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Bioengineering

Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Published: March 30, 2020 doi: 10.3791/60162

Summary

Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.

Abstract

Muitas terapêuticas atuais em desenvolvimento para doenças do pólo posterior do olho são biológicas. Estes medicamentos precisam ser administrados com freqüência, tipicamente através de injeções intravitreais. As células encapsuladas que expressam o biológico de escolha estão se tornando uma ferramenta para a produção e liberação de proteínas locais (por exemplo, via entrega de medicamentos a longo prazo). Além disso, os sistemas de encapsulamento utilizam materiais permeáveis que permitem a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células. Isso ocorre enquanto mascara as células da resposta imune do hospedeiro, evitando a necessidade de supressão do sistema imunológico hospedeiro. Este protocolo descreve o uso de alginato como um polímero em microencapsulamento juntamente com o método de eletrospray como uma técnica de microencapsulamento. As células ARPE-19, uma linha de células RPE humanas espontaneamente surgidas, tem sido usada em experimentos de terapia celular de longo prazo devido à sua funcionalidade de vida, e é usada aqui para encapsulamento e entrega das cápsulas aos olhos do rato. O manuscrito resume os passos para microencapsulamento celular, controle de qualidade e entrega ocular.

Introduction

As terapias baseadas em células representam técnicas biológicas revolucionárias que têm sido amplamente aplicadas na medicina. Recentemente, eles têm sido aplicados com sucesso no tratamento de doenças neurodegenerativas, doenças oculares e câncer. As terapias celulares abrangem uma ampla gama de campos, desde a substituição celular até a entrega de medicamentos, e este protocolo se concentra neste último. Microcápsulas de alginato biodegradável (MC) têm mostrado eficácia como um sistema de parto, e estão se tornando amplamente utilizadas no campo biomédico. O alginato tem sido utilizado na microencapsulação devido ao seu processo simples de gelagem, biodegradabilidade, excelente biocompatibilidade e estabilidade em condições in vivo1,2,3,4.

O método de eletrospray, como técnica de microencapsulamento, tem sido utilizado com sucesso para encapsular peptídeos e proteínas usando alginato (polímero base) e poli-l-ornithine (polímero de revestimento secundário). Ambos os polímeros são naturalmente encontrados e utilizados para sua biocompatibilidade5,6,7. No entanto, o principal desafio nas terapias de base celular é a supressão do sistema imunológico hospedeiro para evitar efeitos colaterais causados por drogas imunossupressoras. A permeabilidade das microcápsulas de alginato é considerada uma propriedade adequada para o encapsulamento celular, que permite a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células enquanto as mascara da resposta imune hospedeira8,,9,10.

No olho, as células encapsuladas têm sido utilizadas em ensaios clínicos para a entrega constante de biológicos (ou seja, fatores de crescimento11,12 e antagonistas do fator de crescimento13) para o tratamento da retinite pigmentosa ou degeneração macular relacionada à idade. Outros alvos, como inibidores complementares14, também estão sendo explorados em ambientes pré-clínicos.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul sob o protocolo ID 00399.

1. Cultura Celular

  1. Gerar células epiteliais de pigmento da retina humana (ARPE-19) expressando o gene de escolha de acordo com os protocolos publicados14,15.
  2. Manter células no Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS).
  3. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2.
  4. Substitua o meio a cada 2-3 dias.
  5. Passe as células depois de atingir 70%-80% de confluência usando procedimentos padrão de cultura tecidual.

