Summary
Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.
Abstract
L'uso delle colture cellulari primarie è diventato uno dei principali strumenti per studiare il sistema nervoso in vitro. L'obiettivo finale dell'utilizzo di questo sistema di modelli semplificato è quello di fornire un microambiente controllato e mantenere l'alto tasso di sopravvivenza e le caratteristiche naturali delle cellule neuronali e non neuronali dissociate il più possibile in condizioni in vitro. In questo articolo, dimostriamo un metodo per isolare i neuroni primari dal cervelletto del topo in via di sviluppo, collocandoli in un ambiente in vitro, stabilendo la loro crescita e monitorandone la fattibilità e la differenziazione per diverse settimane. Questo metodo è applicabile ai neuroni embrionali dissociati dal cervelletto tra i giorni embrionali 12-18.
Introduction
Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell'uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell'utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro1. L'errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un'altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l'apoptosi6.
Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l'ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l'invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l'angiogenesi possono essere studiate7. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell'utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell'imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l'uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell'asotomia, che porta all'inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale8.
Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici9. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule6.
Conoscere la "data di nascita" di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E1210.
Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P711. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell'E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell'anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7rispettivamente 11,12,13,14 ,15. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l'invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E916.
Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo19. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya17. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali e la Guida alla cura e all'uso degli animali sperimentali del Canadian Council for Animal Care ed è stata approvata dalle autorità locali ("il Bannatyne Campus Animal Care Commissione"). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati. Un'adeguata profondità di anestesia è stata confermata osservando che non vi è stato alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata alla manipolazione e al pizzico o al riflesso corneale.
1. Preparazione
NOTA: programmare la fornitura di topi incinta a tempo, in base al piano di ricerca, per la E12–E18 post-concetto. La scelta della temporizzazione dipende dalle caratteristiche delle celle desiderate (vedere di seguito). Preparare i coperchi di copertura e le piastre almeno 2 giorni prima dell'esperimento. Poly-L-ornitine viene utilizzato come materiale di rivestimento per migliorare l'attaccamento cellulare agli scivoli di copertura.
- Cappotto il coperchio scivola 2 giorni prima dell'isolamento cellulare.
- Collocare i coperchi rotondi in una piastra da 24 pozzetti, in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza. Lasciare un divario tra ogni slittamento di copertura per evitare qualsiasi contaminazione.
- Aggiungete 90 l di poli-L-ornitina (PLO, 500 g/mL) al centro di ogni cover slip. Chiudere il tappo e posizionare delicatamente la piastra in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 2 giorni.
NOTA: un volume maggiore può fuoriuscire dagli scivoli di copertura durante l'incubazione. La cover slip non deve essere completamente coperta con LLo dopo aver inserito una goccia. Durante l'incubazione notturna, l'OLP distribuisce equamente sul bordo delle schedini di copertura.
- Un giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare il mezzo di coltura I (DMEM/F-12 contenente putrescina 100 m, sodio selenite 30 nM, L-glutammina 3,9 mM, gentamicin 3,5 g/mL, tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/mL e supplementi N3 [progesterone 4M, insulina 20g/mL, transferrin 20 mg/mL)) e mezzo di seeding (medio di coltura I [senza N3 e T3] contenente 10% siero bovino fetale [FBS]) e conservarli in 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro trypsin (0,25%) In DMEM/F12 e mantenerlo a 4 gradi centigradi.
NOTA: le composizioni medie sono riportate nella Tabella 1. - Il giorno dell'isolamento cellulare, posizionare il mezzo di coltura I e il mezzo di semina nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.
NOTA: prima di iniziare l'isolamento del cervelletto, assicurarsi che tutti gli utensili e le superfici di lavoro siano sterili. - Lavare i coperchi.
- Togliere la piastra 24 dell'incubatrice.
- Lavare i coperchi del coperchio nella piastra 3x del pozzo 24 con acqua a doppia distillazione (DDW) in un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili. Ogni volta lasciare che il coperchio scivola in ammollo in DDW per 5 min prima di iniziare l'aspirazione.
- Lasciare il coperchio del coperchio in un armadio di biosicurezza per almeno 2 h per asciugare completamente.
2. Collezione Cervelletto
- Preparare tre piatti Petri in plastica sterile da 10 cm pieni di salina ghiacciata 1x tamponata da fosfati (PBS), 3 piatti Petri pieni di soluzione di sale bilanciato 1x Hank (HBSS) e circa 5 piatti Petri pieni di mezzi di dissezione ghiacciati (1x HBSS) contenente gentamicin 10 g/mL). Tienili sul ghiaccio.
