Summary
In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.
Abstract
Birincil hücre kültürlerinin kullanımı in vitro sinir sistemini incelemek için önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Bu basitleştirilmiş model sistemini kullanmanın nihai amacı kontrollü bir mikroçevre sağlamak ve yüksek sağkalım oranını ve ayrıştırılmış nöronal ve nöronal olmayan hücrelerin doğal özelliklerini in vitro koşullarda mümkün olduğunca korumaktır. Bu makalede, gelişmekte olan fare beyincik birincil nöronlar izole bir yöntem göstermek, bir in vitro ortamda yerleştirerek, onların büyüme kurulması, ve birkaç hafta için canlılık ve farklılaşma izleme. Bu yöntem 12-18 yılları arasında serebellumdan ayrıştırılan embriyonik nöronlar için geçerlidir.
Introduction
Birkaç on yıl için, hücre hatları yaygın preklinik çalışmalar ve biyolojik araştırmalarda yüksek iş aracı olarak kullanılmaktadır. Maliyet etkinliği, hızlı büyüme ve canlı hayvan kullanımının azaltılması bu hücreleri kullanarak bazı faydaları vardır. Ancak, genetik değişiklikler ve fenotipik değişiklikler in vitro1birkaç pasajlar sonra birikir. Hücre hatlarının yanlış tanımlanması ve birincil hücrelerden genetik farklılık geri dönüşü olmayan deneylere ve yanlışsonuçlarayol açabilir 2,3,4,5. Bu nedenle, nöronlar gibi farklılaşmış hücrelere bazı benzerlikler rağmen (örneğin, nörotransmitter, iyon kanalları, reseptörler, ve diğer nöron özgü proteinler), nöronal hücre hatları nöronların tam fenotip çoğaltmak olamaz. Olgun nöronlar kullanarak başka bir seçenektir; ancak, bu hücreler kültürde yaymak zor olan bölünemeyen postmitotik hücrelerdir. Ayrıca hücre döngüsüne yeniden giriş apoptoz6'yaneden olabilir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, organotipik dilim kültürleri ve organoid kültürler, hücrelerin in vivo ayarı taklit eden bir 3D forma düzenleyebileceği bir ortam sağlamak için geliştirilmiştir. Böylece hücre-hücre iletişimi, göç, tümör hücrelerinin çevre dokulara invazyonu ve anjiyogenez7incelenebilir. Ancak, ekstra hücresel matriks (ECM) proteinleri veya sentetik hidrojelleri yatak olarak kullanmanın ek maliyetleri, görüntülemede zorluk ve yüksek iş yapma lı tarama aletleriyle uyumluluk 3D hücre culturing önemli dezavantajları vardır. Organotipik doku dilimi kültürünün önemli bir dezavantajı hayvanların çok sayıda kullanımı ve aksitomi yan etkileri, hangi hedeflerve aksonlar için büyüme faktörlerinin erişilemezliği yol açar, ve sonuç olarak nöronal ölüm8.
Bu nedenle, hücre hatları ile ilgili sorunları önler alternatif bir yaklaşım, olgun hücrelerin büyüyen zorluk, ve dokuların karmaşıklığı, olgunlaşmamış primer hücrelerin in vitro olgunlaşma olduğunu. Birincil hücreler doğrudan insan veya hayvan dokusundan türetilir ve enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle ayrıştırılır9. Kültür ortamında izolasyon, tohumlama ve bakım temel ilkeleri doku kaynağı ne olursa olsun benzerdir. Ancak, proliferasyon ve olgunlaşmayı teşvik etmek için gerekli trofik faktörler yüksek hücre spesifik6.
Her serebellar hücre tipinin 'doğum tarihini' bilmek bir birincil kültür deneyi tasarlamak için bir ön koşuldur. Genel olarak, Purkinje hücreleri (PCs) ve serebellar çekirdeklerin nöronlar (CN), internöronlar da dahil olmak üzere küçük hücreler, önce doğarlar (örneğin, sepet, stellat hücreleri) ve granül hücreler. Farelerde, bilgisayarlar embriyonik gün (E)10-E13 arasında ortaya çıkarken, CN nöronlar yaklaşık E9-E1210.