2. Encapsulamento celular

  1. Misture alginato de sódio com água deionizada (DI) para uma concentração final de 2% w/v e purifique por filtração com um filtro de seringa estéril de 0,2 μm.
  2. Prepare as células para serem misturadas com a solução de alginato, tripsinizando, centrifugando e lavando-as com solução salina tamponada hepes de 10 mM (pH = 7,4). Usando um hemocitômetro, conte as células e ajuste a concentração celular final para 1 x 106 em solução alginato.
    NOTA: O processo de encapsulamento deve ser executado dentro de uma coifa esterilizada.
  3. Carregue ~300 μL de alíquotas de alginato e mistura de células em uma seringa de 3 mL e conecte-a a uma bomba de seringa. A solução será bombeada através de uma agulha de ponta cega de 30 G para um banho de gelagem estéril colocado em um béquer estéril de 50 mL abaixo da ponta da seringa a 7 mm para uma agulha para banho de distância de pulverização.
  4. O banho de gelagem contém um volume de 40 mL de 10 mM HEPES soro retalhado contendo 100 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) e 0,5% w/v poli-L-ornithine (PLO). A OLP é um revestimento de polímero secundário que pode ser omitido ou alterado de acordo com as necessidades do investigador.
  5. Ajuste a tensão e a vazão e mantenha-as constantes durante o processo de encapsulamento a 60 mm/h de vazão e 6,0 kV de tensão inicial para produzir microcápsulas do tamanho de ~150 μm.
  6. Conecte o clipe do fio de ânodo (vermelho) de uma ponta de agulha geradora de alta tensão à agulha e conecte o clipe de terra (preto) ao fio de cobre que está meio submerso no banho de gelagem. Um lote da mistura alginato + célula (1 mL) leva aproximadamente 30 min para preparar as células encapsuladas (aproximadamente 25.000 microcápsulas).
  7. Lave as microcápsulas formadas contendo células com solução de lavagem (10 mM HEPES soro lógico tampão contendo 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4) duas vezes. Não use PBS para lavar.
  8. Incubar as células encapsuladas com 10% de FBS suplementada mídia DMEM em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2.
    NOTA: Os instrumentos do processo de encapsulamento são retratados na Figura 1.

3. Confirmação de que o encapsulamento não afeta a viabilidade celular

  1. Depois de incubar as células encapsuladas por 24 h em mídia, prepare uma pequena amostra de 500 μL (~30 microcápsulas) para coloração.
  2. Lave as microcápsulas 2x usando a solução de lavagem (10 mM HEPES soro aspirado contendo 1,5 mM CaCl2) e manche-as para viabilidade viva-morta usando um kit de ensaio vivo/morto.
  3. Prepare uma mistura de coloração de calceina AM (acetoxymethyl) e etídio homodimer-1 em concentrações finais de 2 μM e 4 μM, respectivamente.
  4. Adicione 2 mL da mistura de coloração às células encapsuladas e incubar por 30-45 min no escuro à temperatura ambiente (RT).
  5. Com aspiração cuidadosa, apiratee a solução de coloração e lave as microcápsulas 2x com a solução de lavagem. Use um sistema de microscópio fluorescente para observar e visualizar as células encapsuladas.
    NOTA: A documentação do encapsulamento é retratada na Figura 2.

4. Confirmação de que as cápsulas são o tamanho apropriado para entrega e entrega da Biológica

  1. Injeções intravitreais em um olho de rato são tipicamente realizadas com uma agulha de ponta cega de 27 G (diâmetro interno de 210 μm) anexada a uma seringa Hamilton de 2,5 μL.
  2. Gerar cápsulas que variam de 100 a 200 μm, diluí-las em meios livres de soro e puxá-las cuidadosamente para dentro da seringa Hamilton. O PBS não é um veículo adequado, pois as cápsulas de alginato se dissolverão na PBS.
  3. Ejete lentamente gotas de 1 μL contendo cápsulas em um slide de microscópio e determine sua integridade usando um microscópio de campo brilhante vertical.
  4. Ajuste o tamanho da cápsula (ver passo 2.3) ajustando a tensão e a taxa de fluxo de acordo. Microcápsulas menores são produzidas de forma não linear, aumentando a tensão e diminuindo ligeiramente a taxa de fluxo8. Em nossas mãos, cápsulas de 150 μm de diâmetro mostraram-se mais adequadas. O ajuste do tamanho da cápsula também depende de manter a concentração de alginato constante enquanto altera os outros parâmetros.
  5. Mantenha um conjunto separado de células em cápsulas do tamanho apropriado em meio livre de soro para determinar a quantidade de secreção do biológico desejado. Use ELISAs sensíveis ou manchas ocidentais para determinar a concentração dos biológicos no sobrenadante.
  6. Determine a quantidade necessária de cápsulas que precisam ser injetadas com base no PK/PD conhecido (farmacocinética/farmacodinâmica) do terapêutico. Em nossas mãos, 10 cápsulas por olho de rato provaram ser mais eficazes.

