Summary
インビトロ実験を行い、可能な限り十分な生体内の状態を反映することは容易な作業ではありません。一次細胞培養物の使用は、生物全体の細胞生物学を理解するための重要なステップです。提供されたプロトコルは、正常に成長し、胚性マウス小脳ニューロンを培養する方法を概説します。
Abstract
一次細胞培養物の使用は、インビトロで神経系を研究するための主要なツールの一つとなっています。この簡略化されたモデルシステムを使用する究極の目標は、制御された微小環境を提供し、高い生存率と解失性ニューロンおよび非ニューロン細胞の自然な特徴を、インビトロ条件下で可能な限り維持することです。この記事では、発達中のマウス小脳から一次ニューロンを分離し、インビトロ環境に配置し、その成長を確立し、その生存率と分化を数週間監視する方法を示す。この方法は、12~18日の胚の間に小脳から解離した胚性ニューロンに適用可能である。
Introduction
数十年にわたり、細胞株は前臨床研究や生物学的研究において高スループットツールとして広く使用されてきました。費用対効果、急速な成長、および生きている動物の使用の減少は、これらの細胞を使用するいくつかの利点です。しかしながら、遺伝的変化およびフェノタイプ変化は、インビトロ1のいくつかの通路の後に蓄積する。細胞株の誤認と原発細胞からの遺伝的非類似性は、再現不可能な実験および誤った結論につながる可能性があります2,3,4,5.したがって、ニューロンなどの分化細胞(例えば、神経伝達物質、イオンチャネル、受容体、および他のニューロン特異的タンパク質)に対するいくつかの類似性にもかかわらず、ニューロン細胞株はニューロンの完全な表現型を複製することができません。成熟したニューロンを使用することは別のオプションです。しかしながら、これらの細胞は、培養中に伝播することが困難な非分裂後細胞である。また、細胞周期への再突入は、アポトーシス6を沈殿させ得る。
三次元(3D)細胞培養、オルガノチピックスライス培養、オルガノイド培養物は、細胞がインビボ設定を模倣する3D形態に配置できる環境を提供するために開発されました。従って、細胞間通信、遊走、周囲組織への腫瘍細胞の浸潤、及び血管新生を研究することができる7。しかし、エキストラセルラーマトリックス(ECM)タンパク質または合成ヒドロゲルを寝具として使用する追加コスト、イメージングの難しさ、および高スループットスクリーニング機器との互換性は、3D細胞培養の大きな欠点です。組織組織スライス培養の主な欠点は、多数の動物の使用と軸索の標的および成長因子のアクセス不能につながる軸索の悪影響であり、その結果、神経死8。
したがって、細胞株の問題、成熟細胞の増殖の難しさ、および組織の複雑さを回避する代替アプローチは、未熟な一次細胞のインビトロ成熟である。一次細胞は、ヒトまたは動物組織から直接誘導され、酵素および/または機械的方法9を使用して解離される。培養培地における単離、播種、および維持の主な原則は、組織源に関係なく類似している。しかしながら、増殖および成熟を促進するために必要な栄養因子は、非常に細胞特異的6である。
各小脳細胞型の「生年月日」を知ることは、一次培養実験を設計するための前提条件です。一般に、プルキンエ細胞(PC)および小脳核(CN)のニューロンは、インターニューロン(例えば、バスケット、星細胞)および顆粒細胞を含む小さな細胞の前に生まれる。マウスでは、PCは胚の日(E)10-E13の間に出現し、CNニューロンはおよそE9-E1210で出現する。
他の小脳ニューロンはずっと後に生まれる。例えば、マウスでは、細胞間ニューロンのゴルジ亜集団はVZ(〜E14−E18)から生成され、分子層に位置する残りのインターニューロン(バスケット細胞および星状細胞)は、初期の間に白色物質中の前駆細胞を分割することから出現する出生後 (P)0–P711.顆粒細胞は、ロストラル菱形唇に由来する二次生殖帯(EGZ)から生成され、出生後に末端分裂を経る。しかし、彼らの前駆体がE13-E16の菱形唇から生じる前に、細胞はすでに小脳の肛門の後ろ面に細胞の薄い層を作るためにピア表面に沿ってロストリカルに移行している。心室神経上皮に由来するアストロサイトやオリゴデンドロサイトなどの非神経細胞は、それぞれE13.5-P0およびP0−P7で11、12、13、14で生まれる、15.ミクログリアは、E8-E10間の黄黄嚢原始的な骨髄前駆細胞に由来し、中枢神経系に侵入した後、E916によってマウス脳内で検出することができる。