Diğer serebellar nöronlar çok daha sonra doğarlar. Örneğin, farelerde, internöronların Golgi alt popülasyonu VZ'den (~E14−E18) üretilir ve moleküler tabakada bulunan kalan internöronlar (sepet hücresi ve yıldız hücreleri) beyaz maddedeki progenitor hücrelerinin erken ile beyaz maddeye bölünmesinden ortaya çıkar. doğum sonrası (P)0–P711. Granül hücreler dış germinal zon (EGZ), rostral rhombic dudak türetilen ve doğumdan sonra terminal bölümü geçer ikincil bir germinal zon üretilir. Ancak öncülleri E13-E16'dan gelen eşkenar dörtgen dudaktan doğmadan önce, hücreler serebel ange'nin dorsal yüzeyinde ince bir hücre tabakası yapmak için pia yüzeyi boyunca rostrally göç etmişler. Ventriküler nöroepitelkökenli astrositler ve oligodendrositler gibi nöronal olmayan makroglial hücreler sırasıyla E13.5−P0 ve P0−P7'de doğarlar11,12,13,14 ,15. Mikroglia e8-E10 arasında yolk-kese ilkel miyeloid atahücreleri türetilmiştir ve merkezi sinir sistemine invazu sonrası E916ile fare beyninde tespit edilebilir .
Bu makalede sunulan yöntem aslında Furuya ve ark. ve Tabata ve ark.17,18tarafından geliştirilen bir dayanmaktadır , Wistar sıçan cerebella türetilen Purkinje hücrelerinin birincil culturing için optimize edildi. Şimdi bu yöntemi adapte ve dikkatle fare serebellar nöronların büyümesini incelemek için modifiye19. Yeni protokolümüzden farklı olarak, soğuk diseksiyon ortamı Furuya protokolü17'yetohumlama ortamı eklemeden önce diseksiyon ve dissosilasyon basamaklarında kullanılan ana yıkama tamponudur. Bu tampon beslenme yoksun, büyüme faktörleri, ve hormonlar (Dulbecco değiştirilmiş Eagle orta tüm: besin karışımı F-12 [DMEM/F12]) bu yukarıda belirtilen adımlar sırasında hücre büyümesini ve sağkalım desteklemek için gerekli olan. Buna ek olarak, murine primer serebellar kültürleri ile ilgili geniş deneyimimize dayanarak, her kuyuda (1 mL yerine) 500 μL kültür ortamı kullandık ve nöronal hücrelerin büyümesini iyileştiren tri-iyototironin konsantrasyonunu 0,5 ng/mL'ye çıkardık. özellikle purkinje hücre fenotip olanlar, ve kültürde dendritik dalların büyümesini teşvik. Bu makalede yer alan temel yöntem, embriyonik gelişim sırasında diğer küçük kemirgenlere (örneğin, sincaplar ve hamsterlar) yaygın olarak uygulanabilir ve çeşitli embriyonik evrelerde serebellar nörogenezve farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir, türler arasında farklılık gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri kurumsal düzenlemelere ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nden Deneysel Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve yerel makamlar tarafından onaylandı ("Bannatyne Kampüsü Hayvan Bakımı Komite"). Kullanılan hayvanların sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi. Yeterli anestezi derinliği manipülasyon ve ayak ucutu veya kornea refleksi ile ilişkili solunum hızında bir değişiklik olmadığı gözlemlenerek doğrulandı.
1. Hazırlık
NOT: Gebe kalma sonrası E12-E18 için zamanlanmış hamile farelerin, araştırma planına dayalı olarak sağlanmasını planlayın. Zamanlamaseçimi istenilen hücre özelliklerine bağlıdır (aşağıya bakın). Deneyden en az 2 gün önce kapak fişlerini ve plakaları hazırlayın. Poli-L-ornitin, kapak fişlerine hücre bağlılığını artırmak için kaplama malzemesi olarak kullanılır.
- Kapak hücre izolasyonundan 2 gün önce kayar.
- Yuvarlak kapak fişlerini 24 kuyuluk plakaya, steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için her kapak fişi arasında bir boşluk bırakın.
- Her kapak fişinin ortasına 90 μL poli-L-ornit (FKÖ, 500 g/mL) ekleyin. Kapağı kapatın ve plakayı 2 gün boyunca %37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine nazikçe yerleştirin.