- Anestesizzare il topo incinta E18 CD1 con 40% isoflurane. Eseguire lussazione cervicale sul mouse. Sterilizzare l'addome con una soluzione di etanolo del 70%.
- Utilizzare un paio di forbici per fare un'incisione cutanea dalla simfia pubica al processo xifoide. Quindi tenere la pelle con pinze e aprire la cavità addominale.
- Accisa le corna uterine con pinze e lavelatridimensionale 3x nel 1x PBS ghiacciato sul ghiaccio.
NOTA: I seguenti passaggi devono essere condotti tutti sul ghiaccio per ridurre al minimo il tasso metabolico e prevenire danni ai tessuti e alle cellule.
3. Dissecting il cervelletto
- Dopo l'ultima fase di lavaggio, l'uso di un paio di pinze sottili separano gli embrioni dall'utero in 1x HBSS e li trasferiscono sul mezzo di dissezione ghiacciato. Nel mezzo di dissezione, decapitare gli embrioni con le forbici. Collocare il tessuto in un mezzo di dissezione pulito.
NOTA: l'utilizzo di uno stereoscopio per la microdissezione è facoltativo. - Tenere il cranio con pinze sottili e tagliare il calvario con un paio di piccole forbici dall'aspetto laterale del cranio in una linea dal forame magnum al meatus acustico esterno e bordo inferiore della cavità orbitale.
NOTA: Prendendo questo passo espone la cavità cranica a livello della base del cranio e rende più facile rimuovere il cervello. - Usando un paio di pinze sottili, rimuovi la base del cranio e staccate il cranio dal cervello.
- Rimuovere con attenzione le meningi sul cervelletto, a partire dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e pons.
- Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello (Figura 1).
- Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in uno sterile tubo conico da 15 mL riempito con 14 mL di DMEM/F12 sul ghiaccio.
- Centrifugare il tubo a 1.000 x g, 4 gradi C per 1 min, 3x. Rimuovere delicatamente il supernatante con una pipetta e risospendere il pellet in fresco, ghiacciato DMEM/F12.
NOTA: Per evitare di perdere i campioni, utilizzare l'aspirazione dell'armadio il meno possibile.
4. Dissociazione del cervelletto
- Aggiungere 2 mL di prova preriscaldato (37 gradi centigradi) al pellet dal punto 3.7 e convogliare delicatamente per un'adeguata miscelazione.
- Collocare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 12 min.
- Dopo l'incubazione, portare il tubo in un armadietto di biosicurezza e aggiungere 10 mL di DMEM/F12 per inattivare la trypsin.
- Centrifugare la miscela a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in DMEM/F12 fresco. Ripetere 3x.
- Prewet un tubo di trasferimento di plastica sterile con DMEM/F12.
- Dopo il lavaggio e la centrifugazione finale, aggiungere 3,5 mL di soluzione di lavoro DNase (1 mL di soluzione stock DNase I [0.05% DNase - 12 mM MgSO4 x 1x HBSS] in 500 l di FBS inattivato dal calore e 2 mL di DMEM/F12) al pellet nello stesso tubo.
- Triturare il tessuto con un pipet almeno 30x fino a quando la miscela raggiunge un colore lattiginoso omogeneo.
5. Raccolta di celle
- Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 ghiacciato alla miscela.
- Centrifugare il campione a 1.200 x g, 4 gradi centigradi per 5 min.
- Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet.
- Rimuovere il supporto di seeding dall'incubatrice.
- Aggiungere al pellet 500 l l di mezzo di semina preriscaldato e mescolare molto bene utilizzando un pipet per risospendere le cellule.
- Contare le cellule usando un emocitometro.
- Diluire la sospensione cellulare con il mezzo di semina a una densità di 5 x 105 celle / mL.
- Sotto un armadietto di biosicurezza, aggiungere 90 l della miscela diluita ad ogni pozzo al centro dello slitta di copertura.
NOTA: non caricare le particelle che non sono stati sospesi nel DNase. - Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 3/4 h.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 500 l of prewarmed culture medium I ad ogni pozzo e riporre la piastra nell'incubatrice (37 gradi centigradi).
6. Trattamento delle cellule recuperate
- Dopo 7 giorni, sostituire il vecchio mezzo con il medio di coltura fresco II (medio di coltura Ho integrato con citosina arabinoside [Ara-C, 4 M] e 100 album del siero bovino g/mL [BSA]; vedi tabella 1).
