Summary
के रूप में पर्याप्त रूप से संभव के रूप में vivo स्थितियों में प्रतिबिंबित करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में आयोजन एक आसान काम नहीं है. प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों का उपयोग एक पूरे जीव में कोशिका जीव विज्ञान को समझने की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रदान की प्रोटोकॉल रूपरेखा कैसे सफलतापूर्वक विकसित करने के लिए और संस्कृति भ्रूण माउस सेरेबेलर न्यूरॉन्स.
Abstract
प्राथमिक सेल संस्कृतियों का उपयोग इन विट्रो में तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रमुख उपकरणों में से एक बन गया है। इस सरलीकृत मॉडल प्रणाली का उपयोग करने का अंतिम लक्ष्य एक नियंत्रित microenvironment प्रदान करने और उच्च अस्तित्व की दर और अलग न्यूरॉन और nonneuronal कोशिकाओं की प्राकृतिक सुविधाओं को बनाए रखने के रूप में ज्यादा के रूप में इन विट्रो की स्थिति में संभव के रूप में है. इस लेख में, हम विकासशील माउस सेरिबैलम से प्राथमिक न्यूरॉन्स अलग करने की एक विधि का प्रदर्शन, उन्हें एक इन विट्रो वातावरण में रखने, उनके विकास की स्थापना, और कई हफ्तों के लिए उनकी व्यवहार्यता और भेदभाव की निगरानी. यह विधि भ्रूणीय दिनों 12-18 के बीच सेरिबैलम से अलग भ्रूण न्यूरॉन्स के लिए लागू है।
Introduction
कई दशकों के लिए, सेल लाइनों व्यापक रूप से पूर्व नैदानिक अध्ययन और जैविक अनुसंधान में एक उच्च थ्रूपुट उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. लागत प्रभावशीलता, तेजी से विकास, और जीना पशु उपयोग की कमी इन कोशिकाओं का उपयोग करने के कुछ लाभ हैं. तथापि, आनुवंशिक परिवर्तन और फीनोटाइपिक परिवर्तन इन विट्रो1में कई मार्ग के बाद जमा होते हैं। कोशिका रेखाओं की गलत पहचान और प्राथमिक कोशिकाओं से आनुवंशिक विषमता के कारण अशोध्य प्रयोग और गलत निष्कर्ष2,3,4,5हो सकते हैं . इसलिए, इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में विभेदित कोशिकाओं के लिए कुछ समानताएं के बावजूद (जैसे, न्यूरोट्रांसमीटर, आयन चैनल, रिसेप्टर्स, और अन्य न्यूरॉन विशेष प्रोटीन), न्यूरॉन सेल लाइनों न्यूरॉन्स के पूर्ण phenotype नकल नहीं कर सकते. परिपक्व न्यूरॉन्स का उपयोग करना एक और विकल्प है; हालांकि, इन कोशिकाओं को गैर विभाजित postmitotic कोशिकाओं है कि संस्कृति में प्रचार करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं. इसके अलावा, सेल चक्र में फिर से प्रवेश apoptosis6वेग हो सकता है.
तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति, organotypic टुकड़ा संस्कृतियों, और organoid संस्कृतियों एक वातावरण है जिसमें कोशिकाओं को एक 3 डी रूप है कि vivo सेटिंग में mimics में व्यवस्था कर सकते हैं प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है. इस प्रकार, सेल से सेल संचार, प्रवास, आसपास के ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण, और एंजियोजेनेसिस का अध्ययन किया जा सकताहै 7. हालांकि, एक बिस्तर के रूप में अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन या सिंथेटिक hydrogels का उपयोग करने की अतिरिक्त लागत, इमेजिंग में कठिनाई, और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ संगतता 3 डी सेल culturing के काफी कमियां हैं. organotypic ऊतक टुकड़ा संस्कृति का एक प्रमुख नुकसान जानवरों की एक बड़ी संख्या का उपयोग और एक्सोटोमी के प्रतिकूल प्रभाव है, जो axons के लिए लक्ष्य और विकास कारकों की अगम्यता की ओर जाता है, और फलस्वरूप न्यूरॉन मौत8.