NOT: Kuluçka sırasında kapak fişleri daha büyük bir hacim dökülebilir. Kapak fişi bir damla yerleştirdikten sonra tamamen FKÖ ile kaplı olması gerekmez. Gece kuluçka sırasında, FKÖ kapak fişleri kenarına eşit dağıtır.
- Hücre izolasyonundan bir gün önce, kültür ortamı I (DMEM/F-12 içeren putrescine 100 μM, sodyum selenit 30 nM, L-glutamin 3.9 mM, gentamisin 3.5 μg/mL, tri-iyototirin (T3) 0.5 ng/mL ve N3 takviyeleri [progesteron 4 μM, insülin 20/m, mL, mL transferrin 20 mg/mL]) ve tohumlama ortamı (kültür ortamı I [N3 ve T3 olmadan] %10 fetal sığır serumu [FBS]) içeren ve 4 °C'de saklayın. Tripsin çalışma çözeltisini hazırlama (%0.25) DMEM/F12'de 4 °C'de tutun.
NOT: Orta kompozisyonlar Tablo 1'deverilmiştir. - Hücre izolasyonu gününde kültür ortamı I ve tohumlama ortamını 37 °C'de kuvöze yerleştirin.
NOT: Beyincik izolasyonuna başlamadan önce, tüm aletlerin ve çalışma yüzeylerinin steril olduğundan emin olun. - Kapak fişlerini yıkayın.
- 24 kuyu plakasını kuvözden çıkar.
- Kapak fişlerini 24 kuyu plakası 3x'te, steril koşullarda biyogüvenlik kabininde çift distile su (DDW) ile yıkayın. Her zaman kapak fişleri aspirasyon başlamadan önce 5 dakika DDW emmek sağlar.
- Kapak fişlerini en az 2 saat tamamen kuruması için bir biyogüvenlik kabininde bırakın.
2. Beyincik toplama
- Buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS), buz gibi 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş 3 Petri kabı ve buz gibi diseksiyon ortamıyla dolu yaklaşık 5 Petri kabı (1x HBSS) ile doldurulmuş üç adet 10 cm steril plastik Petri kabı hazırlayın gentamisin 10 μg/mL) içeren. Onları buzda tut.
- % 40 izoflurane ile E18 CD1 hamile fare anestezi. Fare üzerinde servikal çıkığı gerçekleştirin. % 70 etanol çözeltisi ile karın sterilize.
- Kifo sürecine kasık symphysis bir deri kesi yapmak için makas bir çift kullanın. Sonra forceps ile cilt tutun ve karın boşluğu açın.
- Terin boynuzlarını büşrelerle boşaltın ve buz üzerinde buz gibi 1x PBS'de 3 x yıkayın.
NOT: Metabolik hızı en aza indirmek ve doku ve hücre hasarını önlemek için aşağıdaki adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
3. Beyincik diseksiyon
- Son yıkama adımından sonra, bir çift ince keçe kullanarak embriyoları 1x HBSS'de rahimden ayırın ve buz gibi diseksiyon ortamına aktarın. Diseksiyon ortamda, makas ile embriyoların kafasını kes. Dokuyu temiz bir diseksiyon ortamına yerleştirin.
NOT: Mikrodiseksiyon için stereomikroskop kullanmak isteğe bağlıdır. - Ince forseps ile kafatası tutun ve foramen magnum dış akustik meatus ve orbital boşluğun alt sınır bir çizgi kafatasının lateral yönü küçük makas bir çift ile calvarium ile kesti.
NOT: Bu adımı atmak kafatası tabanı seviyesindeki kafatası boşluğunu ortaya çıkarır ve beynin çıkarılmasını kolaylaştırır. - İnce bir çift forceps kullanarak, kafatası tabanını çıkarın ve beyinden kafatası soyma.
- Dikkatle beyincik üzerinde menenjler kaldırmak, orta serebellar peduncle ve pons lateral yüzeyinden başlayarak.
- Hem serebellar peduncles kesin ve beynin geri kalanından beyincik ayırın (Şekil 1).
- Toplanan seremoniyi hemen 14 mL DMEM/F12 ile dolu steril 15 mL konik bir tüpe buz üzerine yerleştirin.