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per evitare la crescita delle cellule non neuronali. - Monitorare il mezzo di coltura una volta al giorno. Se il pH cambia (indicato da un marcato cambiamento di colore, di solito più giallo), rimuovete la metà (quasi 250 gradi) del vecchio mezzo da tutti i pozzi e aggiungete 300 l di mezzo di coltura preriscaldato I a ciascuno di essi per evitare la perdita di nutrienti.
NOTA: Il fenolo rosso nel mezzo di coltura è un buon indicatore del pH del mezzo e dell'attività delle cellule. Cercare di ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule al di fuori delle condizioni di incubatrice. Questo previene qualsiasi stress che potrebbe influenzare la loro vitalità.
7. Raccolta e fissazione delle cellule
NOTA: A seconda del progetto sperimentale, le cellule possono essere raccolte in qualsiasi giorno, in qualsiasi momento.
- Preparare una piastra di 24 pozze separate con l'organizzazione numerica corrispondente e aggiungere 100 -L di 4% paraformaldeide (PFA) ad ogni pozzo.
- Per raccogliere le cellule nei giorni desiderati (a seconda del protocollo sperimentale), rimuovere delicatamente gli slittamenti di copertura dai pozzetti della piastra di coltura originale e metterli nei corrispondenti pozzi della piastra riempita da PFA.
- Aggiungere PFA ai pozzi per immergere completamente i copricopro.
NOTA: Per evitare il distacco delle celle dalla distinta di copertura, non aggiungere l'APFa direttamente sulla distinta di copertura. - Mantenere la piastra PFA a 4 gradi centigradi per 30-120 min.
- Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente.
- Lavare delicatamente il coperchio 3x per 5 min con 1x PBS.
- Procedere al processo di immunostaining.
NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza dotato di fotocamera per catturare le immagini e assemblato in montaggi utilizzando un'applicazione software di editing delle immagini.
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Representative Results
Sulla base delle diverse date di nascita dei sottotipi neuronali nel cervelletto, le colture degli embrioni di topo E12-E18 hanno prodotto diversi tipi di cellule. I neuroni di grande proiezione, come i neuroni CN (E9-E12) e i PC (E10-E13), sono emersi all'inizio durante lo sviluppo del cerebellar. Nei topi, le cellule di granulosi e Golgi sorsero tra gli e13 e l'E18 e subirono divisioni terminali fino alla settimana postnatale 4.
Sostituire il vecchio mezzo I con il medio fresco II nei giorni in vitro (DIV) 7 alla fine impedirà la proliferazione delle cellule gliali. Gli interneuroni dello strato molecolare, come cesto e cellule stellate, si differenziano dopo la nascita. Pertanto, la maggior parte delle cellule del mezzo di coltura a E18 dovevano essere una combinazione di PC, cellule di granulo, CN, e alcune cellule di Golgi. Calbindin 1 (CALB1), un marcatore specifico di PC, è stato utilizzato per tenere traccia dei cambiamenti morfologici durante il corso di tempo di 21 giorni. Sul DIV 0, i corpi cellulari dei PC erano rilevabili (ad es., 10-11 h di incubazione), ma la disoccupazione del neurite non era ancora iniziata (Figura 2A). Con DIV 3, l'estensione assonale ha mostrato progressi, mentre i processi dendritici erano appena iniziati. Questo stato è rimasto quasi invariato fino alla seconda settimana in vitro (WIV)(Figura 2B–D). Sul DIV 10, alcuni rami sparsi e dendriti primari con spine hanno iniziato a crescere (Figura 2E). La germogliazione dei nuovi dendriti primari si è verificata ininterrottamente dopo IL DIV 14. Pertanto, dopo DIV 14, il numero di dendriti secondari e terziari è aumentato e ha sviluppato rami larghi al DIV 21 (Figura 2F,G).
È importante sapere che i tempi dei cambiamenti morfologici in vitro potrebbero non seguire lo stesso schema di in vivo. A seguito di questi risultati, in un altro esperimento il cerebellar primordia dissociato da E12, E13, E14 e E15 sono stati coltivati per 3 settimane. I PC coltivati da E12 ed E13 non hanno sviluppato alcuna escrescenza dendritica su DIV 18 tranne le estensioni assonali (Figura 3A,B). Tuttavia, dopo lo stesso periodo di tempo, le colture dissociate del cerebellar primordium di E14 ed E15 hanno mostrato escrescenze e arborizzazione dendritiche (Figura 3C,D). Questa variazione del ritmo di crescita tra le cellule neurali in vitro fa luce su un grande cambiamento che è avvenuto nel loro ambiente naturale tra la fase iniziale e quella tardiva dello sviluppo cerebellare, che deve essere applicato in vitro per l'ottimizzazione media.
