Summary
Presentato qui è un protocollo per l'uso dell'alginato come polimero nel microincapsulamento di cellule immortalate per la consegna a lungo termine di biologici agli occhi dei roditori.
Abstract
Molte terapie attuali in fase di sviluppo per le malattie del polo posteriore dell'occhio sono biologiche. Questi farmaci devono essere somministrati frequentemente, in genere tramite iniezioni intravitrali. Le cellule incapsulate che esprimono il biologico di scelta stanno diventando uno strumento per la produzione e il rilascio di proteine locali (ad esempio, tramite la somministrazione di farmaci a lungo termine). Inoltre, i sistemi di incapsulamento utilizzano materiali permeabili che consentono la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule. Ciò si verifica mentre si mascherano le cellule dalla risposta immunitaria dell'ospite, evitando la necessità di soppressione del sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo descrive l'uso dell'algerino come polimero nel microincapsulamento accoppiato con il metodo elettrospray come tecnica di microincapsulazione. Le cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana che nasce spontaneamente, è stata utilizzata in esperimenti di terapia cellulare a lungo termine a causa della sua funzionalità di durata, ed è usato qui per incapsulare e consegnare le capsule agli occhi del topo. Il manoscritto riassume i passaggi per la microincapsulazione cellulare, il controllo qualità e la consegna oculare.
Introduction
Le terapie basate sulle cellule rappresentano tecniche biologiche rivoluzionarie che sono state ampiamente applicate in medicina. Recentemente, sono stati applicati con successo nel trattamento di malattie neurodegenerative, malattie degli occhi, e il cancro. Le terapie cellulari coprono un'ampia gamma di campi, dalla sostituzione cellulare alla somministrazione di farmaci, e questo protocollo si concentra su quest'ultimo. Le microcapsule alginate biodegradabili (MC) hanno dimostrato l'efficacia come sistema di somministrazione e stanno diventando ampiamente utilizzate in campo biomedico. Alginato è stato utilizzato in microincapsulazione grazie al suo semplice processo di gelling, biodegradabilità, eccellente biocompatibilità e stabilità in condizioni in vivo41,2,3.
Il metodo dell'elettrospray, come tecnica di microincapsulamento, è stato utilizzato con successo per incapsulare peptidi e proteine utilizzando algerino (polimero di base) e poli-l-ornitina (polimero di rivestimento secondario). Entrambi i polimeri sono naturalmente trovati e utilizzati per la loro biocompatibilità5,6,7. Tuttavia, la sfida principale nelle terapie basate sulle cellule è la soppressione del sistema immunitario dell'ospite per evitare effetti collaterali causati da farmaci immunosoppressori. La permeabilità delle microcapsule algonate è considerata una proprietà adatta per l'incapsulamento cellulare, che consente la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule mascherandoli dalla risposta immunitaria dell'ospite8,9,10.
Nell'occhio, le cellule incapsulate sono state utilizzate negli studi clinici per la consegna costante di biologici (cioè fattori di crescita11,12 e antagonisti fattore di crescita13) per il trattamento della retinite pigmentosa o degenerazione maculare legata all'età. Altri obiettivi come gli inibitori del complemento14 sono attualmente in fase di esplorazione in ambienti preclinici.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca ophtalmic e Vision e sono stati approvati dalla Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee sotto il protocollo ID 00399.
1. Cultura cellulare
- Generare cellule epiteliali del pigmento reticolare umano (ARPE-19) linea cellulare esprimendo stabilmente il gene di scelta secondo i protocolli pubblicati14,15.
- Mantenere le cellule nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS).
- Incubare le cellule a 37 e 5% di CO2.
- Sostituire il supporto ogni 2-3 giorni.
- Passare le cellule dopo aver raggiunto 70%-80% confluenza utilizzando le procedure di coltura tissutale standard.
2. Incapsulamento delle celle
- Mescolare l'alginato di sodio con l'acqua deionizzata (DI) per una concentrazione finale del 2% w/v e purificare per filtrazione con un filtro di siringa sterile da 0,2 m.
- Preparare le cellule da mescolare con la soluzione alginata prostrando, centrifugandole e lavandole con una soluzione salina tamponata da 10 mM HEPES (pH - 7,4). Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare finale a 1 x 106 in soluzione alginata.