- Tüpü 1 dk, 3x için 4 °C'de 1000 x g,4 °C'de santrifüj edin. Her seferinde supernatant'ı bir pipetle hafifçe çıkarın ve taze, buz gibi DMEM/F12'de peleti yeniden askıya alın.
NOT: Numuneleri kaybetmemek için dolap emişini mümkün olduğunca az kullanın.
4. Beyincik dissociasyonu
- 3.7 adımdan pelete önceden ısıtılmış (37 °C) tripsin 2 mL ekleyin ve yeterli karıştırma için hafifçe pipet.
- Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna 12 dakika yerleştirin.
- Kuluçkadan sonra tüpü biyogüvenlik kabinine getirin ve trypsininin inaktive edilmesi için 10 mL DMEM/F12 ekleyin.
- Karışımı 1.200 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve taze DMEM/F12'de peleti yeniden askıya alın. 3x'i tekrarlayın.
- DMEM/F12 ile steril plastik transfer pipetönceden tonuyla.
- Yıkama ve son santrifüjden sonra, aynı tüpteki pelete 3,5 mL DNase çalışma çözeltisi (1 mL DNase I stok çözeltisi [%0,05 DNase + 12 mM MgSO4 + 1x HBSS] 500 μL ısı yalıtımlı FBS ve 2 mL DMEM/F12 ekleyin.
- Karışım homojen sütlü bir renge erişene kadar dokuyu en az 30 x pipetle triturate edin.
5. Hücre toplama
- Karışıma 10 mL buz gibi DMEM/F12 ekleyin.
- Numuneyi 1.200 x g, 4 °C'de 5 dk.'da santrifüj edin.
- Peleti bozmadan supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
- Tohumlama ortamını kuluçka makinesinden çıkarın.
- Pelete 500 μL önceden ısıtılmış tohumlama ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için bir pipet kullanarak çok iyi karıştırın.
- Hemositometre kullanarak hücreleri say.
- 5 x 105 hücre/mL bir yoğunlukta tohumlama orta ile hücre süspansiyon seyreltin.
- Bir biyogüvenlik kabini altında, kapak fişinin merkezindeki her kuyuya seyreltilmiş karışımın 90°L'sini ekleyin.
NOT: DNase'de askıda olmayan parçacıkları yüklemeyin. - Plakayı 37 °C'de 3−4 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
- Kuluçkadan sonra, her kuyuya 500 μL önceden ısınmış kültür ortamı I ekleyin ve plakayı kuvöze (37 °C) geri yerleştirin.
6. Kurtarılan hücrelerin tedavisi
- 7 gün sonra, eski ortayı taze kültür ortamı II ile değiştirin (sitozin arabinoside [Ara-C, 4 μM] ve 100 μg/mL sığır serum albumini [BSA]; bakınız Tablo 1).
NOT: Bu adım nöronal olmayan hücrelerin büyümesini önlemek için önemlidir. - Kültür ortamını günde bir kez izleyin. EĞER pH değişiklikleri (belirgin bir renk değişikliği ile gösterilir, genellikle daha sarı), tüm kuyulardan eski ortamın yarısını (neredeyse 250 μL) çıkarın ve besin kaybını önlemek için her birine önceden ısınmış kültür orta I 300 μL ekleyin.
NOT: Kültür ortamındaki fenol kırmızısı, hücrelerin ortamının pH'ının ve aktivitesinin iyi bir göstergesidir. İnkübatör koşulları dışında hücrelerin maruz kalma süresini en aza indirmeye çalışın. Bu onların canlılığını etkileyebilecek herhangi bir stres önler.
7. Hücre toplama ve fiksasyon
NOT: Deneysel tasarıma bağlı olarak, hücreler herhangi bir gün, herhangi bir zaman noktasında toplanabilir.
- İlgili sayısal organizasyonile ayrı bir 24 kuyu plakası hazırlayın ve her kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) 100°L ekleyin.
- Hücreleri istenilen günlerde hasat etmek için (deneysel protokole bağlı olarak), kapak fişlerini orijinal kültür plakasının kuyularından hafifçe çıkarın ve PFA dolu plakanın ilgili kuyularına yerleştirin.
- Kapak fişlerini tamamen batırmak için kuyulara PFA ekleyin.
NOT: Hücrenin kapak fişinden ayrılmasını önlemek için, PfA'yı doğrudan kapak fişine eklemeyin. - PFA plakasını 30−120 dk boyunca 4 °C'de tutun.
- Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığına plaka geri.
- Kapağı 1x PBS ile 5 dk boyunca 3x yavaşça yıkayın.
- İmmünoboyama işlemine devam edin.
NOT: Bu çalışmada, görüntüleri yakalamak için kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılmış ve bir görüntü düzenleme yazılımı uygulaması kullanılarak montajlar halinde monte edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyincikteki nöronal alt tiplerin farklı doğum tarihlerine göre, E12−E18 fare embriyolarının kültürleri farklı hücre tipleri ortaya çıkarmıştır. CN nöronlar (E9−E12) ve PCs (E10−E13) gibi büyük projeksiyon nöronlar serebeller gelişim sırasında erken ortaya çıkmıştır. Farelerde granül ve Golgi hücreleri ~E13-E18 arasında ortaya çıktı ve doğum sonrası 4.
Eski orta I'yi taze kültür ortamı II ile değiştirmek, in vitro (DIV) 7 günlerinde glial hücre çoğalmasını önler. Sepet ve yıldız hücreleri gibi moleküler tabakanın internöronları doğumdan sonra ayırt olur. Bu nedenle, E18 kültür ortamı hücrelerinin çoğu CD'ler, granül hücreler, CN ve bazı Golgi hücrelerinin bir kombinasyonu olması bekleniyordu. Calbindin 1 (CALB1), 21 günlük zaman kursu sırasında morfolojik değişiklikleri izlemek için kullanılan, CD'lerin belirli bir belirteç. DIV 0'da, CD'lerin hücre gövdeleri tespit edilebilirdi (örn. 10−11 saat kuluçka), ancak neuritin büyümesi henüz başlamamıştı(Şekil 2A). DIV 3 ile aksonal uzantı ilerleme gösterirken, dendritik süreçler yeni başlamıştı. Bu durum, ikinci haftaya kadar neredeyse değişmeden kaldı in vitro (WIV)(Şekil 2B–D). DIV 10'da, omurgalı birkaç seyrek dal ve primer dendrit ler büyümeye başladı (Şekil 2E). Div 14'ten sonra yeni birincil dendritlerin filizlenmeleri sürekli olarak gerçekleşebilir. Bu nedenle, DIV 14'ten sonra, div 21'de ikincil ve üçüncül dendrit lerin sayısı artmış ve geniş dallar gelişmiştir (Şekil 2F,G).
Bu in vitro morfolojik değişikliklerin zamanlaması in vivo aynı desen takip olmayabilir bilmek önemlidir. Bu sonuçların ardından, başka bir deneyde E12, E13, E14 ve E15'ten ayrışmış serebellar primordia 3 hafta boyunca kültürlendi. E12 ve E13'ün kültürlü CD'leri DIV 18'de aksonal uzantılar dışında herhangi bir dendritik büyüme geliştirmemiştir(Şekil 3A,B). Ancak, aynı dönemden sonra, E14 ve E15'ten ayrışmış serebellar primordium kültürleri dendritik büyüme ve arborizasyon göstermiştir (Şekil 3C,D). İn vitro nöral hücreler arasındaki bu büyüme ritim değişimi, orta optimizasyon için in vitro uygulanması gereken serebellar gelişimin erken ve geç evreleri arasında doğal ortamlarında meydana gelen büyük bir değişime ışık tutmaktadır.
Bilgisayarları ile birlikte, belirli nöronal belirteçleri kullanılarak tespit edilebilir ayrışmış primer serebellar kültürler sırasında geliştirmek beyincik diğer nöronal hücre tipleri vardır. CALB1 için çift immünoresans etiketleme ve kalsiyum bağlayıcı albumin proteini parvalbumin (PVALB), CALB1 ekspresyonunun primer serebellar kültürlerde sadece pC'lerle sınırlı olduğunu, PVALB'nin ise CALB1+ nöronlarda ifade edildiğini göstermiştir ( yani, PCs) ve PVALB+/CALB1– nöronlar, moleküler tabaka internöronlar (sepet / yıldız hücreleri)(Şekil 4A–C). Gerilim kapılı sodyum kanalının (SCN) alfa alt birimi (Nav1.6) serebellum20'dekigranül hücreler ve CD'ler için bir belirteçtir. Anti-SCN ve anti-CALB1 ile çift etiketleme DIV 21(Şekil 4D–F)üzerinde kültür ortamı granül hücre organları ve P'lerin colocalization gösterir. Ayrıştırılmış primer serebellar kültürlerden diğer spesifik serebellar hücre tipleri için, Marzban ve Hawkes19'abakınız.