本稿で提示する方法は、ウィスターラットセレベラ由来のプルキンジェ細胞の一次培養に最適化された古谷ら、17、18、18、すなわち、古谷ら、17、18が開発したものに基づいている。我々は今、この方法を適応させ、マウス小脳ニューロン19の成長を研究するために慎重にそれを変更しました。私たちの新しいプロトコルとは異なり、コールド解剖媒体は、古谷のプロトコル17に播種媒体を追加する前に解離および解離ステップ中に使用される主な洗浄バッファである。この緩衝液は、前述のステップ中に細胞の成長と生存をサポートするために必要な栄養、成長因子、およびホルモン(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F-12[DMEM/F12]のすべて)を欠いている。さらに、マウス一次小脳培養に関する豊富な経験に基づき、各ウェル(1mLではなく)で500μLの培養培地を使用し、神経細胞の成長を改善するトライヨードサイロニン濃度を0.5ng/mLに増加させました。特にプルキンエ細胞表現型のものを有し、培養中の樹状枝の増殖を促進する。この記事で取り上げられている主な方法は、胚発生中に他の小さなげっ歯類(例えば、リスやハムスター)に広く適用することができ、様々な胚期における小脳神経新生と分化を研究するために使用することができます。種間で異なる。
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Protocol
すべての動物の手順は、制度的な規制とカナダ動物ケア協議会の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って行われ、地元当局によって承認されています(「バンナティンキャンパス動物ケア」委員会")。使用される動物の数と苦しみを最小限に抑えるために、すべての努力がなされました。麻酔の十分な深さは、操作およびつま先ピンチまたは角膜反射に関連する呼吸数に変化がないことを観察することによって確認された。
1. 準備
注:ポストコンセプトE12-E18の研究計画に基づいて、タイミング妊娠マウスの提供をスケジュールします。タイミングの選択は、所望の細胞特性に依存する(下記参照)。実験の少なくとも2日前にカバースリップとプレートを準備します。ポリL-オルニチンは、カバースリップへの細胞付着を増強するコーティング材料として使用されます。
- カバーをコートして、細胞分離の2日前にスリップします。
- ラウンドカバースリップを24ウェルプレートに置き、生体安全キャビネット内の滅菌条件下に置きます。汚染を避けるために、各カバースリップの間に隙間を残します。
- 各カバースリップの中心に90μLのポリL-オルニチン(PLO、500 μg/mL)を加えます。キャップを閉じ、37 °C/5% CO2インキュベーターに2日間ゆっくりとプレートを置きます。
メモ:インキュベーション中にカバースリップから大きなボリュームがこぼれる場合があります。カバースリップは、ドロップを配置した後、PLOで完全に覆われる必要はありません。夜間インキュベーション中、PLOはカバースリップの端に均等に分配します。
- 細胞単離の1日前に、培養培地I(プトレシン100μMを含有するDMEM/F-12、セレニトナトリウム30nM、L-グルタミン3.9mM、ゲンタマイシン3.5μg/mL、トリヨウヨドサイロニン(T3)0.5ng/mL、N3サプリメント[プロゲスターテン40,m0m,インスリン20m,s0mm.mm.mm.mmトランスフェリン20mg/mL])及び播種培地(培養培地I[N3及びT3を含まない]10%ウシ血清[FBS])を含有し、それらを4°Cに保存する。トリプシン作業ソリューションの準備 (0.25%)DMEM/F12で、4°Cに保ちます。
注: メディア構成は表 1に示されています。 - 細胞単離の日には、培養培地Iと播種培地を37°Cのインキュベーターに入れる。
注:小脳の分離を開始する前に、すべての工具と作業面が無菌であることを確認してください。 - カバースリップを洗います。
- インキュベーターから24ウェルプレートを取り出します。
- 24ウェルプレート3xのカバースリップを、滅菌条件下のバイオセーフティキャビネットで二重蒸留水(DDW)で洗浄します。毎回カバーが吸引を開始する前に5分間DDWに浸漬させてください。