इसलिए, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जो सेल लाइनों के साथ समस्याओं से बचा जाता है, परिपक्व कोशिकाओं को बढ़ने की कठिनाई, और ऊतकों की जटिलता, अपरिपक्व प्राथमिक कोशिकाओं के इन विट्रो परिपक्वता में है। प्राथमिक कोशिकाएं सीधे मानव या पशु ऊतक से प्राप्त होती हैं और एंजाइमी और/या यांत्रिक विधियों का उपयोग करके अलग होजाती हैं 9. अलगाव के मुख्य सिद्धांत, बोने, और संस्कृति के माध्यम में रखरखाव ऊतक स्रोत की परवाह किए बिना समान हैं. तथापि, प्रसार और परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक ट्राफिक कारक अत्यधिक सेल विशिष्ट6हैं।
प्रत्येक सेरेबेलर सेल प्रकार की 'जन्मतिथि' को जानना प्राथमिक संस्कृति प्रयोग को डिजाइन करने के लिए एक शर्त है। सामान्य में, Purkinze कोशिकाओं (पीसी) और सेरेबेलर नाभिक (सीएन) के न्यूरॉन्स, छोटे कोशिकाओं से पहले पैदा होते हैं, interneurons सहित (उदाहरण के लिए, टोकरी, स्टेलेट कोशिकाओं) और ग्रेन्युल कोशिकाओं. चूहों में, पीसी भ्रूण दिन के बीच उभरने (E)10-E13, जबकि सीएन न्यूरॉन्स लगभग E9-E1210पर.
अन्य सेरेबेलर न्यूरॉन्स बहुत बाद में पैदा होते हैं. उदाहरण के लिए, चूहों में, interneurons के Golgi subpopulation पर V से उत्पन्न कर रहे हैं ([E14]E18) और शेष interneurons (बास्केट सेल और स्टेलेट कोशिकाओं) आणविक परत में स्थित के बीच सफेद मामले में संतति कोशिकाओं को विभाजित करने से उभरने जल्दी प्रसवोत्तर (पी)0-P711| ग्रैन्यूल कोशिकाएं बाह्य जनन क्षेत्र (ईजीजेड) से उत्पन्न होती हैं, एक द्वितीयक जनन क्षेत्र जो रोस्ट्रिक समचतुर्भुज होंठ से व्युत्पन्न होता है और जन्म के बाद टर्मिनल विभाजन के माध्यम से जाता है। लेकिन इससे पहले कि उनके अग्रदूतों E13-E16 से विषम होंठ से उत्पन्न, कोशिकाओं को पहले से ही pia सतह के साथ rostrally स्थानांतरित कर दिया है सेरिबैलम anlage के पृष्ठीय सतह पर कोशिकाओं की एक पतली परत बनाने के लिए. गैर-न्यूरोनल मैक्रोग्लियल कोशिकाएं जैसे एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स, जो वेंट्रिकुलर न्यूरोएपिथेलियम से उत्पन्न होते हैं, क्रमशः E13.5 डिग्री पी0 और पी0जेड पी7 में पैदा होते हैं11,12,13,14 ,15. माइक्रोग्लिया ई8-E10 के बीच और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में आक्रमण के बाद ई916द्वारा माउस मस्तिष्क में पाया जा सकता है के बीच जर्दी-सैक आदिम माइलॉयड जनक कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं।
इस लेख में प्रस्तुत विधि एक मूल रूप से Furuya एट अल द्वारा विकसित पर आधारित है और Tabata एट अल17,18, जो विस्टार चूहे सेरेबेला से व्युत्पन्न Purkinze कोशिकाओं के प्राथमिक culturing के लिए अनुकूलित किया गया था. अब हमने इस विधि को अनुकूलित किया है और माउस सेरेबेलर न्यूरॉन्स19के विकास का अध्ययन करने के लिए इसे सावधानीपूर्वक संशोधित किया है . हमारे नए प्रोटोकॉल के विपरीत, ठंड विच्छेदन माध्यम मुख्य धोने बफर Furuya के प्रोटोकॉल17में बोने के माध्यम जोड़ने से पहले विच्छेदन और विच्छेदन कदम के दौरान प्रयोग किया जाता है। इस बफर पोषण का अभाव है, विकास कारक, और हार्मोन (सभी Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम में: पोषक मिश्रण F-12 [DMEM/F12]) कि ऊपर उल्लिखित चरणों के दौरान सेल विकास और अस्तित्व का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, murine प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृतियों के साथ हमारे व्यापक अनुभव के आधार पर, हम प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस का इस्तेमाल किया है (के बजाय 1 एमएल) और करने के लिए त्रि-iodothyronine एकाग्रता में वृद्धि 0.5 एनजी / विशेष रूप से उन लोगों के साथ एक Purkinze सेल phenotype, और संस्कृति में डेन्ड्रिटिक शाखाओं के विकास को बढ़ावा देता है. इस लेख में विशेष रुप से प्रदर्शित प्रमुख विधि मोटे तौर पर भ्रूण के विकास के दौरान अन्य छोटे कृन्तकों (उदाहरण के लिए, गिलहरी और hamsters) के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न भ्रूण चरणों में सेरेबेलर neurogenesis और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो प्रजातियों के बीच अलग.