Summary
Проведение экспериментов в пробирке, чтобы отразить в условиях vivo как можно более адекватно, не является легкой задачей. Использование первичных клеточных культур является важным шагом на пути к пониманию клеточной биологии в целом организме. В предоставленном протоколе описывается, как успешно расти и культуры эмбриональных нейронов мозжечка мыши.
Abstract
Использование первичных клеточных культур стало одним из основных инструментов для изучения нервной системы in vitro. Конечная цель использования этой упрощенной модели системы заключается в обеспечении контролируемой микросреды и поддерживать высокий уровень выживаемости и природные особенности разрозненных нейрональных и ненейрональных клеток как можно больше в условиях in vitro. В этой статье мы демонстрируем метод изоляции первичных нейронов от развивающегося мозжечка мыши, помещая их в среду in vitro, устанавливая их рост, и контролируя их жизнеспособность и дифференциацию в течение нескольких недель. Этот метод применим к эмбриональным нейронам, диссоциированным от мозжечка между эмбриональными днями 12–18.
Introduction
В течение нескольких десятилетий клеточные линии широко использовались в качестве инструмента высокой пропускной связи в доклинических исследованиях и биологических исследованиях. Рентабельность, быстрый рост и сокращение использования живых животных являются некоторыми преимуществами использования этих клеток. Однако генетические изменения и фенотипические изменения накапливаются после нескольких проходов in vitro1. Неверная идентификация клеточных линий и генетическая несходность первичных клеток может привести к невоспроизводимым экспериментам и ложным выводам2,3,4,5. Поэтому, несмотря на некоторое сходство с дифференцированными клетками, такими как нейроны (например, нейротрансмиттеры, ионные каналы, рецепторы и другие нейронно-специфические белки), нейронные клеточные линии не могут воспроизвести полный фенотип нейронов. Использование зрелых нейронов является еще одним вариантом; однако, эти клетки не разделяют постмитотические клетки, которые трудно размножаться в культуре. Кроме того, возвращение в клеточный цикл может привести к апоптозу6.
Трехмерная (3D) клеточная культура, органотипические срезные культуры и органоидные культуры были разработаны, чтобы обеспечить среду, в которой клетки могут организовать сявру в 3D-форму, имитирующую настройку in vivo. Таким образом, клеточной связи, миграции, вторжения опухолевых клеток в окружающие ткани, и ангиогенез можно изучить7. Однако дополнительные затраты на использование дополнительных клеточных матричных (ECM) белков или синтетических гидрогелей в качестве постельных принадлежностей, трудности в визуализации и совместимость с высокопроизводительными скрининговыми инструментами являются значительными недостатками культивирования 3D-клеток. Основным недостатком культуры органотипических срезов тканей является использование большого количества животных и неблагоприятные последствия акотомии, что приводит к недоступности целей и факторов роста для аксонов, и, следовательно, нейрональной смерти8.
Таким образом, альтернативный подход, который позволяет избежать проблем с клеточными линиями, трудности выращивания зрелых клеток, и сложность тканей, является в пробирке созревания незрелых первичных клеток. Первичные клетки получены непосредственно из тканей человека или животного и разобщены с помощью ферментативных и/или механических методов9. Основные принципы изоляции, посева и поддержания в культурной среде схожи независимо от источника ткани. Тем не менее, трофические факторы, необходимые для содействия распространению и созреванию являются весьма клеточными6.
Знание «даты рождения» каждого типа мозжечковой клетки является необходимым условием для разработки первичного эксперимента культуры. В целом, клетки Пуркинье (ПК) и нейроны мочеиссолочных ядер (CN) рождаются перед более мелкими клетками, включая интернейроны (например, корзины, стеллатные клетки) и гранулированные клетки. У мышей, ПК возникают между эмбриональным днем (E)10-E13, в то время как CN нейронов примерно E9-E1210.