Şekil 1: Fare beyninin E18'deki beyincik özetleyen dorsal yönü. Menenjler sarı karelerle gösterilir. Serebellumun yeri sarı çizgi ile özetlenmiştir, hangi orta beyin ve caudally tarafından medulla oblongata tarafından rostrally sınırlıdır (kahverengi kesik çizgiler ile özetlenen). Beyincik vermis ve hemisfer kahverengi kesik çizgiler le gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: E18'deki fare serebellumundan elde edilen Purkinje hücrelerinin (PK) gelişimi, primer kültürde in vitro (DIV) 0-21 gün boyunca. (A) PC somata (ok uçları) immünororesans ile div 0 (10 saat sonra) anti-calbindin 1 (CALB1) kullanılarak etiketlenmiştir. (B) Div 3'te ilk aksonal uzantı (ok) ve erken dendritik çıkıntı (ok başı) görünür. CD'lerin dendritik büyüme ve gelişme (ok başı) DIV 5(C)ve DIV 7(D)devam ediyor. CD'lerin dendritik dalları DIV 10(E) ve DIV 14(F)(ok başları) ve ayrıntılı dendritik ağaçlar DIV 21 (ok ucu)(G)de tespit edilebilir açıkça ayırt edilebilir. Ölçek çubukları: A = 100 μm (B, C, D, E ve F panelleri için geçerlidir); G = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: E12, E13, E14 ve E15'te primer kültürde 18 gün sonra fare serebellar primordiumdan türetilen Purkinje hücrelerinin (PK'lar) gelişimi (DIV 18). Aksonlar 18 gün in vitro (DIV 18)(A,B)sonra E12 ve E13 cerebella primordium birincil kültür PC somata sadece uzantıları (ok) vardır. DC'lerin dendrite büyümesi ve uzantısı div 18 (ok ucu) ile gelişir ve sadece E14(C)ve E15(D)serebellar primer kültürlerden gelişir. Ölçek çubuğu = 20 μm (A−Dpanelleri için geçerlidir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: DIV 21'de CD'lerin immünororeskence etiketlemesi, GABAerjik internöronlar (sepet ve yıldız hücreleri) ve E18 fare serebellar primer kültüründen granül hücreler. (A−C) Anti-CALB1 (yeşil) ve anti-PVALB (kırmızı) ile çift etiketleme PC dendritik arbors ile temas pc ve birkaç interneurons (ok) gösterir. (D−F) Ayrıntılı dendritler ve çok sayıda küçük granül hücre gövdesi (ok ucu) ile PC gövdelerinde voltaj kapılı sodyum kanalları (SCNs) anti-SCN (kırmızı) ve anti-CALB1 (yeşil) ile çift etiketli etiketlenir. Kısaltmalar: Purkinje hücreleri = CD'ler; CALB1 = calbindin 1; PVALB = parvalbumin; SCN = voltaj kapılı sodyum kanalı. Ölçek çubuğu = 100 μm (A−Fiçin geçerlidir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | Temel orta | Putrescine | Sodyum selenit | L-glutamin | Gentamisin | T3 | N3 | Bsa | Ara-C | Fbs |
| Kültür orta I | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/mL | 0,5 ng/mL | Progesteron 4 μM, İnsülin 20 g/mL, Transferrin 20 mg/mL | - | - | - |
| Tohumlama ortamı | DMEM/F12 | 100 μM | 30 nM | 3,9 mM | 3,5 g/mL | - | - | - | - | Kültür ortamı I ile % 10 |
| Kültür ortamı II | Kültür orta I | 100 μg/mL | 4 μM | - | ||||||
Tablo 1: Medya kompozisyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birincil kültürlerin kullanımı nöronların her türlü için geçerli iyi bilinen bir yöntemdir17,18,19. Sunulan protokolde, serebellar nöronların nasıl izole edilebildiğini ve en fazla 3 hafta boyunca optimum in vitro sağkalımla canlılıklarını nasıl koruyacağımızı açıklıyoruz. E15−E18'de izole edilen serebellar hücrelerinin birincil kültürü, büyük nöronların üç sınıfının toplanmasını doğrular: CD'ler, Golgi hücreleri ve CN'ler. Golgi hücrelerinin hücre gövdeleri ve projeksiyonları (bazıları E19−P5'te ortaya çıkar) ve granül hücrelerin soma'sı sırasıyla nörogranin (NRGN) ve SMI32 antikorları tarafından tespit edilebilir, kültürden sonraki 21 gün içinde19,21.