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत नियमों और देखभाल और पशु देखभाल के लिए कनाडा परिषद से प्रायोगिक पशु के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया और स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है ("Bannatyne परिसर पशु देखभाल समिति"). इस्तेमाल किए गए जानवरों की संख्या और पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए। संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई को देखकर पुष्टि की गई कि हेरफेर और टो की अंगुली चुटकी या कॉर्निया प्रतिवर्त के साथ संबंधित श्वसन दर में कोई परिवर्तन नहीं हुआ है।
1. तैयारी
नोट: समय पर गर्भवती चूहों के प्रावधान अनुसूची, अनुसंधान योजना के आधार पर, के लिए पोस्ट-धारणा E12-E18. समय की पसंद वांछित सेल विशेषताओं पर निर्भर करता है (नीचे देखें). प्रयोग से कम से कम 2 दिन पहले कवर स्लिप और प्लेट तैयार करें। पाली-एल-ऑर्निथिन का उपयोग कवर स्लिप्स के सेल लगाव को बढ़ाने के लिए कोटिंग सामग्री के रूप में किया जाता है।
- कोट कवर सेल अलगाव से पहले 2 दिन फिसल जाता है.
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत, एक 24 अच्छी तरह से थाली में गोल कवर फिसल जाता है प्लेस। किसी भी संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक कवर स्लिप के बीच एक अंतर छोड़ दें।
- प्रत्येक कवर स्लिप के केंद्र में 90 डिग्री पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ, 500 ग्राम/एमएल) जोड़ें। टोपी को बंद करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए रखें।
नोट: ऊष्मायन के दौरान एक बड़ा वॉल्यूम कवर स्लिप्स से फैल सकता है। कवर पर्ची एक बूंद रखने के बाद पूरी तरह से PLO के साथ कवर करने की आवश्यकता नहीं है। रात भर ऊष्मायन के दौरान, पीएलओ कवर स्लिप के किनारे पर समान रूप से वितरित करता है।
- कोशिका अलगाव से एक दिन पहले, संस्कृति माध्यम मैं तैयार (DMEM/F-12 युक्त putrescin 100 $M, सोडियम सेलेनाइट 30 एनएम, एल-ग्लूटामाइन 3.9 mM, gentamicin 3.5g/mL, tri-iodothyronine (T3) 0.5 ng/mL, और N3 prog prog0, इंसुलिन 2 transferrin 20 mg/mL]) और बोने का माध्यम (संस्कृति माध्यम I [बिना N3 और T3] जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS]) होता है और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें। ट्रिप्सिन कार्य समाधान तैयार करें (0.25%) DMEM/F12 में और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: मध्यम रचनाएँ तालिका 1में प्रदान की गई हैं। - सेल अलगाव के दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संस्कृति माध्यम I और बोने का माध्यम रखें।
नोट: सेरिबैलम अलगाव शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण और काम सतहों बाँझ हैं। - कवर स्लिप्स को धोएं।
- 24 अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेटर से बाहर ले लो.
- बाँझ शर्तों के तहत एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में डबल आसुत पानी (DDW) के साथ 24 अच्छी तरह से थाली 3x में कवर पर्चियां धो लें। हर बार चलो कवर फिसल जाता है DDW में 5 मिनट के लिए आकांक्षा शुरू करने से पहले सोख.
- कवर पर्चियों को बायोसेफ्टी कैबिनेट में कम से कम 2 ज के लिए पूरी तरह से सूखने के लिए छोड़ दें।
2. सेरिबैलम संग्रह
- बर्फ-ठंडा 1x फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस), बर्फ-ठंडा 1x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) से भरा 3 पेट्री व्यंजन, और लगभग 5 पेट्री व्यंजन बर्फ-ठंडा विच्छेदन माध्यम (1x HBSS) से भरा से भरा तीन 10 सेमी बाँझ प्लास्टिक पेट्री व्यंजन तैयार करें जिसमें जेंटामिसिन 10 ग्राम/ उन्हें बर्फ पर रखें.