5. Entrega de cápsulas em Mouse Vitreous

  1. Realize injeções intravitreais usando um microscópio dissecando. Consulte a Figura 3 para a configuração cirúrgica e os materiais utilizados durante o procedimento. Um protocolo detalhado para injeções intravitreous pode ser encontrado em outro lugar16.
  2. Anestesia camundongos por injeção intraperitoneal de xilazina e cetamina (20 mg/kg e 80 mg/kg) ou outros anestésicos preferidos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da instituição específica. Certifique-se de profundidade adequada da anestesia usando uma pitada de dedo do dedo17.
  3. Dilado as pupilas do camundongo com HCL de fenilefrina (2,5%) e sulfato de atropina (1%) para permitir uma boa visibilidade da câmara vítrea e aplicar um gel de olho lubrificante aos olhos para mantê-los hidratados durante o procedimento.
  4. Perfure o esclera no membro com uma agulha de 26 G como orifício guia, certificando-se de que 1) a agulha está em um ângulo de 45° com o olho e tabela e 2) a ponta chanfrada é apontada para cima para evitar perfurar a lente.
  5. Injete cuidadosamente as cápsulas usando uma agulha de ponta cega de 27 G presa a uma seringa Hamilton em um ângulo de 45° inspeção visual, certificando-se de evitar tocar a lente com a agulha. A lesão da lente levará à formação de catarata. As cápsulas devem ser visíveis no vítreo usando o microscópio dissecando(Figura 4A).
  6. Após a retração da agulha, trate o local da injeção com pomadas antibióticas neomicina e sulfato de polimicina B, além de pomada antiptológica oftalmológica de xamametasona.
  7. Aplicar solução oftálmica demulcentes goniotaire hypromellose (2,5%) para ambos os olhos para evitar que as córneas sequem durante o período de recuperação.
  8. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento mantida a 37°C e monitore até acordar completamente.
  9. Uma injeção bem sucedida de células ARPE-19 encapsuladas deve revelar a presença de cápsulas intactas na câmara vítrea do camundongo com apenas pequenas quantidades de detritos ao fazer a imagem do olho por tomografia de coerência óptica ou outros métodos(Figura 4B).
  10. O olho do rato injetado, após alguns dias de recuperação devido à cirurgia, agora está pronto para o paradigma experimental em mãos.
    NOTA: A configuração cirúrgica e a documentação das cápsulas no olho são retratadas na Figura 3 e Figura 4,respectivamente.

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Representative Results

As células ARPE-19 são uma linha celular rpe humana espontaneamente imortalizada que tem se mostrado passível de encapsulamento e sobrevivência a longo prazo após a implantação de cápsulas no olho. As ferramentas para encapsulamento de alginato são mostradas na Figura 1. Neste estudo, foi demonstrado que após o encapsulamento em alginato, as células em cápsulas de alginato foram confirmadas por imagem de campo brilhante(Figura 2A). Ensaios de mortos vivos foram realizados nas células dentro das cápsulas, demonstrando 90% de viabilidade pós-encapsulamento (Figura 2B). Para garantir a viabilidade a longo prazo das células dentro das cápsulas, as cápsulas foram dissolvidas em citrato de sódio e as células foram então rebanhadas(Figura 2C). Após a confirmação em experimentos independentes que as células ARPE-19 transfeccionadas estáveis expressaram e secretaram o biológico desejado14, e após o estabelecimento dos parâmetros para células encapsuladoras com segurança, foram produzidas cápsulas para injeção intraocular.

Injeções intravitreais no olho do rato requer o uso de uma agulha de ponta cega de 27 G (diâmetro interno de 210 μm) e sistema de entrega preciso para injetar consistentemente o pequeno volume necessário de 1 μL. O tamanho das cápsulas que não foram danificadas durante a ejeção através da agulha de 27 G foi confirmado por microscopia(Figura 2A). Foi identificado um tamanho ideal de 150 μm. A injeção intravitreal foi realizada inspeção visual, o que permitiu a visualização de cápsulas no vítreo(Figura 4A). Da mesma forma, foi realizada a imagem oct, que confirmou que a maioria das cápsulas na câmara vítrea do camundongo estavam intactas com quantidades relativamente pequenas de detritos(Figura 4B). No acompanhamento dos experimentos publicados, foi confirmado que o biológico desejado estava presente no olho em doses terapeuticamente relevantes, inibindo o processo da doença em investigação14. Esses resultados confirmaram que as células encapsuladas podem ser injetadas com segurança nos olhos do rato para a entrega a longo prazo de biológicos.