Другие мозжечковые нейроны рождаются гораздо позже. Например, у мышей субпопуляция межнейронов Голги генерируется из ВЗ на уровне (E14-E18), а остальные интернейроны (клетки корзины и стеллатные клетки), расположенные в молекулярном слое, возникают из деления клеток-прародителей в белом веществе между ранними послеродовой (P)0-P711. Клетки гранул генерируются из внешней зародышевой зоны (ЭГЗ), вторичной зародышевой зоны, которая происходит от ростральной ромбических губ и проходит через терминальное деление после рождения. Но прежде чем их предшественники возникают из ромбических губ от E13-E16, клетки уже мигрировали ростально вдоль поверхности пиа, чтобы сделать тонкий слой клеток на поверхности вращателя алаг. Ненейрональные макроглиальные клетки, такие как астроциты и олигодендроциты, которые происходят из желудочкового нейроэпителия, рождаются в E13.5-P0 и P0-P7 соответственно11,12,13,14 ,15. Микроглия являются производными от желтка-мешок примитивных миелоидных клеток-прародителей между E8-E10 и после вторжения в центральную нервную систему могут быть обнаружены в мозге мыши E916.
Метод, представленный в этой статье, основан на методе, первоначально разработанном Furuya et al. и Tabata et al.17,18,который был оптимизирован для первичного культивирования клеток Пуркинье, полученных из крысиной церебеллы Wistar. Теперь мы адаптировали этот метод и тщательно модифицировали его для изучения роста мозжечковых нейронов мыши19. В отличие от нашего нового протокола, холодная среда вскрытия является основным буфером стирки, используемым во время рассечения и диссоциации, прежде чем добавить среду посева в протокол Furuya17. Этот буфер не хватает питания, факторов роста и гормонов (все в Dulbecco в модифицированных Eagle среды: питательная смесь F-12 "DMEM / F12"), которые необходимы для поддержки роста клеток и выживания во время вышеупомянутых шагов. Кроме того, основываясь на нашем обширном опыте работы с мурин первичных мозжечковых культур, мы использовали 500 л культуры среды в каждом колодце (вместо 1 мл) и увеличили концентрацию трийотиронина до 0,5 нг/мл, что улучшает рост нейрональных клеток, в частности те с фенотипом клетки Purkinje, и повышают outgrowth dendritic ветвей в культуре. Основной метод, описанный в этой статье, может быть широко применен к другим мелким грызунам (например, белкам и хомятам) во время эмбрионального развития и может быть использован для изучения мозжечкового нейрогенеза и дифференциации на различных эмбриональных стадиях, которые различаются между видами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с институциональными правилами и Руководством по уходу и использованию экспериментальных животных от Канадского совета по уходу за животными и были одобрены местными властями ("Bannatyne Campus Animal Care комитет"). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество и страдания животных, используемых. Адекватная глубина анестезии была подтверждена, заметив, что не было никаких изменений в частоте дыхания, связанных с манипуляцией и щепоткой ног или роговицы рефлекс.
1. Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Расписание предоставления приурочен беременных мышей, на основе плана исследований, для пост-зачатия E12-E18. Выбор времени зависит от желаемых характеристик ячейки (см. ниже). Подготовьте крышку скользит и пластин по крайней мере за 2 дня до эксперимента. Поли-L-орнитин используется в качестве материала покрытия для повышения клеточной привязанности к крышке скользит.
- Пальто крышка скользит за 2 дня до изоляции клеток.
- Поместите круглую крышку скользит в 24 хорошо пластины, в стерильных условиях в биобезопасности шкаф. Оставьте зазор между каждой крышкой скольжения, чтобы избежать любого загрязнения.
- Добавьте 90 зл поли-L-орнитина (PLO, 500 мкг/мл) к центру каждого покрытия скольжения. Закройте крышку и аккуратно поместите тарелку винкубатор CO 2 в 37 градусов по Цельсию на 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Больший объем может выплеснуться крышкой скользит во время инкубации. Крышка скольжения не должны быть полностью покрыты ООП после размещения капли. Во время ночной инкубации ООП распределяет поровну к краю крышки скользит.
- За день до изоляции клеток, подготовить культурную среду I (DMEM/F-12, содержащую гитресцин 100 мкм, селенит натрия 30 нм, L-глютамин 3,9 мМ, гентамицин 3,5 мкг/мл, три-йодотиронин (T3) 0,5 нг/мл, и N3 добавки трансферрин 20 мг/мл) и среда посева (культура среднего I (без N3 и T3), содержащая 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и храните их в 4 градусах Цельсия. Подготовьте рабочее решение трипсина (0.25%) в DMEM/F12 и держать его на 4 градуса цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средние композиции приведены в таблице 1. - В день изоляции клеток поместите среднюю среду I культуры и среду посева в инкубатор при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом изоляции мозжечка, убедитесь, что все инструменты и рабочие поверхности стерильны. - Вымойте крышку скользит.
