Summary
اجراء التجارب في المختبر للتفكير في الظروف المجرية باقصي قدر ممكن ليست مهمة سهله. استخدام ثقافات الخلايا الاوليه هو خطوه هامه نحو فهم بيولوجيا الخلية في كائن حي بأكمله. البروتوكول المنصوص عليه الخطوط العريضة كيفيه النمو بنجاح وثقافة الخلايا العصبية المخيخ الفئران الجنينية.
Abstract
أصبح استخدام ثقافات الخلايا الاوليه واحده من الاداات الرئيسية لدراسة الجهاز العصبي في المختبر. الهدف النهائي من استخدام هذا النظام نموذج مبسط هو توفير البيئة الدقيقة التي تسيطر عليها والحفاظ علي معدل البقاء علي قيد الحياة عاليه والسمات الطبيعية للخلايا العصبية وغير العصبية فصل قدر الإمكان تحت الظروف في المختبر. في هذه المقالة ، ونحن نظهر طريقه لعزل الخلايا العصبية الاساسيه من المخيخ الماوس النامية ، ووضعها في بيئة في المختبر ، وإنشاء نموها ، ورصد صلاحيتها والتمايز لعده أسابيع. ينطبق هذا الأسلوب علي الخلايا العصبية الجنينية التي تنفصل عن المخيخ بين الأيام الجنينية 12 – 18.
Introduction
لعده عقود ، وقد استخدمت خطوط الخلايا علي نطاق واسع كاداه عاليه الانتاجيه في الدراسات الاكلينيكيه والبحوث البيولوجية. الفعالية من حيث التكلفة ، والنمو السريع ، والحد من استخدام الحيوانية الحية هي بعض الفوائد من استخدام هذه الخلايا. ومع ذلك ، تتراكم التغييرات الجينية والتغيرات الظاهرية بعد عده مقاطع في المختبر1. يمكن ان يؤدي التعريف الخاطئ لخطوط الخلايا والتشابه الوراثي من الخلايا الاوليه إلى تجارب غير قابله للتكرار واستنتاجات زائفه2و3و4و5. ولذلك ، علي الرغم من بعض أوجه التشابه للخلايا المتمايزة مثل الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، الناقلات العصبية ، قنوات أيون ، مستقبلات ، وغيرها من البروتينات العصبية الخاصة) ، لا يمكن تكرار خطوط الخلايا العصبية النمط الظاهري الكامل للخلايا العصبية. استخدام الخلايا العصبية ناضجه هو خيار آخر. ومع ذلك ، هذه الخلايا غير تقسيم الخلايا للتفتل التي يصعب نشرها في الثقافة. وعلاوة علي ذلك, أعاده الدخول في دوره الخلية قد يعجل المبرمج6.
وقد تم تطوير ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) ، وثقافات الشريحة المجسمة ، والثقافات العضوية لتوفير بيئة يمكن فيها للخلايا ان ترتب في شكل ثلاثي الابعاد يحاكي الاعداد المجري. التالي ، يمكن دراسة الاتصال من خليه إلى خليه ، والهجرة ، وغزو الخلايا السرطانية في الانسجه المحيطة بها ، وتولد الاوعيه7. ومع ذلك ، فان التكاليف الاضافيه لاستخدام المصفوفات الخلوية الاضافيه (ECM) البروتينات أو الهلام المائي الاصطناعية كفراش ، وصعوبة في التصوير ، والتوافق مع أدوات الفحص عاليه الانتاجيه هي عيوب كبيره من الخلايا 3D الخياطة. ومن المساوئ الرئيسية للثقافة النسيجية شريحة النسيج هو استخدام عدد كبير من الكائنات والآثار السلبية للاستئصال ، مما يؤدي إلى عدم الوصول إلى الأهداف وعوامل النمو لaxotomy ، التالي وفاه الخلايا العصبية8.
ولذلك ، فان النهج البديل ، الذي يتجنب المشاكل مع خطوط الخلايا ، وصعوبة نمو الخلايا الناضجة ، وتعقيد الانسجه ، هو في نضج المختبر من الخلايا الاساسيه غير ناضجه. وتستمد الخلايا الاوليه مباشره من الانسجه البشرية أو الحيوانية وتنفصل باستخدام الانزيمات و/أو الطرق الميكانيكية9. المبادئ الرئيسية للعزل ، البذر ، والصيانة في الثقافة المتوسطة متشابهة بغض السواء عن مصدر الانسجه. ومع ذلك ، فان العوامل الغذائية اللازمة لتعزيز الانتشار والنضج هي خلايا محدده جدا6.