- 40% isoflurane के साथ E18 CD1 गर्भवती माउस Anesthetize. माउस पर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन. 70% इथेनॉल समाधान के साथ पेट को बाँझ करें।
- जघन सिम्फिसिस से xiphoid प्रक्रिया के लिए एक त्वचा चीरा बनाने के लिए कैंची की एक जोड़ी का प्रयोग करें. फिर संदंश के साथ त्वचा को पकड़ें और पेट की गुहा खोलें।
- गर्भाशय सींग ों को संदके से तैयार करें और बर्फ पर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस में 3x धो लें।
नोट: निम्नलिखित कदम सभी बर्फ पर आयोजित किया जाना चाहिए चयापचय दर को कम करने और ऊतक और सेल क्षति को रोकने के लिए.
3. सेरिबैलम को अलग करना
- पिछले धोने के कदम के बाद, ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर 1x HBSS में गर्भाशय से भ्रूण को अलग और उन्हें बर्फ ठंडा विच्छेदन माध्यम के लिए स्थानांतरण. विच्छेदन माध्यम में, कैंची के साथ भ्रूण decapitate. ऊतक को एक साफ विच्छेदन माध्यम में रखें।
नोट: microdissection के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करना वैकल्पिक है. - ठीक forceps के साथ खोपड़ी पकड़ो और फोरमेन मैग्नम से बाहरी ध्वनिक meatus और कक्षीय गुहा के अवर सीमा के लिए एक पंक्ति में खोपड़ी के पार्श्व पहलू से छोटे कैंची की एक जोड़ी के साथ calvarium के माध्यम से काट दिया।
नोट: इस कदम को लेने खोपड़ी आधार के स्तर पर कपाल गुहा को उजागर करता है और यह आसान मस्तिष्क को दूर करने के लिए बनाता है। - ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, खोपड़ी आधार को हटाने और मस्तिष्क से दूर खोपड़ी छील.
- ध्यान सेरेबैलम पर meninges निकालें, मध्य सेरिबैलर peduncle और pons के पार्श्व सतह से शुरू.
- दोनों सेरिबैलर पेडों को काटें और मस्तिष्क के शेष भाग से सेरिबैलम को अलग करें (चित्र 1)।
- एकत्र सेरेबेला को बर्फ पर 14 एमएल DMEM/F12 से भरी एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में रखें।
- 1,000 x g,1 मिनट, 3x के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। हर बार धीरे एक पिपेट के साथ supernatant हटा दें और ताजा, बर्फ ठंडा DMEM में गोली resuspend /
नोट: नमूनों को खोने से बचने के लिए, संभव के रूप में कम के रूप में कैबिनेट चूषण का उपयोग करें।
4. सेरिबैलम वियोजन
- चरण 3.7 से गोली के लिए prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin के 2 एमएल जोड़ें और धीरे पर्याप्त मिश्रण के लिए पाइप.
- ट्यूब को 12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
- ऊष्मायन के बाद, ट्यूब को जैव सुरक्षा कैबिनेट में लाएं और ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए डीएमईएम/एफ 12 के 10 एमएल जोड़ें।
- मिश्रण को 1,200 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को त्याग दें और ताजा DMEM/F12 में गोली को फिर से छान लें। 3x दोहराएँ.
- DMEM/F12 के साथ एक बाँझ प्लास्टिक हस्तांतरण पाइप से प्रीवेट।
- धोने और अंतिम centrifugation के बाद, DNase काम कर समाधान के 3.5 एमएल जोड़ें (DNase मैं स्टॉक समाधान के 1 एमएल [0.05% DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] में 500 $L गर्मी में सक्रिय FBS और 2 DM/
- मिश्रण एक समरूप दूधिया रंग प्राप्त करता है जब तक कम से कम 30x एक pipet के साथ ऊतक triturate.
5. सेल संग्रह
- मिश्रण में 10 एमएल बर्फ-ठंडा DMEM/F12 जोड़ें।
- 5 मिनट के लिए 1,200 x g, 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेंट्रीफ्यूज।
- ध्यान से गोली परेशान किए बिना supernatant हटा दें.
- इनक्यूबेटर से बोने के माध्यम को निकालें।
- गोली के लिए prewarmed बोने के माध्यम के 500 डिग्री एल जोड़ें और यह बहुत अच्छी तरह से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए एक pipet का उपयोग कर मिश्रण.
- हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए बोने के माध्यम के साथ सेल निलंबन को पतला करें।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, कवर स्लिप के केंद्र में प्रत्येक अच्छी तरह से पतला मिश्रण के 90 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
नोट: कण DNase में निलंबित नहीं किया है कि लोड न करें। - प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 डिग्री 4 ज के लिए रखें।
- ऊष्मायन के बाद, प्रीवार्म्ड संस्कृति माध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस को प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें और प्लेट को वापस इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
6. बरामद कोशिकाओं का उपचार
- 7 दिनों के बाद, ताजा संस्कृति मध्यम द्वितीय के साथ पुराने माध्यम की जगह (संस्कृति माध्यम मैं cytosine arabinoside [आरा-सी, 4 [एम] और 100 [g/m/
नोट: यह कदम nonneuronal कोशिकाओं के विकास से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. - दिन में एक बार संस्कृति माध्यम की निगरानी करें। यदि पीएच परिवर्तन (रंग में एक चिह्नित परिवर्तन द्वारा इंगित, आमतौर पर पीला), सभी कुओं से पुराने माध्यम के आधे (लगभग 250 डिग्री सेल्सियस) को हटा दें और पोषक तत्वों के नुकसान से बचने के लिए उनमें से प्रत्येक के लिए prewarmed संस्कृति माध्यम मैं के 300 $L जोड़ें.
नोट: संस्कृति माध्यम में फेनोल लाल मध्यम और कोशिकाओं की गतिविधि के पीएच का एक अच्छा संकेत है. इनक्यूबेटर स्थितियों से बाहर करने के लिए कोशिकाओं के जोखिम समय को कम करने की कोशिश करें। यह उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित हो सकता है जो किसी भी दबाव को रोकता है।
7. सेल संग्रह और निर्धारण
नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, कोशिकाओं को किसी भी दिन में एकत्र किया जा सकता है, किसी भी समय बिंदु पर.
- इसी संख्यात्मक संगठन के साथ एक अलग 24 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 100 $L जोड़ें।
- वांछित दिनों पर कोशिकाओं फसल के लिए (प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर), धीरे मूल संस्कृति प्लेट के कुओं से कवर पर्चियों को हटाने और उन्हें पीएफए से भरे प्लेट के इसी कुओं में जगह है.
- कवर पर्चियों को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए कुओं में पीएफए जोड़ें।
नोट: कवर स्लिप से सेल टुकड़ी से बचने के लिए, कवर स्लिप पर सीधे पीएफए न जोड़ें। - PFA प्लेट को 30 डिग्री 120 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- ऊष्मायन के बाद, प्लेट को कमरे के तापमान में पुनर्स्थापित करें।
- धीरे से 1x पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए कवर फिसल जाता है 3x धो लें।
- इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया के लिए आगे बढ़ें।
नोट: इस अध्ययन में, एक कैमरा से लैस एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक छवि संपादन सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग का उपयोग montages में इकट्ठे हुए.
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Representative Results
सेरिबैलम में न्यूरोनल उपप्रकारों की विभिन्न जन्मतिथियों के आधार पर, ई12-E18 माउस भ्रूणों की संस्कृतियों में विभिन्न प्रकार के कोशिकाएं प्राप्त होती हैं। बड़े प्रक्षेपण न्यूरॉन्स, जैसे सीएन न्यूरॉन्स (E9]E12) और पीसी (E10]E13), सेरेबेलर विकास के दौरान जल्दी उभरा. चूहों में कणिका और गोल्गी कोशिकाएं जेडई 13-ई18 के बीच उत्पन्न हुई और प्रसवोत्तर सप्ताह 4 तक टर्मिनल डिवीजनों का आयोजन किया गया।