- Выннесли из инкубатора 24 пластины.
- Вымойте крышку скользит в 24 хорошо пластины 3x с двойной дистиллированной воды (DDW) в биобезопасности шкаф в стерильных условиях. Каждый раз, когда крышка скользит замочить в DDW в течение 5 минут до начала аспирации.
- Оставьте крышку скользит в шкафу биобезопасности, по крайней мере 2 ч, чтобы полностью высохнуть.
2. Коллекция Церебеллум
- Приготовьте три 10-сантиметровые пластиковые блюда Петри, наполненные ледяной 1x фосфат-буферным сольником (PBS), 3 блюда миочными блюдами Петри, наполненными сбалансированным сольником 1x Hank (HBSS), и примерно 5 чашками Петри, наполненными ледяной рассеиванием среднего (1x HBSS) содержит гентамицин 10 мкг/мл). Держите их на льду.
- Анестезия E18 CD1 беременной мыши с 40% изофруран. Выполните вывих шейки матки на мышке. Стерилизовать брюшной полости с помощью 70% раствора этанола.
- Используйте ножницы, чтобы сделать разрез кожи от лобковой симфиза к процессу xiphoid. Затем удерживайте кожу гватом и открывайте брюшную полость.
- Акциз рога матки с щипками и мыть их 3x в ледяной 1x PBS на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть проведены на льду, чтобы свести к минимуму скорость обмена веществ и предотвратить повреждение тканей и клеток.
3. Рассечение мозжечка
- После последнего шага стирки, используя пару тонких щипцы отделить эмбрионы от матки в 1x HBSS и передать их в ледяной рассечения среды. В среде вскрытия обезглавить эмбрионы ножницами. Поместите ткань в чистую среду вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стереомикроскопа для микрорассеянета не является обязательным. - Держите череп мелкими щипками и прорежьте кальварию ножницами от бокового аспекта черепа в линии от фораменов магнума до внешнего акустического мяса и нижней границы орбитальной полости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принимая этот шаг подвергает полости черепа на уровне основания черепа и делает его легче удалить мозг. - Используя пару тонких щипц, удалите основание черепа и отслаите череп от мозга.
- Аккуратно удалите одра на мозжечке, начиная с боковой поверхности среднего мозжечка и понс.
- Вырезать оба мозжечковых peduncles и отделить мозжечок от остальной части мозга (Рисунок 1).
- Немедленно поместите собранную церебеллу в стерильную коническую трубку 15 мл, наполненную 14 мл DMEM/F12, на льду.
- Центрифуга трубки на 1000 х г,4 КК в течение 1 мин, 3x. Каждый раз аккуратно снимите супернатант пипеткой и отрежьте гранулы в свежем, ледяном DMEM/F12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери образцов, используйте всасывание шкафа как можно меньше.
4. Диссоциация Церебеллума
- Добавьте 2 мл претепловой (37 градусов по Цельсию) трипсина к грануле со ступени 3,7 и аккуратно пайпетдляйте для адекватного смешивания.
- Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 12 минут.
- После инкубации, довести трубку в шкаф биобезопасности и добавить 10 мл DMEM / F12 инактивировать трипсин.
- Центрифуга смесь на 1200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend гранулы в свежем DMEM/F12. Повторите 3x.
- Prewet стерильный пластиковый трубопровод трубка с DMEM/F12.
- После стирки и окончательной центрифугации, добавить 3,5 мл рабочего раствора DNase (1 мл dNase I штокового раствора (0,05% DNase 12 мМ MgSO4 - 1x HBSS) в 500 л тепло-инактивированного FBS и 2 мл DMEM/F12) к пеллете в той же трубке.
- Triturate ткани с пипеткой по крайней мере 30x, пока смесь не достигнет однородного молочного цвета.
5. Коллекция клеток
- Добавьте в смесь 10 мл холодного DMEM/F12.
- Центрифуги образца на 1200 х г,4 КК в течение 5 мин.
- Тщательно удалите супернатант, не нарушая гранулы.
- Удалите посевную среду из инкубатора.