ان معرفه "تاريخ الميلاد" لكل نوع من أنواع الخلايا المخيخه شرط أساسي لتصميم تجربه الثقافة الاساسيه. بشكل عام ، والخلايا purkinje (أجهزه الكمبيوتر) والعصبية من نوى المخيخ (CN) ، يولدون قبل الخلايا الصغيرة ، بما في ذلك الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، سله ، والخلايا النجميه) والكريات الحبيبية. في الفئران ، تظهر أجهزه الكمبيوتر بين اليوم الجنيني (E) 10 – E13 ، في حين ان الخلايا العصبية CN في حوالي E9-E1210.
تولد الخلايا العصبية المخيخ الأخرى في وقت لاحق بكثير. علي سبيل المثال ، في الفئران ، يتم توليد السكان الفرعيين golgi من الخلايا العصبية من VZ في (~ E14 − E18) والتداخلات المتبقية (خليه سله والزنزانات النجميه) الموجودة في الطبقة الجزيئية الخروج من تقسيم خلايا السلف في المسالة البيضاء بين أوائل بعد الولادة (P) 0 – P711. يتم إنشاء الخلايا الحبيبية من المنطقة الجرثومية الخارجية (EGZ) ، وهي منطقه الإنبات الثانوية التي تستمد من الشفة المعينة اللحمية وتمر عبر تقسيم المحطة بعد الولادة. ولكن قبل ان تنشا سلائفها من الشفة المعينة من E13 – E16 ، فقد هاجرت الخلايا بالفعل علي طول سطح بيا لجعل طبقه رقيقه من الخلايا علي السطح الظهري لل anlage المخيخ. ولدت خلايا ماكروجليال غير العصبية مثل استروسيتيس و oligodendrocytes ، والتي تنشا من ظهاره عصبيه البطين ، في e 13.5 − P0 و P0 − P7 علي التوالي11،12،13،14 ،15. وتستمد الخلايا الصغيرة من الخلية البدائية للخلايا النخاعية من الصفار بين الساعة8 – 10وبعد الغزو إلى الجهاز العصبي المركزي يمكن الكشف عنها في دماغ الفار بواسطة E9 16.
وتستند الطريقة المعروضة في هذه المقالة علي واحد وضعت أصلا من قبل furuya et al. و tabata et al.17,18, الذي تم الأمثل للذبح الاوليه من الخلايا purkinje المستمدة من wistar الفئران المخيخ. لدينا الآن تكييف هذه الطريقة وتعديلها بعناية لدراسة نمو الخلايا العصبية الفئران المخيخ19. علي عكس في بروتوكولنا الجديد ، الباردة تشريح المتوسط هو المخزن المؤقت الغسيل الرئيسية المستخدمة خلال التشريح والتفكك الخطوات قبل أضافه البذر المتوسطة في البروتوكول Furuya في17. هذا العازل يفتقر إلى التغذية ، وعوامل النمو ، والهرمونات (كل ذلك في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 [DMEM/F12]) التي هي ضرورية لدعم نمو الخلايا والبقاء علي قيد الحياة خلال الخطوات المذكورة أعلاه. الاضافه إلى ذلك ، استنادا إلى خبرتنا الواسعة مع الثقافات المخيخ الاوليه murine ، وقد استخدمنا 500 μL من الوسط الثقافي في كل بئر (بدلا من 1 مل) وزيادة تركيز ثلاثي ايودوثيرونين إلى 0.5 ng/mL ، مما يحسن نمو الخلايا العصبية ، في خاصه تلك التي لديها النمط الظاهري الخلية Purkinje ، ويعزز النمو من فروع شجيري في الثقافة. الطريقة الرئيسية التي ظهرت في هذه المقالة يمكن تطبيقها علي نطاق واسع علي القوارض الصغيرة الأخرى (علي سبيل المثال ، السناجب والهامستر) اثناء النمو الجنيني ويمكن استخدامها لدراسة نشاه الأعصاب المخيخ والتمايز في المراحل الجنينية المختلفة ، والتي تختلف بين الأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح المؤسسية ودليل رعاية واستخدام الكائنات التجريبية من المجلس الكندي لرعاية الماشية ووافقت عليها السلطات المحلية ("الرعاية الحيوانية في الحرم الجامعي Bannatyne لجنه "). وبذلت جميع الجهود للتقليل إلى ادني حد من عدد الماشية المستخدمة ومعاناتها. وأكد العمق الكافي من التخدير من خلال ملاحظه انه لم يكن هناك اي تغيير في معدل التنفس المرتبطة بالتلاعب وقرصه اصبع القدم أو منعكس القرنية.