इन विट्रो (DIV) 7 में दिनों में ताजा संस्कृति मध्यम द्वितीय के साथ पुराने माध्यम मैं की जगह अंततः glial सेल प्रसार को रोकने जाएगा. आण्विक परत के अंतर्न्यूरॉन्स, जैसे टोकरी और स्टेलेट कोशिकाओं, जन्म के बाद अंतर. इसलिए, E18 पर संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं के अधिकांश पीसी, ग्रेन्युल कोशिकाओं, सीएन, और कुछ Golgi कोशिकाओं का एक संयोजन होने की उम्मीद थी. Calbindin 1 (CALB1), पीसी की एक विशिष्ट मार्कर, 21 दिन के समय पाठ्यक्रम के दौरान आकृतिक परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. DIV 0 पर, पीसी के सेल निकायों का पता लगाने योग्य थे (जैसे, 10 डिग्री 11 ज ऊष्मायन), लेकिन न्यूराइट की वृद्धि अभी तक शुरू नहीं किया था (चित्र 2A) . DIV 3 तक, एक्सोनल विस्तार ने प्रगति दिखाई, जबकि डेन्ड्रिटिक प्रक्रियाएं अभी शुरू हुई थीं। यह स्थिति विट्रो (WIV)(चित्र 2B-D) में दूसरे सप्ताह तक लगभग अपरिवर्तित रही। DIV 10 पर, कुछ विरल शाखाएं और रीढ़ की हड्डी वाले प्राथमिक डेन्ड्राइट बढ़ने लगे (चित्र 2E) नई प्राथमिक डेन्राइट्स की स्प्राउटिंग DIV 14 के बाद लगातार हुई। अतः DIV 14 के बाद द्वितीय और तृतीयक डेन्ड्राइटों की संख्या में वृद्धि हुई और डिवी 21 में विस्तृत शाखाएं विकसित हुई (चित्र 2 एफ,छ)।
यह जानना महत्वपूर्ण है कि विट्रो में आकृतिक परिवर्तन के समय विवो के रूप में एक ही पैटर्न का पालन नहीं कर सकते हैं। इन परिणामों के बाद, एक और प्रयोग में E12, E13, E14, और E15 से अलग सेरेबेलर प्राइमोरिया 3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे. ई 12 और ई 13 के सुसंस्कृत पीसी ने एक्सोनल एक्सटेंशन को छोड़कर DIV 18 पर कोई डेन्ड्रिटिक आउटग्रोथ विकसित नहीं किया (चित्र 3क,बी) . तथापि, उसी अवधि के बाद, ई 14 और E15 से अलग सेरेबेलर आद्यापत्र संस्कृतियों ने डेन्ड्रिटिक वृद्धि और वृक्षीकरण दिखाया (चित्र 3C,D)। इन विट्रो में तंत्रिका कोशिकाओं के बीच इस विकास ताल भिन्नता एक बड़ा परिवर्तन है कि सेरेबेलर विकास के प्रारंभिक और देर से चरण के बीच उनके प्राकृतिक वातावरण में हुआ पर प्रकाश डालता है, जो मध्यम अनुकूलन के लिए इन विट्रो में लागू करने की जरूरत है.
पीसी के साथ साथ, वहाँ सेरिबैलम में अन्य न्यूरोनल सेल प्रकार है कि अलग प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृतियों है कि विशिष्ट न्यूरॉन मार्करों का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है के दौरान विकसित कर रहे हैं. डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग CALB1 और एक कैल्शियम बाध्यकारी एल्बुमिन प्रोटीन के लिए, parvalbumin (PVALB), पता चला कि CALB1 अभिव्यक्ति विशेष रूप से प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृतियों में पीसी के लिए प्रतिबंधित किया गया था, जबकि PVALB CALB1+ न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था ( अर्थात, पीसी) और PVALB+/ CALB1- न्यूरॉन्स, जो आणविक परत interneuronsहैं (बास्केट / अल्फा सबयूनिट (Nav1.6) वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल (SCN) के सेरिबैलम में ग्रेन्युल कोशिकाओं और पीसी के लिए एक मार्करहै 20. विरोधी SCN और विरोधी CALB1 के साथ डबल लेबलिंग DIV 21 पर संस्कृति माध्यम में ग्रेन्युल सेल निकायों और पीसी के colocalization से पता चलता है (चित्र 4D-एफ). अन्य विशिष्ट सेरेबेलर सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृतियों के लिए, कृपया Marzban और हॉक्स19देखें.
चित्र 1: माउस मस्तिष्क के डोर्सल पहलू E18 पर सेरिबैलम रूपरेखा. मेनिंग्स पीले वर्गों द्वारा संकेत दिया जाता है। सेरिबैलम का स्थान पीले रंग की रेखा द्वारा रेखांकित किया जाता है, जो मध्य मस्तिष्क द्वारा रोस्टली तक सीमित होता है और मेडुला ऑबेंजाल्टा (भूरे रंग की डैश्ड लाइनों द्वारा रेखांकित) द्वारा काढता है। सेरिबैलम वर्मिस और गोलार्द्ध भूरे रंग के डैश्ड लाइनों द्वारा दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: विट्रो (DIV) 0-21 में दिनों के लिए प्राथमिक संस्कृति में E18 पर माउस सेरिबैलम से