- Добавьте 500 л предощенной среды посева к грануле и очень хорошо перемешайте его с помощью трубки для повторной приостановки работы клеток.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Разбавить клеточной суспензией со средой посева до плотности 5 х 105 клеток/мл.
- Под шкафом биобезопасности добавьте 90 кЛ разбавленной смеси к каждой скважине в центре скольжения крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не загружайте частицы, которые не приостанавливались в DNase. - Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 3х4 ч.
- После инкубации добавьте 500 qL предтеплой культуры среды I к каждому колодцу и поместите пластину обратно в инкубатор (37 градусов по Цельсию).
6. Лечение восстановленных клеток
- После 7 дней, заменить старую среду со свежей культуры среды II (культура среды я дополнил цитозин арабинозид "Ара-С, 4 ММ" и 100 мкг /мл бычьей сыворотки альбумина "BSA"; см. Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать роста ненейрональных клеток. - Мониторинг культуры среды один раз в день. Если рН изменяется (о чем свидетельствует заметное изменение цвета, как правило, желтее), удалите половину (почти 250 л) старой среды со всех скважин и добавьте 300 кЛ предтеплой культуры среды I к каждому из них, чтобы избежать потери питательных веществ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный в среде культуры является хорошим показателем рН среды и активности клеток. Постарайтесь свести к минимуму время воздействия клеток на выход из условий инкубатора. Это предотвращает любой стресс, который может повлиять на их жизнеспособность.
7. Сбор и фиксация клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментального дизайна, клетки могут быть собраны в любой день, в любой момент времени.
- Подготовьте отдельную 24 пластины с соответствующей численной организацией и добавьте 100 qL 4% параформальдегида (PFA) к каждой скважине.
- Чтобы собрать клетки в нужные дни (в зависимости от экспериментального протокола), аккуратно снимите крышку ссожеков из колодцев оригинальной культурной плиты и поместите их в соответствующие колодцы заполненной ПФА пластины.
- Добавьте PFA в колодцы, чтобы полностью погрузить крышку скользит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отрыва от камеры от крышки скольжения, не добавляйте PFA непосредственно на крышку скольжения. - Держите пластину PFA при 4 градусах по Цельсию в течение 30-120 мин.
- После инкубации восстановите пластину до комнатной температуры.
- Аккуратно промыть крышку скользит 3x в течение 5 мин с 1x PBS.
- Приступайте к процессу иммуностабилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, флуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой, был использован для захвата изображений и собран в монтажс с помощью программного приложения для редактирования изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основываясь на различных датах рождения нейрональных подтипов в мозжечке, культуры из эмбрионов мыши E12-E18 давали различные типы клеток. Большие проекционные нейроны, такие как нейроны CN (E9-E12) и ПК (E10-E13), появились на ранней стадии развития мозжедки. У мышей, гранулы и клетки Голги возникли между E13-E18 и прошли терминальные деления до послеродовой недели 4.
Замена старой среды I со свежей культурой среднего II в дни в пробирке (DIV) 7 в конечном итоге предотвратить пролиферацию глиальных клеток. Межнейроны молекулярного слоя, такие как корзины и стеллатные клетки, различаются после рождения. Таким образом, большинство клеток в среде культуры на E18, как ожидается, будет сочетание ПК, гранулы клетки, CN, и некоторые клетки Golgi. Calbindin 1 (CALB1), конкретный маркер ПК, был использован для отслеживания морфологических изменений в течение 21-дневного курса времени. На DIV 0, клеточные тела ПК были обнаружены (например, 10-11 ч инкубации), но рост неврита еще не начался(рисунок 2A). По DIV 3, аксонального расширения показали прогресс, в то время как дендритные процессы только начали. Этот статус оставался почти неизменным до второй недели in vitro (WIV)(рисунок 2B-D). На DIV 10, несколько редких ветвей и первичных дендритов с шипами начали расти(Рисунок 2E). Прорастание новых первичных дендритов происходило непрерывно после DIV 14. Таким образом, после DIV 14, количество вторичных и высших дендритов увеличилось и развивались широкие ветви на DIV 21(рисунок 2F,G).