Insieme ai PC, ci sono altri tipi di cellule neuronali nel cervelletto che si sviluppano durante le colture del cerebellare primario dissociate che possono essere rilevate utilizzando specifici marcatori neuronali. La doppia etichettatura di immunofluorescenza per CALB1 e una proteina albumina che lega il calcio, parvalbumina (PVALB), ha mostrato che l'espressione CALB1 era limitata esclusivamente ai PC nelle colture cerebellari primarie, mentre il PVALB è stato espresso in neuroni CALB1 ( vale a dire, PC) e PVALB-/CALB1– neuroni, che sono interneuroni di livello molecolare (cellule basket/stellate) (Figura 4A–C). La sottounità alfa (Nav1.6) del canale di sodio (SCN) con tensione è un marcatore per le cellule granule e PC nel cervelletto20. La doppia etichettatura con anti-SCN e anti-CALB1 mostra la co-localizzazione dei corpi cellulari dei granuli e dei PC nel mezzo di coltura sul DIV 21 (Figura 4D–F). Per altri tipi specifici di cellule cerebellari da colture cerebellari primarie dissociate, si prega di consultare Marzban e Hawkes19.
Figura 1: Aspetto dorsale del cervello del topo che delinea il cervelletto a E18. Le meningi sono indicate da quadrati gialli. La posizione del cervelletto è delineata dalla linea gialla, che è limitata tristemente dal midbrain e caudalmente dalla medulla oblongata (delineata da linee tratteggiate brune). Il cervelletto vermis e l'emisfero sono indicati da linee tratteggiate brune. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sviluppo delle cellule Purkinje (PC) derivate dal cervelletto del topo all'E18 nella coltura primaria per i giorni in vitro (DIV) 0–21. (A) somata del PC (teste di freccia) sono stati etichettati con immunofluorescenza utilizzando anti-calbindin 1 (CALB1) al DIV 0 (dopo 10 h). (B) Il primo interno assonale (freccia) e l'escrescenza dendritica precoce (punta di freccia) appaiono sul DIV 3. La crescita e lo sviluppo dendritico dei PC (punta di freccia) continuano su DIV 5 (C) e DIV 7 (D). I rami dendritici dei PC sono chiaramente distinguibili su DIV 10 (E) e DIV 14 ( F )(arrowheads)e gli alberi dendritici elaborati sono rilevabili a DIV 21 (punta di freccia) (G). Barre di scala: A : 100 m (si applica ai pannelli B, C, D, E e F); G : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sviluppo delle cellule Purkinje (PC) derivate dal cerebellar primordium del cerebellare del topo a E12, E13, E14 ed E15 dopo 18 giorni nella coltura primaria (DIV 18). Gli assoni sono le uniche estensioni (freccia) dal PC somata nella cultura primaria della E12 ed E13 cerebella primordium dopo 18 giorni in vitro (DIV 18) (A,B). La escrescenza e l'estensione dei dendriti dei PC si sviluppano da DIV 18 (arrowhead) solo da E14 (C) e E15 (D) colture primarie cerebellar. Barra di scala: 20 m (si applica ai pannelli AeD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Etichettatura immunofluorescenza di PC, interneuroni GABAergici (cellule di pancia e di stella) e cellule di granulo della coltura primaria del cerebellare del topo E18 al DIV 21. (AeC) La doppia etichettatura con arbori dendritici anti-CALB1 (verde) e anti-PVALB (rosso) mostra PC e alcuni interneuroni (freccia) a contatto con gli arbori dendritici del PC. (DeF) I canali di sodio (SCN) di voltaggio (SCN) in corpi PC con dendriti elaborati e numerosi piccoli corpi cellulari di granulo (freccia) sono etichettati con anti-SCN (rosso) e con doppia etichetta con anti-CALB1 (verde). Abbreviazioni: Purkinje cellule : PC; CALB1 - calbindin 1; PVALB - parvalbumina; SCN - canale di sodio con tensione. Barra di scala: 100 m (si applica a AeF). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| nome | Mezzo base | Putrescina | Selenite di sodio | L-glutamina | Gentamicina | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | Fbs |
| Mezzo di coltura I | DMEM/F12 | 100 M | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/mL | 0,5 ng/mL | Progesterone 4 M, Insulina 20 g/mL, Transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Mezzo di seeding | DMEM/F12 | 100 M | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/mL | - | - | - | - | 10% con mezzo di coltura I |
| Mezzo di coltura II | Mezzo di coltura I | 100 g/mL | 4 M | - | ||||||
Tabella 1: Composizioni multimediali.