1-الاعداد
ملاحظه: جدوله توفير الفئران الحوامل موقوتة ، استنادا إلى خطه البحث ، لما بعد الحمل E12-E18. يعتمد اختيار التوقيت علي خصائص الخلية المطلوبة (انظر أدناه). اعداد كشوف الغلاف واللوحات قبل يومين علي الأقل من التجربة. يستخدم بولي-L-اورنيثين كماده طلاء لتعزيز مرفق الخلية إلى زلات الغطاء.
- معطف الغطاء ينزلق 2 أيام قبل عزل الخلية.
- ضعي الغطاء الدائري في طبق 24 جيدا ، تحت ظروف معقمه في خزانه السلامة الاحيائيه. ترك فجوه بين كل زلة غطاء لتجنب اي تلوث.
- أضافه 90 μL من بولي-L-اورنيثين (منظمه التحرير الفلسطينية ، 500 ميكروغرام/مل) إلى وسط كل زلة الغطاء. إغلاق الغطاء ووضع بلطف لوحه في 37 درجه مئوية/5 ٪ CO2 حاضنه لمده 2 أيام.
ملاحظه: قد تسرب حجم أكبر من كشوف الغلاف اثناء الحضانة. لا تحتاج قسيمة التغطية إلى تغطيه كامله مع منظمه التحرير الفلسطينية بعد وضع قطره. وخلال الحضانة الليلية ، توزع منظمه التحرير الفلسطينية بالتساوي علي حافه كشوف الغطاء.
- قبل يوم واحد من عزل الخلية ، واعداد المتوسطة الثقافة ط (DMEM/F-12 تحتوي علي بوتريمين 100 μM ، سيليريت الصوديوم 30 نانومتر ، L-الجلوتامين 3.9 mM ، جنتاميسين 3.5 ميكروغرام/مل ، ثلاثي يودوثيرونين (T3) 0.5 ng/mL ، وملاحق N3 [البروجسترون 4 μM ، الانسولين 20 ميكروغرام/مل ، ترانسفيرين 20 ملغ/مل]) والبذر المتوسطة (الثقافة المتوسطة I [بدون N3 و T3] التي تحتوي علي 10 ٪ مصل البقر الجنيني [المعرض]) وتخزينها في 4 درجه مئوية. اعداد الحل التريبسين العمل (0.25 ٪) في DMEM/F12 والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: يتم توفير التراكيب المتوسطة في الجدول 1. - في اليوم من خليه عزل, مكان ثقافة متوسطه [اي] وبذر متوسطه في الحاضنة في 37 [ك].
ملاحظه: قبل البدء في عزل المخيخ ، تاكد من ان جميع الاداات وأسطح العمل عقيمه. - أغطيه الغسيل.
- خذ الطبق 24 من الحاضنة
- اغسل الغطاء في الطبق الثالث والعشرين بالبئر مع الماء المقطر المزدوج (DDW) في خزانه السلامة الاحيائيه في ظل ظروف معقمه. في كل مره السماح للتغطية ينزلق نقع في DDW لمده 5 دقائق قبل البدء في الطموح.
- اترك الغطاء ينزلق في خزانه السلامة الاحيائيه لمده 2 ساعة علي الأقل حتى يجف تماما.
2. جمع المخيخ
- اعداد 3 10 سم معقمه البلاستيك بيتري الاطباق مليئه الجليد الباردة 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) ، 3 اطباق بيتري مليئه الجليد الباردة 1x محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) ، وتقريبا 5 اطباق بيتري مليئه الجليد الباردة تشريح المتوسطة (1x HBSS تحتوي علي جنتاميسين 10 ميكروغرام/مل). أبقهم علي الجليد
- تخدير الماوس الحامل E18 CD1 مع 40 ٪ ايزوفلواني. أداء خلع عنق الرحم علي الماوس. تعقيم البطن مع 70 ٪ محلول الايثانول.