- カバースリップは、少なくとも2時間は完全に乾燥するためにバイオセーフティキャビネットに残します。
2. 小脳コレクション
- 氷冷1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填した10cm滅菌プラスチックペトリ皿3個、氷冷1xハンクのバランス塩溶液(HBSS)で満たされた3ペトリ皿、および氷冷解剖培地(1x HBSS)で満たされた約5ペトリ皿を準備するゲンタマイシン10μg/mL)を含有する。氷の上に置いておきなさい。
- 40%のイソフルランでE18 CD1妊娠中のマウスを麻酔する。マウスで子宮頸部脱臼を行います。70%エタノール溶液で腹部を殺菌します。
- はさみを使用して、陰部交神経からキシホイドプロセスへの皮膚切開を行います。その後、鉗子で皮膚を保持し、腹腔を開きます。
- 鉗子で子宮の角を取り出し、氷の上の氷冷1x PBSでそれらを3x洗浄します。
注:代謝率を最小限に抑え、組織や細胞の損傷を防ぐために、以下の手順をすべて氷上で行う必要があります。
3. 小脳の解剖
- 最後の洗浄工程の後、1x HBSSで子宮から胚を分離し、氷冷解剖培地に移す微細な鉗子のペアを使用する。解剖培地で、胚をはさみで切り落とします。組織をきれいな解剖媒体に入れ。
メモ:マイクロディセクションにステレオ顕微鏡を使用することはオプションです。 - 細かい鉗子で頭蓋骨を保持し、頭蓋骨の側面から、頭蓋のマグナムから外的な音響肉と軌道腔の下側の境界までのラインで小さなはさみでカルバリウムを切断します。
注:このステップを取ると、頭蓋骨の基部のレベルで頭蓋腔が露出し、脳を除去することが容易になります。 - 細かい鉗子のペアを使用して、頭蓋骨の基部を取り除き、頭蓋骨を脳から剥がします。
- 中小脳ペダンクルとポンの横面から始めて、小脳の髄痛を慎重に取り除きます。
- 小脳のペダンクルを両方切り、脳の残りの部分から小脳を分離します(図1)。
- 直ちに採取したセレベラを、14 mLのDMEM/F12を氷上に充填した滅菌15mL円錐チューブに入れます。
- チューブを1,000 x g、4°Cで1分間、3倍に遠心分離します。毎回ピペットで上清をそっと取り除き、新鮮な氷冷DMEM/F12でペレットを再サスペンドします。
メモ:サンプルを失うことを避けるため、キャビネットの吸引はできるだけ少なくしてください。
4. 小脳解離
- ステップ3.7からペレットに2mLのトプシン(37°)を加え、十分な混合のために穏やかにピペットを加えます。
- チューブを37°水浴に12分間置きます。
- インキュベーション後、チューブをバイオセーフティキャビネットに持ち込み、DMEM/F12を10mL加えてトリプシンを不活性化します。
- 混合物を1,200 x gで5分間遠心分離します。3x を繰り返します。
- DMEM/F12で滅菌プラスチック転写ピペットをプリウェット。
- 洗浄と最終遠心分離後、3.5mLのDNase作業溶液(DNase I原液の1 mL[0.05%DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS]を500μLの熱不活性化FBSと2mLのDMEM/F12)を同じチューブ内のペレットに追加します。
- 混合物が均質な乳白色になるまで、少なくとも30倍のピペットで組織をトリチュレートする。
5. 細胞回収
- 混合物に10 mLの氷冷DMEM/F12を加えます。
- 試料を1,200 x gで遠心分離し、4°Cで5分間行う。
- ペレットを邪魔することなく、慎重に上清を取り除いてください。
- インキュベーターから播種培地を取り除きます。
- 500°Lの前温播培地をペレットに加え、ピペットを使って細胞を再サスペンドします。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
- 播種培地で細胞懸濁液を5x105細胞/mLの密度に希釈します。
- バイオセーフティキャビネットの下で、薄めた混合物の90°Lをカバースリップの中央の各ウェルに加えます。
注: DNase で中断しなかったパーティクルはロードしないでください。 - 3−4時間のインキュベーターにプレートを置きます。
- インキュベーション後、500μLの前温培養培地Iを各ウェルに加え、プレートをインキュベーター(37°)に戻します。
6. 回収細胞の治療