Serebellar nöronların hayatta kalması ve bakımı için kritik bir faktör kullanılan kültür ortamı türüdür. FBS tamamlayıcı orta yıllardır hücre hatları ve birincil kültür için standart bir koşul olmuştur. Ancak, etik kaygılar, serum bileşiminde değişkenlik ve kontaminasyon kaynağı olma potansiyeli, bazı dikkatli yol açmıştır22. Son zamanlarda, ek zenginleştirilmiş DMEM/F-12 ortamının fizyolojik koşullar ile in vitro nöronal modeller arasındaki boşluğu azalttığı bulunmuştur. Orta Furuya ve ark. PM'lerin geliştirilmiş sağkalım oranı tarafından önerilen ve yaygın olarak kullanılan bazal orta kartal ile karşılaştırıldığında onların dendrite farklılaşma geliştirilmiş (BME)tabanlı serumsuz orta17,18,23. Bu ortam, beyincik hücre primer kültüründe uygulanan kimyasal olarak tanımlanmış medyanın temeli haline gelmiştir.
Nöronların primer hücre culturing sınırlamaları vardır. Herhangi bir in vitro kültürde olduğu gibi, hücreler sınırlı bir süre için yaşayabilir. İstisnasız, birincil nöronal hücreler in vitro kültürlü sadece kez sınırlı sayıda geçit edilebilir. Aşırı geçiş hücresel sağlık, fonksiyon ve fenotip etkileyecek ve bu nedenle değişken deneysel sonuçlar işlemek. Bu nedenle, nöronal / nonneuronal primer kültür tabanlı deneyler genellikle kültür24başlayan ilk 3 hafta içinde gerçekleşir. In vitro koşullar henüz yeterince aynı anda sinir sisteminin tüm hücrelerine hizmet için optimize edilmemiştir, doğal çevreye benzer bir şekilde. Örneğin, nonnöronal hücrelerin çoğalmasını inhibe etmek için Ara-C kullanarak nöronal hücrelerin daha yüksek bir sağkalım oranı elde bir öncelik olduğu çalışmalarda oldukça yaygındır. Böylece, birincil kültürlerin kalitesi yapay ilgi hücre türleri lehine in vitro hücre popülasyonu yeniden dengelemek yöntemleri dayanır25,26. Sınırlamalarına rağmen, birincil hücre kültürü hücresel mekanizmaları, sinyal yollarını ve optimize edilmiş hücresel büyümenin (belirli araştırma amaçlarına bağlı olarak) dikkatle bulunduğu koşullar altında feno ve genotypik değişiklikleri incelemek için mükemmel bir yaklaşımdır. karakterize ve in vivo durum ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, basitleştirilmiş bir model sistemi olarak primer serebellar kültür nöronal hücreleri etkileyen çok sayıda molekül tarafından aracılık morfolojik ve fizyolojik etkilerin bolluğu araştırmak için kontrollü bir mikroortam sağlar27, 28. yıl. Ancak, bu hücrelerin fizyolojik özellikleri in vivo ayarı dışında korunur ne ölçüde tamamen açıklığa kavuşturulacak kalır.
Sunulan yöntem, birincil hücrelerin kültüre atılması için uygun maliyetli bir genel protokoldür. Bu hücreleri manipüle etmek ve hücrelerin doğasını değiştirmeden ilaç test etmek için daha geniş seçenekler sağlar, hangi (ön-) klinik çalışmalar için çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışmalar, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) ve Manitoba Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (HM: Grant # 320035) ve ALS Canada-Brain Canada Arthur J.'den gelen hibelerle desteklenmiştir. Hudson Çeviri Takım Grant (JK, HM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Slips: Circles | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
