Summary
Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til tilberedning og dyrkning af Porcin split cornea-knapper. Da denne organo-typisk dyrkede organ kulturmodel viser celledødelighed inden for 15 dage, sammenlignelige med human donor hornhinder, det repræsenterer den første model, der tillader langvarig dyrkning af ikke-humane hornhinder uden at tilføje giftige dextran.
Abstract
Eksperimentel forskning i cornea endotheliale celler er forbundet med flere vanskeligheder. Human donor hornhinder er knappe og sjældent til rådighed for eksperimentelle undersøgelser, da de normalt er nødvendige for transplantation. Endotelcelle kulturer oversætter ofte ikke godt til in vivo-situationer. På grund af de biostrukturelle egenskaber af ikke-humane corneas, stromale hævelse under dyrkning inducerer betydelige cornea endotel celle tab, hvilket gør det vanskeligt at udføre dyrkning i en længere periode. Deswelling-agenter som dextran anvendes til at modvirke dette respons. Men, de også forårsage signifikant endotel celle tab. Der blev derfor fastlagt en ex vivo-organ dyrknings model, som ikke krævede deswelling-midler. Grise øjne fra et lokalt slagteri blev brugt til at forberede split cornea-knapper. Efter delvis cornea-trephination blev de yderste lag af hornhinden (epithelium, Bowman lag, dele af stroma) fjernet. Dette reducerer markant cornea endotel celletab induceret af massive stromale hævelse og Descemets membran folde hele længere dyrkningsperioder og forbedrer generel bevarelse af endotelcellelag. Efterfølgende fuldstændig cornea-udmejsling blev efterfulgt af fjernelsen af Split cornea-knappen fra den resterende øjen pære og dyrkning. Endotel celletæthed blev vurderet ved opfølgnings tider på op til 15 dage efter klargøring (dvs. dag 1, 8, 15) ved hjælp af let mikroskopi. Den anvendte forberedelses teknik giver mulighed for en bedre bevaring af endotelcellelag, der er aktiveret ved mindre stromale vævshævelse, hvilket resulterer i langsom og lineær tilbagegang i Split cornea-knapper svarende til human donor corneas. Da denne standardiserede organo-typisk dyrkede forskningsmodel for første gang giver mulighed for en stabil dyrkning i mindst to uger, er det et værdifuldt alternativ til human donor hornhinder til fremtidige undersøgelser af forskellige eksterne faktorer med hensyn til deres virkninger på hornhinde endothelium.
Introduction
Cornea-transplantationer procedurer er blandt de hyppigst udførte transplantationer over hele verden1. Da der er en alvorlig mangel på menneskelige donor hornhinder, eksperimentel forskning adressering cornea endotheliale celler i humane hornhinder er vanskeligt at udføre1. Men indførelsen af vandings løsninger og andre stoffer, der anvendes i øjet, oftalmisk viskoelastisk udstyr, samt kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulgering instrumenter og teknikker, ultralyd energi) kræver og omfattende undersøgelser vedrørende deres virkninger på cornea-endotelet før klinisk brug.
Der findes få alternativer til human donor hornhinder til forskning. Dyre forskningsmodeller er meget værdifulde, men på samme tid meget ressourceforbrugende og i stigende grad spørgsmålstegn etisk. En stor ulempe ved in vitro-cellekulturer er deres begrænsede oversættelse til det menneskelige øje. Resultater opnået fra cellekulturer kan være inkongruous til in vivo betingelser, fordi cellerne kan gennemgå endotel mesenchymal Transition (EMT), hvilket resulterer i fibroblast-lignende morfologi forårsaget af tab af celle polaritet og ændringer i celle form og gen udtryk2.
Der henviser til, at tidligere ex vivo-modeller rapporterede dyrkningsperioder på op til kun 120 h, en ny forberedelses teknik til at etablere en endotel organ kulturmodel af svine horn ved dyrkning af fersk gris hornhinder i mindst 15 dage, blev for nylig introduceret3 ,4,5,6. Hvis cornea epitel og dele af stroma fjernes (ca. 300 μm i alt) fra hornhinden før dyrkning, er hævelse af stroma reduceret i Split cornea-knapper, hvilket resulterer i mindre endotel celle tab og en velholdt endotel cellelaget efter op til 15 dage, hvorimod ikke-opdelte cornea-knapper viser signifikant endotelcelletab på grund af ujævn strin ende hævelse og dannelse af afkalktes folder. Øjen banker bruger normalt osmotiske deswelling agenter såsom dextran at reducere hævelse af hornhinder før transplantation. Men, disse agenter viste sig at inducere øget endotelcelletab7,8,9.
