Summary

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

Published: November 06, 2019
doi:

Summary

O objetivo deste estudo é estabelecer e validar um modelo animal para pesquisa nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral testando infarto cerebral e função sensóriomotor após oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) após 1-90 dias em ratos.

Abstract

O objetivo deste estudo foi estabelecer e validar um modelo de isquemia cerebral animal nos estágios de recuperação e sequela. Um modelo de oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) em ratos machos sprague-dawley foi escolhido. Ao alterar o peso do rato (260-330 g), o tipo de parafuso de linha (2636/2838/3040/3043) e o tempo de infarto cerebral (2-3 h), uma pontuação maior de Longa, um volume maior de infarto e uma maior relação de sucesso do modelo foram rastreados usando a pontuação da Longa e manchas ttc. A condição ideal do modelo (300 g, 3040 parafuso de linha, 3 h tempo de infarto cerebral) foi adquirida e utilizada em um período de observação de 1-90 dias após a refusão através da avaliação das funções sensório-motoras e volume infarto. Nestas condições, o teste bilateral da assimetria teve uma diferença significativa de 1 a 90 dias, e o teste grid-walking teve uma diferença significativa de 1 a 60 dias; ambas as diferenças podem ser um teste funcional sensorimotor adequado. Assim, a condição mais adequada de um novo modelo de rato nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral foi encontrada: 300 g de ratos que se submeteram ao MCAO com um parafuso de linha 3040 para um infarto cerebral de 3 h e depois reperfundido. Os testes funcionais sensorimotores apropriados foram um teste bilateral de assimetria e um teste de caminhada em grade.

Introduction

A isquemia cerebral é dividida em três etapas com diferentes indicadores pós-AVC: o estágio agudo (dentro de 1 semana), a fase de recuperação (1 semana a 6 meses) e a fase sequelae (mais de 6 meses). Atualmente, a maioria dos estudos se concentra no estágio agudo da isquemia cerebral por causa de seu efeito significativo e modelos de pesquisa multi-relativos1,2,3. No entanto, os estágios de recuperação e sequelas da isquemia cerebral não podem ser ignorados devido à sua complicação a longo prazo das deficiências. Portanto, o objetivo deste estudo é explorar um modelo animal estável, confiável e relativamente simples para pesquisar os estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral.

Entre os muitos modelos experimentais de isquemia cerebral, usamos oclusão da artéria cerebral média (MCAO) via inserção de parafuso de fio na artéria cerebral média direita (MCA). Este modelo é semelhante ao acidente vascular cerebral humano, que pode produzir maiores volumes de infarto, resultar em muitos distúrbios comportamentais relacionados ao acidente vascular cerebral, e pode permitir a refusão de sangue (R), removendo o parafuso de linha4,5,6. MCAO/R também é considerado o modelo animal padrão-ouro da isquemiacerebral 7. Além disso, a gravidade da lesão cerebral depende do diâmetro e do comprimento de inserção do parafuso de linha, a duração da isquemia cerebral e o peso animal (ratos maiores têm cérebros maiores e vasos cerebrais mais grossos)8. Portanto, alterando o tipo de parafuso de linha, o tempo infarto e o peso do rato, um modelo adequado pode ser encontrado para os estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral em ratos MCAO/R. Para validar o modelo de rato, realizamos um estudo de 1 dia, 35 dias, 60 dias e 90 dias do modelo MCAO/R usando experimentos de coloração TTC e função sensóriomotor (um teste bilateral de assimetria, um teste de caminhada em grade, um teste de rotarod e um teste de corda de elevação).

Protocol

O procedimento e o uso de indivíduos animais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório. Este protocolo é ajustado especificamente para os testes de oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) e função sensóriomotora. 1. Design experimental e agrupamento Use um modelo mcao/r de rato para rastrear um método de modelo isquêmico cerebral de rato com lesão cerebral mais grave e maior relação de sucesso do modelo …

Representative Results

Usando o procedimento acima mencionado para um modelo MCAO/R com escore de Longa e coloração TTC, diferentes tratamentos de peso médio (275/300/320 g), tipos de parafuso (2636/2838/3040/3043; Tabela 1) e os tempos isquêmicos (2-3 h) e a refusão de 1 dia foram usados para selecionar para o modelo óptimo da isquemia do cérebro nos ratos. Parâmetros de modelo de 300 g de peso, 3040 parafuso de linha e 3 h de tempo de infarto cerebral foram os mais adequados para o ma…

Discussion

Muitos modelos que estabelecem métodos e indicadores comportamentais que são bem utilizados na isquemia cerebral aguda podem não ter mudanças significativas nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral16,17. No entanto, o número de pacientes com isquêmico cerebral nos estágios de recuperação e sequela é o maior. É essencial selecionar um modelo animal adequado para os estágios de recuperação e sequela do acidente vascular cerebral d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81603315, 81603316), Key R & D plano da província de Jiangxi na China (20171ACH80001), projetos de cooperação industrial e acadêmica em faculdades e universidades da província de Fujian em China (2018Y41010011).

Materials

Anatomical Microscope Leica (Germany) S8 Microscopic operating instrument
Blade Gellette / Cutting brain sections
Constant Temperature Shaking Bed Taicang Experimental Equipment Factory THZ-C To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature
Digital Camera Canon 700D For taking pictures of TTC staining
Electric Shaver Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 3000# Removal of hair from the neck of rats
Forceps Hamostatic Shanghai Medical device Co., Ltd. 14 cm Using for brain removing
Image Pro Plus Software Media Cybernetics Inc. 6.0 Analyze the infarct volume
Isoflurane RWD Life Science 217170702 Anesthetic gas
Microforceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Microshear Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Vascular micromanipulation
Ophthalmic Forceps Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Auxiliary skin and muscle anatomy
Pphthalmic Scissors Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. 10 cm Using for cutting the skin of neck
Rat Brain Slice Mold Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. 400 g For standard, uniform cutting of brain tissue
Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. ZH-300B To test the sensorimotor function
Small Animal Anaesthesia Machine Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. ABM3000 A gas anesthetic machine
Small Animal Thermostat Beijing Damida Technology Co., Ltd. DM.7-YLS-20A To maintain animal body temperature constant during operation
Surgical Scissors Shanghai Medical device Co., Ltd. 16 cm Using for decapitate and brain removing
Suture Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. 4-0 / 5-0 Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations
Thread Bolt Beijing Cinontech Co. Ltd. 2636/2838/3040/3043-A4 Blockage of the middle cerebral artery in rats
5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) Sigma LOT#BCBP3272V Brain section staining reagent

References

  1. Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
  2. Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
  3. Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
  4. Kumar, A., Aakriti, V., Gupta, A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  5. Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
  6. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  7. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
  8. Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
  9. Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
  10. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  11. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
  12. Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
  13. Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
  14. DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
  15. Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
  16. Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
  17. Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).

Play Video

Cite This Article
Liu, P., Song, X., Yang, X., Cao, Q., Tang, Y., Liu, X., Yang, M., An, W., Dong, B., Song, X. A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats. J. Vis. Exp. (153), e60166, doi:10.3791/60166 (2019).

View Video