- استخدام زوج من مقص لجعل شق الجلد من الاقتران العانة إلى عمليه الخنجري. ثم عقد الجلد مع ملقط وفتح تجويف البطن.
- المكوس أبواق الرحم مع ملقط ويغسل لهم 3x في الجليد الباردة 1x تلفزيوني علي الجليد.
ملاحظه: يجب اجراء الخطوات التالية علي الجليد لتقليل معدل الأيض ومنع تلف الانسجه والخلايا.
3. تشريح المخيخ
- بعد آخر خطوه الغسيل ، وذلك باستخدام زوج من الملقط غرامه فصل الاجنه من الرحم في 1x HBSS ونقلها إلى وسط تشريح الجليد الباردة. في وسط التشريح ، يقطع الاجنه بالمقص. ضع الانسجه في وسط التشريح النظيف.
ملاحظه: استخدام فراغيه لتشريح المجهرية اختياريه. - عقد الجمجمة مع ملقط غرامه وقطع من خلال الكلسية مع زوج من مقص صغير من الجانب الجانبي من الجمجمة في خط من ماغنوم فورامين إلى صماخ الصوتية الخارجية والحدود السفلي من التجويف المداري.
ملاحظه: أخذ هذه الخطوة الكشف عن تجويف الجمجمة علي مستوي قاعده الجمجمة ويجعل من الأسهل لأزاله الدماغ. - باستخدام زوج من ملقط غرامه ، وأزاله قاعده الجمجمة وقشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ.
- قم بازاله السحايا بعناية علي المخيخ ، بدءا من السطح الجانبي لعم المخيخ الأوسط والبونس.
- قطع كل من الأعمام المخيخ وفصل المخيخ من بقية الدماغ (الشكل 1).
- وضع علي الفور المخيخ التي تم جمعها في أنبوب مخروطي 15 مل معقمه مليئه 14 مل من DMEM/F12 علي الجليد.
- الطرد المركزي أنبوب في 1,000 x g، 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، 3x. في كل مره بلطف أزاله ماده طافي مع ماصه وأعاده تعليق بيليه في الطازجة ، الجليد الباردة dmem/F12.
ملاحظه: لتجنب فقدان العينات ، واستخدام مجلس الوزراء شفط اقل قدر ممكن.
4. تفكك المخيخ
- أضافه 2 مل من الحرارة المسبقة (37 درجه مئوية) التريبسين إلى بيليه من الخطوة 3.7 وبلطف ماصه pipet-x لخلط كافيه.
- ضع الأنبوب في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 12 دقيقه.
- بعد الحضانة ، وجلب الأنبوب إلى مجلس السلامة البيولوجية وأضافه 10 مل من DMEM/F12 لتعطيل التريبسين.
- طرد مركزي الخليط في 1,200 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في dmem الطازجة/F12. كرر 3x.
- Prewet نقل البلاستيك المعقمة ماصه pipet-x مع DMEM/F12.
- بعد الغسيل والطرد النهائية ، أضافه 3.5 mL من حل العمل DNase (1 مل من DNase I الحل الأسهم [0.05 ٪ DNase + 12 ملم MgSO4 + 1X hbss] في 500 μl من الحرارة-غير مفعله و 2 مل من dmem/F12) إلى بيليه في نفس الأنبوب.
- تريلوريتي النسيج مع ماصه pipet-x علي الأقل 30x حتى الخليط يبلغ لون حليبي متجانسة.
5-جمع الخلايا
- أضافه 10 مل من الجليد الباردة DMEM/F12 إلى الخليط.
- الطرد المركزي العينة في 1,200 x g، 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- بعناية أزاله ماده طافي دون إزعاج بيليه.
- أزاله الوسط البذر من الحاضنة.
- أضافه 500 μL من المتوسطة البذر المسبق إلى بيليه ومزجها بشكل جيد للغاية باستخدام ماصه pipet-x لأعاده تعليق الخلايا.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية.
- تمييع تعليق الخلية مع متوسط البذر إلى كثافة 5 × 105 خلايا/مل.
- تحت خزانه السلامة الاحيائيه ، أضافه 90 μL من الخليط المخفف إلى كل بئر في وسط زلة الغطاء.
ملاحظه: لا تقم بتحميل الجسيمات التي لم توقف في DNase. - ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجه مئوية لمده 3 − 4 ساعة.