Figure 1
Figura 1: Instrumentos de processo de encapsulamento. A configuração inclui (A) uma seringa de 3 mL, (B) 0,2 μm filtros, (C) uma agulha de ponta cega de 30 G, 1/2 polegada, (D) um motorista de seringa eletrônica, (E) um gerador de alta tensão,(F) a configuração do sistema, e(G) uma distância fixa de 7 mm entre a ponta da agulha e a superfície da solução de gelagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Encapsulamento celular. (A) Microcápsulas preenchidas com células ARPE 19. (B) Ensaio vivo/morto: [a] cor fluorescente vermelha indica células mortas, e [b] cor fluorescente verde indica células vivas. (C) Células cultivadas após a recuperação de microcápsulas começando com um pequeno aglomerado crescendo para confluência. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuração cirúrgica. Um microscópio dissecando (1) com uma câmera de vídeo (2) é usado para visualizar o procedimento. O rato é pesado (3) para administrar a quantidade adequada de anestésico e colocado em uma pequena plataforma (4) para facilitar o manuseio e a injeção. Os olhos são dilatados com atropina midriática e fenilepinefrina (5) e são mantidos hidratados com lubrificante (6). Um orifício guia é perfurado fora do membro usando uma agulha de 26 G (7). A seringa de vidro (8), carregada com cápsulas diluídas apropriadamente (9), é colocada em um ângulo de 45° para o olho do rato e avançada através do orifício guia, usando um micromanipulador (10). A trilha da agulha, bem como as cápsulas que estão sendo liberadas podem ser visualizadas [(11); ver Figura 4]. Após a retração da agulha, a córnea é umedecida com hypromellose (12) e pomada antibiótica (13) aplicada no local da injeção para evitar infecção. Após o procedimento, o mouse será colocado em uma almofada de aquecimento de 37 °C e monitorado até que esteja totalmente acordado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Tecnologia de célula encapsulada para fornecer ARPE-19 no olho. (A)As injeções são realizadas usando uma agulha de 27 G cega anexada a uma seringa Hamilton. A trilha da agulha pode ser seguida à medida que a ponta da agulha entra no olho, evitando que a lente e as cápsulas (ponta de flecha) possam ser visualizadas, ampliadas pelo sistema óptico do olho do rato. Deve-se notar que o reflexo circular da fonte de luz. (B) As cápsulas (ponta de flecha) podem ser imagemdo no vítreo usando tomografia de coerência óptica. Barras de escala = 200 μm. O painel B foi reimpresso com permissão de Annamalai et al.14Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Esta técnica de encapsulamento celular é relativamente rápida e fácil de executar; no entanto, alguns pontos devem ser mantidos em mente para obter resultados precisos a jusante. As células devem ser mantidas na cultura em uma placa de Petri antes do encapsulamento e mantidas em confluência adequada. O encapsulamento deve ser realizado em uma capa de ventilação adequada com fluxo de ar regulado, se possível. Uma corrente de ar muito forte pode afetar a formação de cápsulas, especialmente em experimentos de longo prazo. Utensílios e soluções estéreis são fundamentais para a manutenção a longo prazo das células dentro da cápsula.

Atualmente, a coloração de mortos-vivos é usada como uma ferramenta confirmatória para determinar a viabilidade das células dentro das cápsulas. O número de células por cápsula e a condição atual (ou seja, normalmente 12-20 células por cápsula) também são visualmente determinados. A viabilidade de cada lote de lotes de células encapsuladas é monitorada por este método. Para determinar ainda mais a viabilidade das células, as células encapsuladas são dissolvidas e recultivadas. Isso demonstra ainda mais a viabilidade e integridade das células dentro das cápsulas, validando o encapsulamento celular bem sucedido.