NOT: Il processo di incapsulamento deve essere eseguito all'interno di un cappuccio sterilizzato. - Caricare 300 aliquote di alginato e miscela di cellule in una siringa da 3 mL e attaccarla a una pompa di siringa. La soluzione sarà pompata attraverso un ago da 30 G con punta smussata in un bagno sterile in gelling posto in uno sterile becher 50 mL sotto la punta della siringa a 7 mm per un ago per il bagno distanza di spruzzatura.
- Il bagno gelling contiene un volume di 40 mL di 10 mM HEPES tampinato su saliera contenente 100 mM di cloruro di calcio (CaCl2) e 0,5% w/v poly-L-ornithine (PLO). L'OLP è un rivestimento polimerico secondario che può essere omesso o modificato in base alle esigenze dello sperimentatore.
- Regolare la tensione e la portata e mantenerle entrambe costanti durante il processo di incapsulamento a una portata di 60 mm/h e una tensione iniziale di 6,0 kV per produrre microcapsule di 150 m.
- Collegare la clip di filo anodo (rosso) di una punta dell'ago generatore ad alta tensione all'ago e collegare la clip di terra (nero) al filo di rame che è a metà strada immersa nel bagno gelling. Un lotto della miscela algerata : miscela cellulare (1 mL) impiega circa 30 min per preparare le cellule incapsulate (circa 25.000 microcapsule).
- Lavare due volte le microcapsule formate contenenti cellule con soluzione di lavaggio (10 mM HEPES salina tamponata contenente 1,5 mM CaCl2, pH - 7,4). Non utilizzare PBS per il lavaggio.
- Incubare le cellule incapsulate con il 10% di supporti DMEM integrati FBS in un'incubatrice umidificata a 37 e 5% di CO2.
NOT: Gli strumenti di processo di incapsulamento sono illustrati nella Figura 1.
3. Conferma che l'incapsulamento non influisce sulla vitalità delle celle
- Dopo aver incubato le cellule incapsulate per 24 h nei supporti, preparare un piccolo campione di 500 l (30 capsule da 30 dollari) per la colorazione.
- Lavare le microcapsule 2x utilizzando una soluzione di lavaggio (10 mM HEPES tamponata su una salina contenente 1,5 mM CaCl2) e macchiarle per la vitalità morta utilizzando un kit di analisi vivo/morto.
- Preparare una miscela di colorazione di calceina AM (acetoxymethyl) ed ethidium homodimer-1 a concentrazioni finali di 2 m e 4 M, rispettivamente.
- Aggiungere 2 mL della miscela di colorazione alle cellule incapsulate e incubare per 30-45 min al buio a temperatura ambiente (RT).
- Con attenta aspirazione, aspirare la soluzione di colorazione e lavare le microcapsule 2x con la soluzione di lavaggio. Utilizzare un sistema di microscopio fluorescente per osservare e immaginare le cellule incapsulate.
NOT: La documentazione dell'incapsulamento è illustrata nella Figura 2.
4. Conferma che le capsule sono della dimensione appropriata per la consegna e la consegna del biologico
- Le iniezioni intravitrali nell'occhio di un topo vengono in genere eseguite con un ago da 27 G con la punta smussata (diametro interno di 210 m) attaccato a una siringa Hamilton da 2,5 luna.
- Generare capsule che vanno da 100 a 200 m, diluirle in supporti senza siero e tirarle con cura nella siringa Hamilton. PBS non è un veicolo adatto, in quanto le capsule altnate si dissolveranno in PBS.
- Espelle lentamente 1 goccia di llà contenenti capsule su un vetrino al microscopio e determinarne l'integrità utilizzando un microscopio verticale a campo luminoso.
- Regolare le dimensioni della capsula (vedere il punto 2.3) regolando di conseguenza la tensione e la portata. Le microcapsule più piccole sono prodotte in modo non lineare aumentando la tensione e riducendo leggermente la portata8. Nelle nostre mani, capsule di 150 m di diametro si sono rivelate le più adatte. La regolazione della dimensione della capsula dipende anche dal mantenere costante la concentrazione di alginato modificando gli altri parametri.
- Mantenere un set separato di cellule in capsule della dimensione appropriata nel mezzo senza siero per determinare la quantità di secrezione del biologico desiderato. Utilizzare ELAISA sensibili o gonfiazioni occidentali per determinare la concentrazione dei biologici nel supernatante.