- بعد الحضانة ، أضافه 500 μL من المتوسطة الثقافة المسبقة I إلى كل بئر ووضع لوحه مره أخرى في الحاضنة (37 درجه مئوية).
6-علاج الخلايا المستردة
- بعد 7 أيام, استبدلت الوسط قديمه مع [كلتثر مديوم] متوسطه [ايي] (ثقافة متوسطه انا يستكمل مع [ستوسيين] [ارمينوسايد] [[را-ك], 4 [م]] و 100 [غم/مل] بقري مصل زلال [بوسني]; انظر الجدول 1).
ملاحظه: هذه الخطوة ضرورية لتجنب نمو الخلايا غير العصبية. - مراقبه الثقافة المتوسطة مره واحده في اليوم. إذا كانت تغييرات الأس الهيدروجيني (المشار اليها من قبل تغيير ملحوظ في اللون ، وعاده المصفر) ، وأزاله نصف (تقريبا 250 μL) من الوسط القديم من جميع الآبار وأضافه 300 μL من المتوسطة الثقافة المسبقة I لكل منهم لتجنب فقدان المواد الغذائية.
ملاحظه: الفينول الأحمر في الوسط الثقافي هو مؤشر جيد لدرجه الحموضة في المتوسط ونشاط الخلايا. في محاولة للتقليل من وقت التعرض للخلايا للخروج من ظروف الحاضنة. وهذا يمنع اي إجهاد قد يؤثر علي صلاحيتها.
7-جمع الخلايا وتثبيتها
ملاحظه: اعتمادا علي التصميم التجريبي ، يمكن جمع الخلايا في اي يوم ، في اي وقت.
- اعداد منفصلة 24 لوحه جيدا مع المنظمة الرقمية المقابلة وأضافه 100 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لكل بئر.
- لحصاد الخلايا في الأيام المطلوبة (اعتمادا علي البروتوكول التجريبي) ، قم بازاله الغطاء برفق من ابار اللوحة الثقافية الاصليه ووضعها في الآبار المناظرة لصفيحه التعبئة التي تم ملؤها.
- أضافه PFA إلى الآبار لتزج تماما زلة الغطاء.
ملاحظه: لتجنب انفصال الخلية من زلة الغطاء ، لا تقم باضافه PFA مباشره علي زلة الغطاء. - الحفاظ علي لوحه PFA في 4 درجه مئوية لمده 30 − 120 دقيقه.
- بعد الحضانة ، واستعاده لوحه لدرجه حرارة الغرفة.
- يغسل برفق الغطاء ينزلق 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
- انتقل إلى عمليه المناعة.
ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم استخدام مجهر مضان مجهز بكاميرا للتقاط الصور وتجميعها في المونتاج باستخدام تطبيق برنامج تحرير الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استنادا إلى تواريخ ميلاد مختلفه من الأنواع الفرعية العصبية في المخيخ ، والثقافات من الاجنه الماوس E12 − E18 أسفرت عن أنواع مختلفه من الخلايا. برزت الخلايا العصبية الإسقاط الكبيرة ، مثل الخلايا العصبية CN (E9) وأجهزه الكمبيوتر (E13) ، في وقت مبكر خلال التنمية المخيخ. في الفئران والحبيبية وخلايا Golgi نشات بين ~ E13 – E18 وخضع الانقسامات الطرفية تصل إلى الأسبوع بعد الولادة 4.
استبدال المتوسطة القديمة I مع الثقافة الطازجة المتوسطة الثانية في أيام في المختبر (DIV) 7 سيمنع في نهاية المطاف انتشار الخلايا الدالي. وتفرق الخلايا العصبية للطبقة الجزيئية ، مثل السلة والخلية النجميه ، بعد الولادة. ولذلك ، كان من المتوقع ان تكون معظم الخلايا في وسط الثقافة في E18 مزيجا من أجهزه الكمبيوتر ، والخلايا الحبيبية ، CN ، وبعض الخلايا Golgi. تم استخدام calbindin 1 (CALB1) ، وهو علامة محدده من أجهزه الكمبيوتر ، لتتبع التغييرات المورفولوجية خلال دوره الوقت 21 يوما. النسبة للشعبة 0 ، كانت الأجسام الخلوية لأجهزه الكمبيوتر الشخصية قابله للكشف (علي سبيل المثال ، من 10 إلى 11 ساعة من الحضانة) ، ولكن النمو العصبي لم يبدا بعد (الشكل 2 ا). بواسطة DIV 3 ، وأظهرت التمديد محواري التقدم ، في حين ان العمليات الجذعية قد بدات للتو. وظلت هذه الحالة دون تغيير تقريبا حتى الأسبوع الثاني في المختبر (WIV) (الشكل 2B-D). علي DIV 10 ، وعدد قليل من فروع متفرق والابتدائية مع الأشواك العمود الفقري المتزايد (الشكل 2E). حدثت التوجيه من التشعبات الاساسيه الجديدة بشكل مستمر بعد DIV 14. ولذلك ، وبعد الشعبة 14 ، زاد عدد الطلبة الثانويين والجامعيين وطوروا فروعا واسعه في الشعبة 21 (الشكل 2 واو،زاي).