व्युत्पन्न Purkinze कोशिकाओं (पीसी) का विकास। (ए) पीसी सोमा (एरोहेड्स) को डिवी 0 (10 ज के बाद) पर एंटी-कैल्बिन्डिन 1 (CALB1) का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा लेबल किया गया था। (बी) पहला एक्सोनल एक्सटेंशन (तीर) और जल्दी डेन्ड्रिटिक आउटग्रोथ (एरोहेड) DIV 3 पर दिखाई देते हैं। पीसी'डेन्ड्रिटिक वृद्धि और विकास (एरोहेड ) DIV 5 (C) और DIV 7 (D) पर जारी है . पीसी की डेन्ड्रिटिक शाखाएं स्पष्ट रूप से DIV 10 (ई) और DIV 14 (F) (एरोहेड्स) पर अलग-अलग हैं और विस्तृत डेन्ड्रिटिक पेड़ DIV 21 (एरोहेड)(जी) में डिटेक्टेबल हैं। स्केल बार: A $ 100 $m (पैनल बी, सी, डी, ई और एफ पर लागू होता है); जी $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: प्राथमिक संस्कृति में 18 दिनों के बाद E12, E13, E14, और E15 पर माउस सेरेबेलर प्राइमोडियम से व्युत्पन्न पुर्किंजे कोशिकाओं (पीसी) का विकास (DIV 18)। एक्सॉन केवल एक्सटेंशन (तीर) E12 और E13 cerebella प्राइमोडियम की प्राथमिक संस्कृति में पीसी सोमा से 18 दिनों के बाद इन विट्रो (DIV 18)(ए,बी) में हैं। पीसी'dendrite outgrowth और विस्तार DIV 18 (एरोहेड) द्वारा केवल E14(सी) और E15 (डी) सेरेबेलर प्राथमिक संस्कृतियों से विकसित. स्केल बार ] 20 डिग्री मी (पैनलए एजेडडीपर लागू होता है )। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: पीसी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग, GABAergic interneurons (बास्केट और स्टेलेट कोशिकाओं), और DIV 21 में E18 माउस सेरेबेलर प्राथमिक संस्कृति से ग्रेन्युलकोशिकाओं. (एक]सी) विरोधी CALB1 (हरी) और विरोधी PVALB (लाल) के साथ डबल लेबलिंग पीसी और कुछ interneurons (तीर) पीसी डेन्ड्रिटिक arbors के साथ संपर्क में से पता चलता है. (डी-एफ) विस्तृत dendrites और कई छोटे ग्रेन्युल सेल निकायों (एरोहेड) के साथ पीसी निकायों में वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल (SCNs) विरोधी SCN (लाल) के साथ लेबल और विरोधी CALB1 (हरा) के साथ डबल लेबल कर रहे हैं. संक्षिप्त नाम: पर्किंजे कोशिकाओं ] पीसी; CALB1 ] calbindin 1; PVALB [ parvalbumin; SCN - वोल्टेज gated सोडियम चैनल. स्केल बार ] 100 डिग्री मी (एजेडएफपर लागू होता है )। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
नाम | बुनियादी माध्यम | पुटेसीन | सोडियम सेलेनाइट | एल-ग्लूटामाइन | Gentamicin | टी 3 | एन 3 | Bsa | आरा-सी | एफबीएस |
संस्कृति माध्यम I | डीएमईएम/ | 100 डिग्री मी. | 30 एनएम | 3.9 एम.एम. | 3.5 ग्राम/ | 0.5 एनजी/ | प्रोजेस्टेरोन 4 डिग्री सेल्सियस, इंसुलिन 20 डिग्री/ | - | - | - |
सीडिंग माध्यम | डीएमईएम/ | 100 डिग्री मी. | 30 एनएम | 3.9 एम.एम. | 3.5 ग्राम/ | - | - | - | - | संस्कृति माध्यम मैं के साथ 10% |
संस्कृति माध्यम द्वितीय | संस्कृति माध्यम I | 100 ग्राम/ | 4 डिग्री मी. | - |
तालिका 1: मीडिया रचनाएँ.
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Discussion
प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग सभी प्रकार के न्यूरॉन्स17,18,19के लिए लागू एक प्रसिद्ध विधि है . प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम समझा कैसे सेरेबेलर न्यूरॉन्स को अलग करने और की एक अधिकतम के लिए इन विट्रो में इष्टतम अस्तित्व के साथ उनकी व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए 3 सप्ताह. सेरेबेलर कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति, जो E15-E18 में अलग-थलग थी, बड़े न्यूरॉन्स के तीन वर्गों के संग्रह की पुष्टि करती है: पीसी, गोलगी कोशिकाओं, और CNs. गोलगी कोशिकाओं के कोशिका निकायों और अनुमानों (जिसमें से कुछ E19-P5) में उभरने और ग्रेन्युल कोशिकाओं की सोमा neurogranin (NRGN) और SMI32 एंटीबॉडी द्वारा क्रमशः पता लगाया जा सकता है, संस्कृति के 21 दिनों के भीतर19,21.