Os parâmetros utilizados para o encapsulamento celular foram estabelecidos para este tipo de célula específica. Os parâmetros indicados acima são os utilizados para o encapsulamento de células ARPE 19 para esses experimentos. Taxa de fluxo, concentração de alginatos, tensão aplicada e revestimento secundário das cápsulas são variáveis que podem ser ajustadas para o uso adequado das cápsulas. Da mesma forma, a quantidade de cápsulas necessárias para um determinado experimento precisa ser determinada empiricamente ou com base no PK/PD conhecido dos biológicos. É importante sempre realizar experimentos de controle adequados, adicionando cápsulas vazias para controlar a presença das cápsulas e cápsulas carregadas com células ARPE-19 não transfeccionadas para controle para a presença de fatores secretos. As células ARPE-19 também podem ser transfeccionadas com um plasmídeo de controle, pois a presença de até mesmo um pequeno número de cápsulas no pequeno vítreo do camundongo (<10 μL) parece alterar a fisiologia normal do olho. Nesse contexto, é importante conhecer o secome das células APRE-19 em condições de encapsulamento (bem como na presença de vítreos em uma determinada condição da doença), pois as proteínas secretadas podem interferir na eficácia do biológico em investigação.

Finalmente, esta técnica foi implementada para fornecer prova de princípio para a entrega a longo prazo de inibidores complementares para o tratamento da DMA e para melhorar o método atual de injeções intravitreais14. No estágio atual de desenvolvimento, os inibidores complementares são injetados no vítreo, normalmente usando injeções mensais. Isso inclui a injeção do fator complementar D de bloqueio do anticorpo lampalizumab18, que falhou em um ensaio clínico fase III para reduzir a progressão da atrofia geográfica, ou o fator complementar 3 inibidor APL-219, que está atualmente em um ensaio clínico fase III.

A injeção intravitreal é dificultada pelos efeitos colaterais da própria injeção (ou seja, risco de descolamento da retina, aumento da pressão intraocular, endophthalmitis, etc.). Além disso, os níveis de medicamentos variarão significativamente ao longo do mês após injeções intravitreais mensais, e reações de recuperação podem ser esperadas. Como alternativa, estratégias de terapia genética estão sendo desenvolvidas, como o inibidor de complemento CD59 solúvel20, que está atualmente em um ensaio clínico de fase I. As células encapsuladas também permitem a produção contínua de um biológico por longos períodos de tempo e podem ser extintas (ou seja, explantá-lo da cápsula), se necessário.

Até o momento, só testamos para produção de um biológico ao longo de ~6 semanas14. Deve-se notar que o método descrito aqui só deve ser usado para prova de princípio em modelos animais e não para uso em pacientes, uma vez que as cápsulas de alginato não são suficientemente estáveis para evitar completamente a trituração durante a injeção e não devem durar mais do que algumas semanas. Em contrapartida, um dispositivo sólido como o desenvolvido pela Neurotech pode durar21 anos para entregar os fatores necessários22,23,24. Além disso, esta nova técnica também pode ser combinada com a entrega de drogas encapsuladas. No geral, espera-se que este campo emergente se desenvolva rapidamente como uma estratégia alternativa para injeções repetidas de terapêuticas da terapia genética.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O estudo foi apoiado, em parte, por subvenções concedidas a B. R. pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY019320), pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (RX000444 e BX003050) e pelo South Carolina SmartState Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe BD 309656
30 G 1" Blunt needle SAI Infusion technology B30-100
Alginic acid sodium salt, from brown algae Sigma A0682
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) Akorn NDC 17478-215-15 for pupil dilation
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) Becton, Dickinson and Company DG518105 500029609 REF 309625 to generate the guide hole
Calcium chloride, Anhydrous, granular Sigma C1016
GenTeal Tears Alcon NDC 0078-0429-47 to lubricate the eyes during anesthesia
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) Altaire Pharmaceuticals Inc. NDC 59390-182-13 to lubricate the eyes during anesthesia
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK Hamilton 7803-01 for intravitreal delivery of capsules
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately Hamilton 7632-01 for intravitreal delivery of capsules
HEPES buffer, 1 M Fisher Bioreagents BP299100
High voltage generator ESD EMC Technology ES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher Scientific L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99% Alfa Aesar A12111
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment SANDOZ NDC 61314-631-36 antibiotic to prevent infection after intravitreal injection
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) Akorn NDC 17478-201-15 for pupil dilation
Sodium Chloride Sigma S-5886
Sterile syringe filters, 0.2 μm VWR 28143-312
Syringe pump GRASEBY MS16A

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References

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Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons,More

Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons, N., Shuler, A., Potts, J., Rohrer, B. Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (157), e60162, doi:10.3791/60162 (2020).

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