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Discussion
L'uso delle culture primarie è un metodo ben noto applicabile a tutti i tipi di neuroni17,18,19. Nel protocollo presentato, spieghiamo come isolare i neuroni cerebellari e mantenere la loro vitalità con la sopravvivenza ottimale in vitro per un massimo di 3 settimane. La coltura primaria delle cellule cerebellari, che sono state isolate all'E15-E18, conferma la raccolta di tre classi di grandi neuroni: PC, cellule Golgi e CN. I corpi cellulari e le proiezioni delle cellule di Golgi (alcune delle quali emergono a E19-P5) e soma delle cellule di granulo possono essere rilevati rispettivamente dagli anticorpi neurogranina (NRGN) e SMI32 entro 21 giorni dalla coltura19,21.
Un fattore critico per la sopravvivenza e il mantenimento dei neuroni cerebellari è il tipo di mezzo di coltura utilizzato. FBS centro integrato è stata una condizione standard per le linee cellulari e la cultura primaria per decenni. Tuttavia, le preoccupazioni etiche, la variabilità nella composizione del siero e il suo potenziale per essere fonte di contaminazione, hanno portato a qualche cautela22. Recentemente, supplemento arricchito DMEM/F-12 medio è stato trovato per ridurre il divario tra le condizioni fisiologiche e modelli neuronali in vitro. Il mezzo suggerito da Furuya et al. ha migliorato il tasso di sopravvivenza dei PC e migliorato la loro differenziazione dei dendriti rispetto al mezzo privo di siero basale basale ampiamente utilizzato17,18,23. Questo mezzo è diventato la base di mezzi chimici definiti attuati nella coltura primaria delle cellule del cervelletto.
La coltura cellulare primaria dei neuroni ha dei limiti. Come in qualsiasi coltura in vitro, le cellule possono sopravvivere per un periodo di tempo limitato. Senza eccezione, le cellule neuronali primarie coltivate in vitro possono essere passaggiate solo un numero limitato di volte. Un passaggio eccessivo influenzerà la salute cellulare, la funzione e il fenotipo, e come tale rendering dei risultati sperimentali variabili. Pertanto, gli esperimenti neuronali/nonneuronali basati sulla cultura primaria di solito avvengono entro le prime 3 settimane dall'inizio della coltura24. Le condizioni in vitro non sono ancora state sufficientemente ottimizzate per servire contemporaneamente tutte le cellule del sistema nervoso, in modo simile al loro ambiente naturale. Per esempio, l'uso di Ara-C per inibire la proliferazione delle cellule non neuronali è abbastanza comune negli studi in cui il raggiungimento di un più alto tasso di sopravvivenza delle cellule neuronali è una priorità. Così, la qualità delle culture primarie si basa su metodi che riequilibrano artificialmente la popolazione di cellule in vitro a favore dei tipi di cellule di interesse25,26. Nonostante i suoi limiti, la coltura cellulare primaria è un ottimo approccio per studiare i meccanismi cellulari, i percorsi di segnalazione e i cambiamenti feno- e genotypici in condizioni in cui la crescita cellulare ottimizzata (soggetta agli obiettivi specifici della ricerca) è attentamente caratterizzata e rispetto alla situazione in vivo. Inoltre, la coltura cerebellare primaria come sistema di modelli semplificato fornisce un microambiente controllato per studiare la pletora di effetti morfologici e fisiologici mediati dalle numerose molecole che colpiscono le cellule neuronali27, 28. Tuttavia, fino a che punto le proprietà fisiologiche di queste cellule sono conservate al di fuori dell'ambiente in vivo rimane da chiarire completamente.
Il metodo presentato è un protocollo generale conveniente per la coltura delle cellule primarie. Fornisce opzioni più ampie per manipolare le cellule e testare farmaci senza modificare la natura delle cellule, che è cruciale per (pre-)studi clinici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questi studi sono stati sostenuti da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), e del Children Hospital Research Institute di Manitoba (HM: Grant n. 320035), e della ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
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