अस्तित्व और सेरेबेलर न्यूरॉन्स के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण कारक संस्कृति माध्यम का उपयोग किया जाता है। FBS पूरक माध्यम दशकों के लिए सेल लाइनों और प्राथमिक संस्कृति के लिए एक मानक शर्त किया गया है. हालांकि, नैतिक चिंताओं, सीरम संरचना में परिवर्तनशीलता, और इसकी क्षमता संदूषण का एक स्रोत होने के लिए, कुछ सावधानी के लिए नेतृत्व किया है22. हाल ही में, पूरक समृद्ध DMEM/F-12 माध्यम शारीरिक स्थितियों और इन इन इन इन इन इन न्यूरोनल मॉडल के बीच के अंतर को कम करने के लिए पाया गया था। फुरुया एट अल द्वारा सुझाए गए माध्यम ने पीसी की जीवित रहने की दर में वृद्धि की और व्यापक रूप से प्रयुक्त बेसल मीडियम ईगल (बीएमई) आधारित सीरम-मुक्त माध्यम17,18,23की तुलना में उनके डेन्ड्राइट भेदभाव में सुधार किया । यह माध्यम सेरिबैलम सेल प्राथमिक संस्कृति में कार्यान्वित रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया का आधार बन गया है।
न्यूरॉन्स के प्राथमिक कोशिका पोषण की सीमाएं हैं। इन विट्रो संस्कृति में किसी भी रूप में, कोशिकाओं को समय की एक सीमित अवधि के लिए जीवित रह सकते हैं. अपवाद के बिना, प्राथमिक न्यूरोनल कोशिकाओं इन विट्रो में सुसंस्कृत केवल समय की एक सीमित संख्या पारित किया जा सकता है. अत्यधिक passaging सेलुलर स्वास्थ्य को प्रभावित करेगा, समारोह, और phenotype, और इस तरह के रूप में चर प्रयोगात्मक परिणाम प्रस्तुत. इसलिए, न्यूरोनल/गैर-न्यूरोनल प्राथमिक संस्कृति-आधारित प्रयोग आमतौर पर संस्कृति24को शुरू करने के पहले 3 सप्ताह के भीतर होते हैं। इन विट्रो स्थितियों में अभी तक पर्याप्त रूप से तंत्रिका तंत्र के सभी कोशिकाओं को एक साथ सेवा करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, उनके प्राकृतिक वातावरण के समान एक तरह से. उदाहरण के लिए, गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के प्रसार को बाधित करने के लिए आरा-सी का उपयोग करना अध्ययन में काफी आम है जहां न्यूरोनल कोशिकाओं की उच्च उत्तरजीविता दर प्राप्त करना प्राथमिकता है। इस प्रकार प्राथमिक संस्कृतियों की गुणवत्ता उन विधियों पर निर्भर करती है जो इन विट्रो कोशिका जनसंख्या को कृत्रिम रूप से ब्याजकेसेल प्रकारों के पक्ष में पुनः संतुलित करती हैं। अपनी सीमाओं के बावजूद, प्राथमिक सेल संस्कृति सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण है, रास्ते संकेतन, और pheno- और जीनोमिक परिवर्तन की स्थिति में जहां अनुकूलित सेलुलर विकास (विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य के अधीन) ध्यान से है विशेषता और में विवो स्थिति की तुलना में. इसके अलावा, एक सरलीकृत मॉडल प्रणाली के रूप में प्राथमिक सेरेबेलर संस्कृति एक नियंत्रित microenvironment प्रदान करता है के लिए कई न्यूरॉन कोशिकाओं को प्रभावित अणुओं द्वारा मध्यस्थता आकृति और शारीरिक प्रभाव की बहुतायत की जांच27, 28. हालांकि, किस हद तक इन कोशिकाओं के शारीरिक गुणों को इन विवो सेटिंग के बाहर संरक्षित किया जाता है, पूरी तरह से स्पष्ट हो जाता है।
प्रस्तुत विधि प्राथमिक कोशिकाओं culturing के लिए एक लागत प्रभावी सामान्य प्रोटोकॉल है. यह कोशिकाओं की प्रकृति को बदलने के बिना कोशिकाओं में हेरफेर और दवाओं का परीक्षण करने के लिए व्यापक विकल्प प्रदान करता है, जो (पूर्व)नैदानिक परीक्षणों के लिए महत्वपूर्ण है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इन अध्ययनों से प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एचएम: NSERC डिस्कवरी अनुदान ] RGPIN-2018-06040) से अनुदान द्वारा समर्थित थे, और बाल अस्पताल अनुसंधान संस्थान Manitoba (HM: अनुदान $ 320035), और ALS कनाडा-ब्रेन कनाडा आर्थर जे. हडसन अनुवाद टीम अनुदान (जेके, एचएम).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).