- Determinare la quantità necessaria di capsule che devono essere iniettate in base alla NOTa PK/PD (farmacocinetica/farmacodinamica) della terapia. Nelle nostre mani, 10 capsule per occhio di topo dimostrato di essere più efficace.
5. Consegna di capsule nel mouse Vitreous
- Eseguire iniezioni intravitriche utilizzando un microscopio dissezioso. Vedere la figura 3 per la configurazione chirurgica e i materiali utilizzati durante la procedura. Un protocollo dettagliato per iniezioni intravitreous può essere trovato altrove16.
- Anestetizza i topi mediante iniezione intraperitoneale di xilosina e ketamina (20 mg/kg e 80 mg/kg) o altri anestetici preferiti approvati dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituto specifico. Assicurarsi la profondità appropriata di anestesia utilizzando un pizzicodi 17.
- Dilatare le pupille di topo con fenilefrina HCL (2,5%) e solfato di atropina (1%) per consentire una buona visibilità della camera vitrea e applicare un gel per gli occhi lubrificante agli occhi per mantenerli idratati durante la procedura.
- Puntura della sclera al limbo con un ago da 26 G come foro guida, assicurandosi che 1) l'ago sia ad un angolo di 45 gradi con l'occhio e il tavolo e 2) la punta smussata è rivolta verso l'alto per evitare di forare la lente.
- Inietta con attenzione le capsule usando un ago da 27 G con punta smussata attaccato a una siringa Hamilton con un angolo di 45 gradi sotto ispezione visiva, assicurandoti di evitare di toccare l'obiettivo con l'ago. La lesione della lente porterà alla formazione della cataratta. Le capsule devono essere visibili nel vitreous utilizzando il microscopio dissettante (Figura 4A).
- Dopo la retrazione dell'ago, trattare il sito di iniezione con unguenti antibiotici neomicina e solfati di polimyssina B oltre all'unguento antibiotico oftalmico dexamethasone.
- Applicare la soluzione oftalmica goniotaire demulcente (2,5%) ad entrambi gli occhi per evitare che le cornee si asciughino durante il periodo di recupero.
- Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento tenuto a 37 gradi centigradi e monitorare fino a quando non è completamente sveglio.
- Un'iniezione di successo di cellule ARPE-19 incapsulate dovrebbe rivelare la presenza di capsule intatte nella camera vitrea del topo con solo piccole quantità di detriti quando si immagina l'occhio con tomografia a coerenza ottica o altri metodi (Figura 4B).
- L'occhio del topo iniettato, dopo alcuni giorni di recupero a causa dell'intervento chirurgico, è ora pronto per il paradigma sperimentale a portata di mano.
NOT: L'impostazione chirurgica e la documentazione delle capsule nell'occhio sono illustrati rispettivamente nella Figura 3 e Figura 4.
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Representative Results
Le cellule ARPE-19 sono una linea cellulare UMANA RPE immortalata spontaneamente che ha dimostrato di essere suscettibile di incapsulamento e sopravvivenza a lungo termine dopo l'impianto di capsule nell'occhio. Gli strumenti per l'incapsulamento algerato sono illustrati nella Figura 1. In questo studio, è stato dimostrato che dopo l'incapsulamento in algerino, le cellule in capsule altnate sono state confermate da immagini a campo luminoso (Figura 2A). I saggi morti vivi sono stati eseguiti sulle cellule all'interno delle capsule, dimostrando il 90% di fattibilità post-incapsulamento (Figura 2B). Per garantire la vitalità a lungo termine delle cellule all'interno delle capsule, le capsule sono state sciolte nel citrato di sodio e le cellule sono state poi ri-placcate (Figura 2C). Dopo aver confermato in esperimenti indipendenti che le cellule ARPE-19 trasfette stabili esprimevano e secernevano il biologico che desiderava14, e dopo aver stabilito i parametri per l'incapsulamento sicuro delle cellule, sono state prodotte capsule per l'iniezione intraoculare.
