित करने के लिए21 वर्षों तक चल सकता है।, इसके अलावा इस नई तकनीक को एनकैप्सुलेटेड ड्रग डिलिवरी के साथ भी जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, यह उम्मीद की जाती है कि यह उभरते क्षेत्र जीन थेरेपी के चिकित्सा विज्ञान के बार-बार इंजेक्शन के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में तेजी से विकसित होगा।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

अध्ययन के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01EY019320), दिग्गजों मामलों के विभाग (RX000444 और BX003050), और दक्षिण कैरोलिना SmartState बंदोबस्ती द्वारा बी आर को संमानित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe BD 309656
30 G 1" Blunt needle SAI Infusion technology B30-100
Alginic acid sodium salt, from brown algae Sigma A0682
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) Akorn NDC 17478-215-15 for pupil dilation
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) Becton, Dickinson and Company DG518105 500029609 REF 309625 to generate the guide hole
Calcium chloride, Anhydrous, granular Sigma C1016
GenTeal Tears Alcon NDC 0078-0429-47 to lubricate the eyes during anesthesia
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) Altaire Pharmaceuticals Inc. NDC 59390-182-13 to lubricate the eyes during anesthesia
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK Hamilton 7803-01 for intravitreal delivery of capsules
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately Hamilton 7632-01 for intravitreal delivery of capsules
HEPES buffer, 1 M Fisher Bioreagents BP299100
High voltage generator ESD EMC Technology ES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher Scientific L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99% Alfa Aesar A12111
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment SANDOZ NDC 61314-631-36 antibiotic to prevent infection after intravitreal injection
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) Akorn NDC 17478-201-15 for pupil dilation
Sodium Chloride Sigma S-5886
Sterile syringe filters, 0.2 μm VWR 28143-312
Syringe pump GRASEBY MS16A

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 157 समझाया सेल प्रौद्योगिकी ARPE-19 कोशिकाओं अल्जीनेट कैप्सूल दवा वितरण इंट्राओकुलर जीवविज्ञान
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Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons,… More

Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons, N., Shuler, A., Potts, J., Rohrer, B. Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (157), e60162, doi:10.3791/60162 (2020).

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