من المهم ان نعرف ان توقيت التغييرات المورفولوجية في المختبر قد لا تتبع نفس النمط كما هو الحال في الجسم المجري. بعد هذه النتائج ، في تجربه أخرى تم استزراع بريبريديا المخيخ من E12 ، E13 ، E14 ، و E15 لمده 3 أسابيع. لم تتطور أجهزه الكمبيوتر المثقفة من E12 و E13 اي النتوءات الجذعية علي DIV 18 باستثناء الملحقات محواري (الشكل 3a،B). ومع ذلك ، وبعد نفس الفترة من الزمن ، أظهرت الثقافات بريبريديوم منفصلة المخيخ من E14 و E15 النتوءات الجذعية والارطنه (الشكل 3C،D). هذا الاختلاف في إيقاع النمو بين الخلايا العصبية في المختبر يلقي الضوء علي تغيير كبير حدث في بيئتهم الطبيعية بين المرحلة المبكرة والمتاخره من النمو المخيخ ، والتي تحتاج إلى تطبيقها في المختبر لتحسين المتوسطة.
إلى جانب أجهزه الكمبيوتر ، هناك أنواع أخرى من الخلايا العصبية في المخيخ التي تتطور خلال الثقافات المخيخ الاساسيه المنفصلة التي يمكن الكشف عنها باستخدام علامات عصبيه محدده. وأظهرت العلامات المناعية مزدوجة ل CALB1 والبروتين الزلال ملزمه الكالسيوم ، parvalbumin (PVALB) ، ان CALB1 التعبير اقتصر حصرا علي أجهزه الكمبيوتر في الثقافات المخيخ الاوليه ، في حين تم التعبير عن PVALB فيCALB1 + الخلايا العصبية ( اي ، أجهزه الكمبيوتر) و PVALB +/calb1- الخلايا العصبية ، والتي هي الجزيئات العصبية الطبقة الجزيئية (سله/ستيلات الخلية) (الشكل 4a-C). الوحدة الفرعية الفا (Nav1.6) من قناه الصوديوم ببوابات الجهد (SCN) هو علامة للخلايا الحبيبية وأجهزه الكمبيوتر في المخيخ20. وضع العلامات المزدوجة مع المضادة--SCN والمضادة لCALB1 يظهر القولون من الهيئات الخلية الحبيبية وأجهزه الكمبيوتر في الوسط الثقافي علي DIV 21 (الشكل 4D-F). بالنسبة لأنواع الخلايا المخيخه المحددة الأخرى من الثقافات المخيخ الرئيسية المنفصلة ، يرجى الاطلاع علي ماربان وهوكيس19.