Le iniezioni intravitrali nell'occhio del topo richiedono l'uso di un ago da 27 G con punta smussata (diametro interno di 210 m) e un sistema di somministrazione accurato per iniettare costantemente il piccolo volume richiesto di 1 l. La dimensione delle capsule che non sono state danneggiate durante l'espulsione attraverso l'ago da 27 G è stata confermata dalla microscopia (Figura 2A). È stata identificata una dimensione ottimale di 150 m. L'iniezione intravitreale è stata eseguita sotto ispezione visiva, che ha permesso la visualizzazione di capsule nel vitreous (Figura 4A). Allo stesso modo, è stata eseguita l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office, che ha confermato che la maggior parte delle capsule nella camera vitrea del mouse erano intatte con quantità relativamente minori di detriti (Figura 4B). Negli esperimenti successivi pubblicati, è stato confermato che il biologico desiderato era presente nell'occhio a dosi terapeutiche rilevanti, inibendo il processo della malattia nell'ambito dell'indagine14. Questi risultati hanno confermato che le cellule incapsulate possono essere iniettate in modo sicuro negli occhi del topo per la consegna a lungo termine di biologici.
Figura 1: Strumenti di processo di incapsulamento. Il set-up comprende (A) una siringa da 3 mL, (B) 0,2 filtri, (C) un ago da 30 G, 1/2 pollice con punta smussata, (D) un driver di siringa elettronica, (E) un generatore ad alta tensione, (F) il set-up del sistema e (G) una distanza di 7 mm fissa fissata tra la punta dell'ago e la superficie della soluzione di gelling. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Incapsulamento delle celle. (A) Microcapsule riempite con cellule ARPE 19. (B) Saggio vivo/morto: [a] il colore fluorescente rosso indica le cellule morte, e il colore fluorescente verde indica le cellule vive. (C) Cellule coltivate dopo il recupero da microcapsule che iniziano con un piccolo cluster che cresce fino alla confluenza. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Set-up chirurgico. Per visualizzare la procedura viene utilizzato un microscopio sezionato (1) con videocamera (2). Il topo viene pesato (3) per somministrare la quantità appropriata di anestetico e posto su una piccola piattaforma (4) per facilitare la manipolazione e l'iniezione. Gli occhi sono dilatati con atropina midriastica e fenilefrina (5) e sono tenuti idratati con lubrificante (6). Un foro guida viene forato appena fuori dal limbo utilizzando un ago da 26 G (7). La siringa di vetro (8), caricata con capsule opportunamente diluite (9), viene posizionata ad un angolo di 45 gradi rispetto all'occhio del topo e avanzata attraverso il foro guida, utilizzando un micromanipolatore (10). La traccia dell'ago e le capsule rilasciate possono essere visualizzate [(11); vedere Figura 4]. Dopo la retrazione dell'ago, la cornea viene inumidita con ipromelsico (12) e unguento antibiotico (13) applicato al sito di iniezione per evitare l'infezione. Seguendo la procedura, il mouse sarà posizionato su una pastiglia di riscaldamento a 37 gradi centigradi e monitorato fino a quando non è completamente sveglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tecnologia cellulare incapsulata per fornire ARPE-19 nell'occhio. (A) Le iniezioni vengono eseguite utilizzando un ago smussato da 27 G attaccato a una siringa Hamilton. La traccia dell'ago può essere seguita quando la punta dell'ago entra nell'occhio, evitando l'obiettivo e le capsule (punta di freccia) possono essere visualizzate, ingrandite dal sistema ottico dell'occhio del mouse. Va notato che il riflesso circolare della sorgente luminosa. (B) Le capsule (freccia) possono essere immagini nella vitrea tomografia a coerenza ottica. Barre di scala - 200 m. Il pannello B è stato ristampato con il permesso di Annamalai etal.
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Discussion
Questa tecnica di incapsulamento delle cellule è relativamente veloce e facile da eseguire; tuttavia, per ottenere risultati accurati a valle, è necessario tenere presenti alcuni punti. Le cellule devono essere mantenute in coltura in un piatto Petri prima dell'incapsulamento e tenute a giusta confluenza. L'incapsulamento deve essere eseguito in una corretta cappa di ventilazione con flusso d'aria regolato, se possibile. Troppo forte di una corrente d'aria può influenzare la formazione di capsule, soprattutto negli esperimenti a lungo termine. Utensili sterili e soluzioni sono fondamentali per il mantenimento a lungo termine delle cellule all'interno della capsula.