- 7日後、古培地を新鮮培養培地IIに置き換える(培養培地iはシトシンアラビノシド[Ara-C,4 μM]および100μg/mLウシ血清アルブミン[BSA]を補う;表1参照)。
注:このステップは、非神経細胞の増殖を避けるために重要です。 - 培養培地を1日1回監視します。pHが変化した場合(通常は黄色い色の著しい変化によって示されます)、すべてのウェルから古い培地の半分(ほぼ250°L)を取り除き、それらのそれぞれに300μLの予備培養培地Iを加えて栄養損失を避けます。
注:培養培地中のフェノールレッドは、培地のpHおよび細胞の活性の良好な指標である。細胞のインキュベーター状態からの暴露時間を最小限に抑えるようにしてください。これにより、生存率に影響を与える可能性のあるストレスを防ぐことができます。
7. 細胞の収集と固定
注:実験計画に応じて、細胞はいつでも、任意の日に収集することができます。
- 対応する数値組織を持つ別の24ウェルプレートを準備し、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド(PFA)の100°Lを追加します。
- 所望の日に細胞を収穫するには(実験プロトコルに応じて)、元の培養プレートのウェルからカバースリップを軽く取り除き、PFA充填プレートの対応するウェルに入れます。
- カバースリップを完全に浸すために井戸にPFAを追加します。
メモ:カバースリップからセルが取り外されないようにするには、カバースリップにPFAを直接追加しないでください。 - PFAプレートは30−120分間4°Cに保ちます。
- インキュベーション後、プレートを室温に戻します。
- カバースリップを1x PBSで5分間軽く洗います。
- 免疫染色プロセスに進みます。
注:本研究では、カメラを搭載した蛍光顕微鏡を用いて画像を撮像し、画像編集ソフトウェアアプリケーションを用いてモンタージュに組み立てた。
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Representative Results
小脳における神経サブタイプの異なる生年月日に基づいて、E12−E18マウス胚からの培養物は異なる細胞型を生み出した。CNニューロン(E9-E12)やPC(E10-E13)などの大きな突起ニューロンは、小脳の発達中に早期に出現した。マウスでは、顆粒細胞とゴルジ細胞は~E13-E18の間に生じ、出生後第4週まで末端分裂を受けた。
古い培地Iをインビトロ(DIV)7の日に新鮮な培地IIに置き換えることは、最終的にグリア細胞増殖を防ぐであろう。バスケットや星座細胞などの分子層のインターニューロンは、出生後に分化する。従って、E18における培養培地中の細胞のほとんどは、PC、顆粒細胞、CN、およびいくつかのゴルジ細胞の組み合わせであることが期待された。PCの特定のマーカーであるカルビンジン1(CALB1)は、21日間のタイムコース中に形態学的変化を追跡するために使用された。DIV 0では、PCの細胞本体は検出可能であったが(例えば、10−11時間のインキュベーション)、神経突起の増殖はまだ始まっていなかった(図2A)。DIV 3によって、軸索拡張は進歩を示し、樹状プロセスは始まったばかりだった。このステータスは、2 週目のインビトロ (WIV) までほとんど変わりません (図 2B–D)。DIV 10 では、脊椎を持ついくつかのまばらな枝と一次樹状突起が成長し始めました (図 2E)。新しい一次樹状突起の発芽は、DIV 14の後に連続的に起こった。したがって、DIV 14 の後、DIV 21 (図 2F、G)で二次および第 3 樹形の樹状突起の数が増加し、広い分岐が開発されました。
インビトロにおける形態学的変化のタイミングは、インビボと同じパターンに従わない可能性があることを知ることが重要です。これらの結果に続いて、別の実験では、E12、E13、E14、およびE15からの解離した小脳原始を3週間培養した。E12 および E13 の培養 PC は、軸索拡張を除く DIV 18 で樹状の伸びを開発しませんでした (図 3A、B)。しかし、同じ期間の後、E14およびE15からの解離した小脳原始培養物は、樹状の増殖および乾燥を示した(図3C、D)。このインビトロの神経細胞間の成長リズム変動は、中程度の最適化のためにインビトロで適用する必要がある小脳の発達の初期段階と後期の間に自然環境で起こった大きな変化に光を当てます。