الشكل 1: الجانب الظهري من الدماغ الماوس يحدد المخيخ في E18. يشار إلى السحايا بالمربعات الصفراء. يتم تحديد موقع المخيخ من قبل الخط الأصفر ، والذي هو محدود rostrally من قبل الدماغ الوسطي والنخاع بواسطة النخاع المستطيل (المشار اليها بواسطة خطوط متقطعه البني). وتظهر المخيخ ونصف الكره الارضيه بخطوط متقطعه البني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تطوير خلايا Purkinje (أجهزه الكمبيوتر) المستمدة من المخيخ الفئران في E18 في الثقافة الابتدائية لأيام في المختبر (DIV) 0 – 21. (ا) تم وصف الكمبيوتر somata (نصال) بواسطة المناعي باستخدام المضادة-calbindin 1 (CALB1) في DIV 0 (بعد 10 ساعة). (B) يظهر الامتداد الاولي (السهم) والنتوء المبكر للجذعية (الراس) علي DIV 3. ويستمر النمو والتطوير (راس السهم) في الشعبة 5 (ج) والشعبة 7 (د). ويمكن تمييز الفروع الخاصة باجهزه الكمبيوتر الشخصية بوضوح علي الشعبة 10 (ه) والشعبة 14 (و) (نصال) والأشجار المتجيريه المتقنة التي يمكن كشفها في div 21 (راس السهم) (G). قضبان المقياس: A = 100 μm (ينطبق علي اللوحات B و C و D و E و F) ؛ G = 50 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تطوير خلايا Purkinje (أجهزه الكمبيوتر) المستمدة من الفئران المخيخ بريبريديوم في E12 ، E13 ، E14 ، و E15 بعد 18 يوما في الثقافة الابتدائية (DIV 18). المحاور هي الامتدادات الوحيدة (السهم) من الكمبيوتر somata في الثقافة الابتدائية لل E12 و E13 المخيخ بريبريديوم بعد 18 يوما في المختبر (DIV 18) (ا،ب). أجهزه الكمبيوتر ' تغصن النمو والإرشاد تطوير بواسطة DIV 18 (راس السهم) فقط من E14 (C) و E15 (د) الثقافات الاساسيه المخيخ. شريط مقياس = 20 ميكرومتر (ينطبق علي لوحات من−D). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الوسم المناعي من أجهزه الكمبيوتر ، والخلايا العصبية جابايرجيك (سله والخلايا النجميه) ، والكريات الحبيبية من E18 الماوس الثقافة الاوليه المخيخ في DIV 21. (ا−ج) وضع العلامات المزدوجة مع المضادة لCALB1 (الأخضر) ومكافحه PVALB (الأحمر) ويظهر أجهزه الكمبيوتر وعدد قليل من الخلايا العصبية (السهم) في اتصال مع PC شجيري العرش. (د−و) الجهد بوابات قنوات الصوديوم (scns) في الهيئات PC مع تشعبات المفصلة والعديد من الهيئات الحبيبية الصغيرة الخلية (راس السهم) هي المسمية مع المضادة--SCN (الأحمر) ومزدوجة المسمي مع المضادة--CALB1 (الأخضر). الاختصارات: خلايا Purkinje = أجهزه الكمبيوتر ؛ CALB1 = كالبيندين 1; PVALB = parvalbumin ؛ SCN = قناه الصوديوم ببوابات الجهد. شريط مقياس = 100 μm (ينطبق علي −F). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| اسم | المتوسطة الاساسيه | Putrescine | سيلينيت الصوديوم | L-الجلوتامين | الجنتاميسين | T3 | N3 | جيش صرب البوسنه | ارا-سي | FBS |
| ثقافة متوسطه [اي] | DMEM/F12 | 100 μM | 30 نيوتن متر | 3.9 مم | 3.5 ميكروغرام/مل | 0.5 ng/mL | البروجسترون 4 μM ، الانسولين 20 ميكروغرام/مل ، ترانسفيرين 20 ملغ/مل | - | - | - |
| البذر المتوسطة | DMEM/F12 | 100 μM | 30 نيوتن متر | 3.9 مم | 3.5 ميكروغرام/مل | - | - | - | - | 10% مع ثقافة متوسطه [اي] |
| الثقافة المتوسطة الثانية | ثقافة متوسطه [اي] | 100 ميكروغرام/مل | 4 μM | - | ||||||
الجدول 1: التراكيب الاعلاميه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام الثقافات الاوليه هو وسيله معروفه تنطبق علي جميع أنواع الخلايا العصبية17،18،19. في البروتوكول المعروض ، ونحن شرح كيفيه عزل الخلايا العصبية المخيخ والحفاظ علي صلاحيتها مع البقاء علي قيد الحياة الأمثل في المختبر لمده أقصاها 3 أسابيع. الثقافة الاساسيه للخلايا المخيخ ، التي كانت معزولة في E15 − E18 ، تؤكد مجموعه من ثلاث فئات من الخلايا العصبية الكبيرة: أجهزه الكمبيوتر ، وخلايا Golgi ، و CNs. ويمكن الكشف عن الأجسام الخلوية والإسقاطات من خلايا golgi (بعض التي تظهر في E19 − 5) وسوما من الخلايا الحبيبية من قبل neurogranin (ngn) والأضداد SMI32 ، علي التوالي ، في غضون 21 يوما من الثقافة19،21.