Attualmente, la colorazione vivi-morte viene utilizzata come strumento di conferma per determinare la vitalità delle cellule all'interno delle capsule. Il numero di cellule per capsula e sotto la condizione attuale (cioè, normalmente 12-20 cellule per capsula) sono anche determinati visivamente. La fattibilità di ogni batch di batch di celle incapsulate viene monitorata con questo metodo. Per determinare ulteriormente la vitalità delle cellule, le cellule incapsulate vengono dissolte e ri-coltivate. Questo dimostra ulteriormente la vitalità e l'integrità delle cellule all'interno delle capsule, convalidando l'incapsulamento cellulare di successo.
I parametri utilizzati per l'incapsulamento cellulare sono stati stabiliti per questo particolare tipo di cella. I parametri sopra indicati sono quelli utilizzati per l'incapsulamento delle cellule ARPE 19 per questi esperimenti. La portata, la concentrazione di alginato, la tensione applicata e il rivestimento secondario delle capsule sono tutte variabili che possono essere regolate per un uso appropriato delle capsule. Allo stesso modo, la quantità di capsule necessarie per un determinato esperimento deve essere determinata empiricamente o in base alla PK/PD nota dei biologici. È importante eseguire sempre esperimenti di controllo appropriati, aggiungendo capsule vuote per controllare la presenza delle capsule e capsule caricate con cellule ARPE-19 non trascurate per controllare la presenza di fattori secreti. Le cellule ARPE-19 possono anche essere sfettate in modo stabile con un plasmide di controllo, poiché la presenza anche di un piccolo numero di capsule nel piccolo vitreo del topo (<10 ) sembra alterare la fisiologia normale dell'occhio. In questo contesto, è importante conoscere il secretome delle cellule APRE-19 in condizioni di incapsulamento (così come in presenza di vitreoina in una particolare condizione di malattia), in quanto le proteine secrete possono interferire con l'efficacia del biologico in corso di studio.
Infine, questa tecnica è stata implementata per fornire la prova di principio per la consegna a lungo termine di inibitori del complemento per il trattamento di AMD e per migliorare l'attuale metodo di iniezioni intravitrali14. Allo stadio attuale di sviluppo, gli inibitori del complemento vengono iniettati nel vitreous, in genere utilizzando iniezioni mensili. Questo include l'iniezione del fattore di complemento D bloccante anticorpo lampalizumab18, che non è riuscito in uno studio clinico di fase III per ridurre la progressione dell'atrofia geografica, o il fattore di complemento 3 inibitore APL-219, che è attualmente in uno studio clinico di fase III.
L'iniezione intravitrale è ostacolata dagli effetti collaterali dell'iniezione stessa (ad esempio, rischio di distacco della retina, aumento della pressione intraoculare, endoframite, ecc.). Inoltre, i livelli di droga varieranno in modo significativo nel corso del mese su iniezioni intravitrale mensili, e possono essere previste reazioni di rimbalzo. In alternativa, sono in fase di sviluppo strategie di terapia genica, come l'inibitore del complemento CD59 solubile20, attualmente in una fase I sperimentazione clinica. Le cellule incapsulate consentono anche la produzione continua di un biologico per lunghi periodi di tempo e possono essere terminate (cioè, espiantazione della capsula), se necessario.
Ad oggi, abbiamo testato solo per la produzione di un biologico nel corso di 6 settimane14. Va notato che il metodo qui descritto dovrebbe essere utilizzato solo per proof-of-principle nei modelli animali e non per l'uso nei pazienti, in quanto le capsule altnate non sono sufficientemente stabili per prevenire completamente la triturazione durante l'iniezione e non dovrebbero durare più di un paio di settimane. Al contrario, un dispositivo solido come quello sviluppato da Neurotech può durare peranni 21 per fornire i fattori richiesti22,23,24. Inoltre, questa nuova tecnica può anche essere combinata con la somministrazione di farmaci incapsulati. Nel complesso, si prevede che questo campo emergente si svilupperà rapidamente come strategia alternativa per le ripetute iniezioni di terapie della terapia genica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate a B. R. dai National Institutes of Health (R01EY019320), dal Department of Veterans Affairs (RX000444 e BX003050) e dal South Carolina SmartState Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
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