PCと共に、特定の神経マーカーを使用して検出することができる解関連した一次小脳培養中に発症する小脳内の他の神経細胞型があります。CALB1とカルシウム結合アルブミンタンパク質の二重免疫蛍光標識、パルブアルブミン(PVALB)は、CALB1発現が一次小脳培養におけるPCに排他的に制限され、PVALBはCALB1+ニューロン()すなわち、PC)およびPVALB+/CALB1–分子層インターニューロン(バスケット/星状細胞)であるニューロン(図4A–C)。電圧ゲートナトリウムチャネル(SCN)のアルファサブユニット(Nav1.6)は、小脳20における顆粒セルおよびPCのマーカーである。抗SCNおよび抗CALB1を用いた二重ラベリングは、DIV 21上の培養培地中の顆粒細胞体およびPCの共振化を示す(図4D–F)。解離した一次小脳培養物からの他の特定の小脳細胞型については、マルツバンとホークス19を参照してください。
図1:E18における小脳を概説するマウス脳の後ろ面。髄木は黄色の正方形で示されます。小脳の位置は黄色い線で囲まれており、中脳によってロスターリーが制限され、髄質の延伸線(茶色の破線で囲まれた)によって大胆に示される。小脳の頂点と半球は茶色の破線で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インビトロ(DIV)0~21日間の一次培養におけるE18におけるマウス小脳由来のプルキンジェ細胞(PC)の開発(A)PCソマ(矢印)をDIV0(10時間後)に抗カルビンジン1(CALB1)を用いた免疫蛍光により標識した。(B) 最初の軸索拡張 (矢印) と初期樹状伸長 (矢印) が DIV 3 に現れます。PC の樹状の成長と開発 (矢印) は、DIV 5 (C) と DIV 7 (D) で続行されます。PC の樹状分岐は、DIV 10 (E) と DIV 14 (F) (矢印) で明確に区別でき、精巧な樹状の木は DIV 21 (矢印) (G) で検出可能です。スケールバー: A = 100 μm (パネル B、C、D、E、F に適用されます)。G = 50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:一次培養18日後のE12、E13、E14、およびE15におけるマウス小脳原始に由来するプルキンジェ細胞(PC)の開発(DIV18)。軸索は、E12およびE13セレベラ原始ジウムの一次培養におけるPCソマタからの唯一の拡張(矢印)であり、18日後のインビトロ(DIV18)(A、B)。PCの樹状突起の伸びと拡張は、E14(C)およびE15(D)小脳一次培養物からのみDIV 18(矢印)によって発達する。スケール バー = 20 μm (パネルA-Dに適用されます)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PCの免疫蛍光標識、GABAergicインターニューロン(バスケットおよび星座細胞)、およびDIV21におけるE18マウス小脳一次培養からの顆粒細胞。(A−C)抗CALB1(緑)と抗PVALB(赤)による二重ラベリングは、PCとPC樹状アーバーと接触するいくつかのインターニューロン(矢印)を示しています。(D-F)精巧な樹状突起と多数の小さな顆粒セルボディ(矢印)を持つPC本体の電圧ゲートナトリウムチャネル(SCN)は、抗SCN(赤)でラベル付けされ、抗CALB1(緑色)で二重標識されています。略語: プルキンイェ細胞 = PC;CALB1 = カルビンジン 1;PVALB = パルブアルブミン;SCN = 電圧ゲートナトリウムチャネル。スケール バー = 100 μm (A-Fに適用されます)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | 基本媒体 | プトレシン | セレン酸ナトリウム | L-グルタミン | ゲンタマイシン | T3 | N3 | Bsa | アラC | Fbs |
| 培養培地I | DMEM/F12 | 100μM | 30 nM | 3.9 mM | 3.5グラム/mL | 0.5 ng/mL | プロゲステロン 4 μM, インスリン 20 μg/mL, トランスフェリン 20 mg/mL | - | - | - |