عامل حاسم لبقاء وصيانة الخلايا العصبية المخيخ هو نوع من الثقافة المتوسطة المستخدمة. وقد كان المتوسط المكمل لهذا النموذج شرطا قياسيا لخطوط الخلايا والثقافة الاوليه لعقود. ومع ذلك ، فان المخاوف الاخلاقيه ، والتباين في تكوين المصل ، وقدرته علي ان يكون مصدرا للتلوث ، أدت إلى بعض الحذر22. في الاونه الاخيره ، تم العثور علي المكمل المخصب DMEM/F-12 المتوسطة للحد من الفجوة بين الظروف الفسيولوجية والنماذج العصبية في المختبر. المتوسطة التي اقترحها furuya et al. تعزيز معدل البقاء علي قيد الحياة من أجهزه الكمبيوتر الشخصية وتحسين التمايز تغصن بالمقارنة مع استخدامها علي نطاق واسع القاعدية النسر المتوسطة (BME)-القائمة علي المصل الحرة المتوسطة17,18,23. وقد أصبحت هذه الوسيطة أساسا لوسائل الاعلام المحددة كيميائيا التي تنفذ في الثقافة الاوليه للخلية المخيخ.
الخلايا الاساسيه للذبح من الخلايا العصبية لديها قيود. كما هو الشان في اي ثقافة في المختبر ، يمكن للخلايا البقاء علي قيد الحياة لفتره محدوده من الزمن. دون استثناء, الخلايا العصبية الاوليه المستزرعة في المختبر لا يمكن الا ان يكون المرور عدد محدود من المرات. سيؤثر الإفراط في المرور علي صحة الخلايا ، والوظيفة ، والنمط الظاهري ، وعلي هذا النحو تقديم نتائج تجريبية متغيرة. لذلك ، الخلايا العصبية الاساسيه/غير العصبية التجارب القائمة علي الثقافة عاده ما تجري في الأسابيع الثلاثة الاولي من بدء الثقافة24. الظروف في المختبر لم يتم بعد الأمثل بما فيه الكفاية لخدمه جميع خلايا الجهاز العصبي في وقت واحد, بطريقه مماثله لبيئتهم الطبيعية. علي سبيل المثال ، استخدام Ara-C لمنع انتشار الخلايا غير العصبية هو شائع جدا في الدراسات حيث تحقيق معدل بقاء اعلي من الخلايا العصبية هو اولويه. لذلك, يعتمد النوعية من ثقافات أوليه علي طرق ان بشكل مصطنع يوازن ال في مختبره خليه السكان [أين ففوور وف] الخلية أنواع الفائدة25,26. وعلي الرغم من القيود التي تفرضها ، فان ثقافة الخلايا الاوليه هي نهج ممتاز لدراسة أليات الخلوية ، والاشاره إلى المسارات ، والتغيرات الظاهرية والجينية في ظل الظروف التي يكون فيها النمو الخلوي الأمثل (رهنا بأهداف بحثيه محدده) بعناية تتميز ومقارنه مع الوضع في الجسم الآخر. الاضافه إلى ذلك ، فان الثقافة المخيخار الاوليه كنظام نموذجي مبسط يوفر بيئة مجهريه تسيطر عليها للتحقيق في وفره من الآثار المورفولوجية والفسيولوجية توسط من قبل الجزيئات العديدة التي تؤثر علي الخلايا العصبية27، 28- ومع ذلك ، إلى اي مدي يتم الحفاظ علي الخصائص الفسيولوجية لهذه الخلايا خارج الاعداد في الجسم الخارجي ليتم توضيحها بالبالكامل.
الطريقة المعروضة هي بروتوكول عام فعال من حيث التكلفة لزراعه الخلايا الاوليه. فانه يوفر خيارات أوسع للتلاعب الخلايا واختبار المخدرات دون تغيير طبيعة الخلايا ، وهو أمر حاسم ل (قبل) التجارب السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكانت هذه الدراسات مدعومة بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (HM: NSERC ديسكفري غرانت # RGPIN-2018-06040) ، ومعهد بحوث مستشفي الأطفال في مانيتوبا (HM: غرانت # 320035) ، وال ALS كندا-الدماغ كندا أرثر J. هدسون منحه فريق الانتقالية (JK ، HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