Важно знать, что сроки морфологических изменений в пробирке не могут следовать той же схеме, что и in vivo. После этих результатов, в другом эксперименте разъединенные мозжечковые примордии из E12, E13, E14 и E15 были культивированы в течение 3 недель. Культурные ПК от E12 и E13 не развивали никаких дендритных наростов на DIV 18, за исключением аксональных расширений(рисунок 3A,B). Однако, после того же периода времени, диссоциированные мозжечковые культуры приморского из E14 и E15 показали дендритный рост и беседку(рисунок 3C,D). Это изменение ритма роста среди нервных клеток in vitro проливает свет на большие изменения, которые произошли в их естественной среде между ранней и поздней стадией мозжечкового развития, которое должно быть применено в пробирке для средней оптимизации.
Наряду с ПК, Есть другие типы нейронных клеток в мозжечке, которые развиваются во время диссоциированных первичных мозжечков культур, которые могут быть обнаружены с помощью конкретных нейрональных маркеров. Двойная маркировка иммунофлуоресценции для CALB1 и кальциевый альбумин белка, парвальбумин (PVALB), показали, что выражение CALB1 был исключительно ограничен ПК в первичных мозжечков культур, в то время как PVALB был выражен в CALB1и нейронов ( т.е. ПК) иPVALB/CALB1- нейроны, которые являются молекулярными слоями интернейронов (корзины /клетки)(рисунок 4A-C). Альфа-субъединица (Nav1.6) натриевого канала напряжения (SCN) является маркером для гранулированных клеток и ПК в мозжечке20. Двойная маркировка с анти-SCN и анти-CALB1 показывает колокализацию гранулы клеточных органов и ПК в среде культуры на DIV 21(рисунок 4D-F). Для других конкретных типов мозжечковых клеток из разрозненных первичныхмозжечковых культур, пожалуйста, см.
Рисунок 1: Дорсальный аспект мозга мыши с изложением мозжечка на E18. На оленях обозначены желтые квадраты. Расположение мозжечка очерчено желтой линией, которая ограничена ростталом средним мозгом и caudally продолговатой медуллы (очерченной коричневыми пунктирными линиями). Мозжечок vermis и полушария показаны коричневыми пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Развитие клеток Пуркинье (ПК), полученных из мозжечка мыши на E18 в первичной культуре в течение нескольких дней в пробирке (DIV) 0-21. (A)PC somata (стрелы) были помечены иммунофлуоресценции с использованием анти-calbindin 1 (CALB1) на DIV 0 (после 10 ч). (B) Первое аксоническое расширение (стрелка) и ранний дендритный рост (стрелка) появляются на DIV 3. PCs' dendritic outgrowth and development (arrowhead) continue on DIV 5 (C)and DIV 7(D). Дендритные ветви ПК четко различимы на DIV 10 (E) и DIV 14 (F) (стрелы) и сложные дендритные деревья обнаруживаются на DIV 21 (стрелка) (G). Шкала баров: 100 мкм (применяется к панелям B, C, D, E и F); G 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Развитие клеток Пуркинье (ПК), полученных из мозжечкового примоордиума мыши в E12, E13, E14 и E15 после 18 дней в первичной культуре (DIV 18). Аксоны являются единственными расширениями (стрелка) от PC somata в первичной культуре E12 и E13 cerebella primordium после 18 дней in vitro (DIV 18) (A,B). PCs' дендррит выроста и расширение развиваться DIV 18 (стрелка) только из E14 (C) и E15 (D) мозжечковой первичных культур. Шкала бар 20 мкм (применяется к панелям АиD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иммунофлуоресценция маркировки ПК, ГАМК-интернейронов (корзины и стеллат клетки), и гранулы клетки из E18 мыши мозжечковой первичной культуры на DIV 21. (AиC) Двойная маркировка с анти-CALB1 (зеленый) и анти-PVALB (красный) показывает ПК и несколько interneurons (стрелка) в контакте с ПК дендритных беседок. (DиF) Волтогенные натриевые каналы (SCN) в органах ПК с разработанными дендритами и многочисленными мелкими гранулированными клеточными телами (стрелка) помечены анти-SCN (красный) и двойной маркировкой с анти-CALB1 (зеленый). Аббревиативы: клетки Пуркинье и ПК; CALB1 и калбиндин 1; PVALB и парвальбумин; SCN - натриевый канал напряжения. Шкала бар 100 мкм (применяется к AиF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя | Базовая среда | Путресин | Селенит натрия | L-глутамин | Гентамицин | T3 | N3 | Bsa | Ара-С | Fbs |
| Культура среды I | DMEM/F12 | 100 мкм | 30 нм | 3,9 мм | 3,5 мкг/мл | 0,5 нг/мл | Прогестерон 4 мкм, инсулин 20 мкг/мл, Трансферрин 20 мг/мл | - | - | - |
| Среда посева | DMEM/F12 | 100 мкм | 30 нм | 3,9 мм | 3,5 мкг/мл | - | - | - | - | 10% с культурой среды I |
| Культура среднего II | Культура среды I | 100 мкг/мл | 4 мкм | - | ||||||
Таблица 1: Медиа композиции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование первичных культур является хорошо известным методом, применимым для всех типов нейронов17,18,19. В представленном протоколе мы объясняем, как изолировать мозжечковые нейроны и поддерживать их жизнеспособность с оптимальным выживанием в пробирке в течение максимум 3 недель. Первичная культура мозжечковых клеток, которые были выделены на E15-E18, подтверждает сбор трех классов крупных нейронов: ПК, клеток Голги и CNs. Клеточные тела и проекции клеток Голги (некоторые из которых возникают на E19-P5) и сома грануловых клеток могут быть обнаружены нейрогранином (NRGN) и антителами SMI32, соответственно, в течение 21 дня культуры19,21.