| 播種培地 | DMEM/F12 | 100μM | 30 nM | 3.9 mM | 3.5グラム/mL | - | - | - | - | 培養培地Iで10% |
| 培養培地II. | 培養培地I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
表 1: メディア構成
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Discussion
一次培養物の使用は、すべてのタイプのニューロン17、18、19に適用可能なよく知られた方法である。提示されたプロトコルでは、小脳ニューロンを分離し、最大3週間の体外で最適な生存を有する生存率を維持する方法を説明する。E15-E18で単離された小脳細胞の一次培養は、PC、ゴルジ細胞、およびCNの3つのクラスの大きなニューロンの収集を確認する。ゴルジ細胞の細胞体および突起(その一部はE19−P5で出現する)および肉芽細胞のソーマは、それぞれニューログラニン(NRGN)およびSMI32抗体によって、培養19、21の21日以内に検出することができる。
小脳ニューロンの生存および維持のための重要な要因は、使用される培養培地の種類である。FBS補足培地は、数十年にわたって細胞株および一次培養のための標準的な条件であった。しかし、倫理的な懸念、血清組成の変動性、および汚染の原因となる可能性は、いくつかの注意22につながっています。最近, サプリメント濃縮 DMEM/F-12 培地は、生理学的条件とインビトロニューロンモデルとの間のギャップを減少させることが判明しました。.Furuyaらによって示唆された培地は、PCの生存率を高め、広く使用されている基底培地イーグル(BME)系血清非血清培地17、18、23と比較してその樹状分化を改善した。この培地は、小脳細胞一次培養に実施される化学的に定義された培地の基礎となっている。
ニューロンの一次細胞培養には限界がある。他のインビトロ培養と同様に、細胞は限られた期間生存することができる。例外なく、インビトロで培養した原発性神経細胞は、限られた回数しか通過できない。過度のパシエージングは、細胞の健康、機能、表現型に影響を与え、レンダリング変数の実験結果として影響を与えます。したがって、ニューロン/非ニューロン原発培養ベースの実験は、通常、培養開始24の最初の3週間以内に行われる。in vitro条件は、自然環境と同様の方法で、神経系のすべての細胞を同時に提供するように十分に最適化されていません。例えば、Ara-Cを使用して非神経細胞の増殖を抑制することは、神経細胞のより高い生存率を達成することが優先される研究において非常に一般的である。したがって、一次培養物の品質は、対象の細胞タイプ25、26を支持してin vitro細胞集団を人工的に再バランスさせる方法に依存する。その限界にもかかわらず、一次細胞培養は、細胞のメカニズム、シグナル伝達経路、および最適化された細胞増殖(特定の研究対象の対象)が慎重に行われる条件下でのフェノおよびゲノム変化を研究するための優れたアプローチである。生体内の状況と比較して特徴付け、比較する。さらに、簡略化されたモデルシステムとしての一次小脳培養は、神経細胞27に影響を与える多数の分子によって媒介される形態学的および生理学的効果の多くを調べるために制御された微小環境を提供する、 28.しかしながら、これらの細胞の生理学的特性が生体内設定の外にどの程度保存されているかは、完全に解明されたままである。
提示された方法は、一次細胞を培養するための費用対効果の高い一般的なプロトコルである。これは、(前)臨床試験に不可欠である細胞の性質を変更することなく、細胞を操作し、薬物をテストするためのより広範なオプションを提供します。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
これらの研究は、自然科学・工学研究評議会(HM:NSERCディスカバリー補助金#RGPIN-2018-06040)、マニトバ州小児病院研究所(HM:グラント#320035)、およびALSカナダ脳カナダアーサーJからの助成金によって支えられました。ハドソントランスレーショナルチームグラント(JK、HM)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
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