Критическим фактором для выживания и поддержания мозжечковых нейронов является тип используемой среды культуры. FBS дополнил среду была стандартным условием для клеточных линий и первичной культуры на протяжении десятилетий. Тем не менее, этические проблемы, изменчивость состава сыворотки, и его потенциал, чтобы быть источником загрязнения, привели к некоторой осторожности22. Недавно было установлено, что обогащенная добавками среда DMEM/F-12 уменьшает разрыв между физиологическими условиями и нейронными моделями in vitro. Среда, предложенная Furuya et al. повысила выживаемость ПК и улучшила их дифференциацию дендритов по сравнению с широко используемым базальным средним орлом (BME) на основе сыворотки, свободной от сыворотки17,18,23. Эта среда стала основой химически определенных средств массовой информации, реализованных в первичной культуре клеток мозжечка.
Первичный культивирование нейронов имеет ограничения. Как и в любой культуре in vitro, клетки могут выживать в течение ограниченного периода времени. Без исключения, первичные нейронные клетки, культивированные в пробирке, могут быть проложены лишь ограниченное количество раз. Чрезмерное прохождение повлияет на здоровье клеток, функции и фенотип, и как таковой отображают переменные экспериментальные результаты. Таким образом, нейрональные /ненейрональные первичные культурные эксперименты обычно проводятся в течение первых 3 недель после начала культуры24. Условия in vitro еще не были достаточно оптимизированы, чтобы служить всем клеткам нервной системы одновременно, таким же образом, как их природная среда. Например, использование Ara-C для ингибирования пролиферации ненейрональных клеток довольно часто встречается в исследованиях, где достижение более высокой выживаемости нейрональных клеток является приоритетом. Таким образом, качество первичных культур опирается на методы, которые искусственно перебалансировать популяцию клеток in vitro в пользу клеточных типов интереса25,26. Несмотря на свои ограничения, культура первичных клеток является отличным подходом к изучению клеточных механизмов, сигнальных путей, а также фено- и генотипических изменений в условиях, когда оптимизированный клеточный рост (в зависимости от конкретных целей исследования) тщательно характеризуется и сравнивается с ситуацией in vivo. Кроме того, первичная мозжечковая культура в качестве упрощенной модели системы обеспечивает контролируемую микросреду для исследования множества морфологических и физиологических эффектов, опосредованные многочисленными молекулами, влияющими на нейронные клетки27, 28. Однако, в какой степени физиологические свойства этих клеток сохраняются за пределами in vivo настройки еще предстоит полностью выяснить.
Представленный метод является экономически эффективным общим протоколом для культивирования первичных ячеек. Он предоставляет более широкие возможности для манипулирования клетками и тестирования лекарств без изменения характера клеток, что имеет решающее значение для (до) клинических испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эти исследования были поддержаны грантами От Совета естественных наук и инженерных исследований (HM: NSERC Discovery Грант - RGPIN-2018-06040), а также Детский госпиталь научно-исследовательский институт Манитобы (HM: Грант No 320035), и ALS Канада-Мозг Канады Артур J. Хадсон Переводная команда Грант (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