Denne artikel har til formål at visualisere denne standardiserede ex vivo forskningsmodel i en detaljeret trin-for-trin protokol for at gøre det muligt for fremtidige efterforskere til at udføre forskning på cornea endotelet ved hjælp af Split cornea knapper. Denne model repræsenterer en enkel metode til at teste stoffer og teknikker, der anvendes i øjet, såsom oftalmisk viskoelastisk udstyr, vandings løsninger, og ultralyd energi, eller andre procedurer, hvor hornhinden endotelet er af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger vores institutions etiske retningslinjer. I overensstemmelse med vedtægterne for vores institutions etiske undersøgelsesudvalg skulle der ikke indhentes etisk godkendelse forud for forsøgene, da alle svine horn blev indhentet fra det lokale slagteri.
1. organ kultur
- Forbered grise øjne.
- Fra det lokale slagteri, få grise øjne, der blev fjernet kort efter slagtning, men før termisk behandling. Transportere øjnene til laboratoriet og behandle dem inden for et par timer. Under transporten skal du holde øjnene ved stuetemperatur (ca. 21 °C) inden behandling.
- Fjern alle orbital adnexes (øjenmuskler, conjunctiva, fedtvæv) før desinfektion ved hjælp af øjen saks og Colibri pincet. Adskil og Kassér alle øjne med åbenlyse traumer, ydre skader (f. eks. kniv udskæring) eller synlige cornea-opacities.
- Forbered en 5% jod-PBS-opløsning (1:20) i et sterilt bæger ved at tilsætte 3 mL 7,5% povidon jod til 57 mL af en phosphatbufferet saltvandsopløsning (PBS). Forbered også en separat steril kop indeholdende 60 mL Pure PBS.
Bemærk: den totale mængde af brugt jod-PBS-opløsning og størrelsen af koppen afhænger af antallet af hornhinder, der skal dissekteres. Fem til seks øjne kræver, at ca. 60 mL af 5%-jod-PBS-opløsningen desinficeres korrekt. - Sæt fem til seks øjne i 5%-jod-PBS opløsning til i alt 5 min til korrekt desinficere øjnene ' overflade. Rør forsigtigt hvert minut for at sikre, at øjnene over fladen er helt nedsænket og desinficeret fuldstændigt i jod-opløsningen.
- Efter 5 min, overføre de desinficeres øjne til den forberedte kop fyldt med ren PBS. Igen, omhyggeligt røre for at sikre jod-PBS-opløsning vaskes væk fra øjnene ' overflade.
Bemærk: Udfør dette trin på en ren bænk for at forhindre kontaminering af de desinficeres øjne.
- Forbered cellekultur plader.
Bemærk: Udfør følgende trin på en ren bænk med konstant laminar luftstrøm.- Tø 2 mL føtal kalveserum (FCS). Fyld en sprøjte (5 mL) med FCS ved hjælp af en stump kanyle. Tøm sprøjten gennem et sprøjte filter (0,22 μm) for at forhindre eventuel bakteriel forurening af FCS i 80 mL dextran-fri kulturmedium I (mindste essentielle medium [MEM] med Earles salte, penicillin/streptomycin, L-glutamin [200 mM], amphotericin B [250 μg/mL], Hepes-buffer [1 M] [50x], NaHCO3og destilleret vand). Blande blandingen for at sikre jævnt substrat fordeling.
- Fyld hver brønd af en 12 brønd cellekultur plade med 3 mL substrat blandingen.
- Udfør dissektion og inkubation.
Bemærk: Udfør dette trin på en ren bænk. Rør ikke ved cornea-endotelet med nogen instrumenter.- Overføre en øjen pære fra koppen med PBS ind i øjet pære holder med hornhinden opad og placere den under en oftalmisk kirurgisk mikroskop. Brug en sprøjte fyldt med 0,9% NaCl til lidt at anvende nogle sug til øjet over øjepæren holderen til at fikat øjet i position til dissektion.
- Brug en trefin (ø 7,5 mm), der indeholder et standardiseret indlæg, som sikrer, at den træede dybde ikke overstiger 300 μm, til at skære overfladisk ind i det centrale hornhinden (figur 1a).
- Brug Colibri pincet og en engangs skalpel med en trekantet klinge til at klippe og fjerne den delvist trævede del af hornhinden vandret gennem stroma. Kassér den separerede cornea-del bestående af cornea-Epitelet, Bowman-laget og en del af stroma.
Bemærk: strengt opretholde den horisontale skæring retning for at opnå en jævn tykkelse af de resterende stroma. - Overfladen placeres en 10-0 sutur (10-0 polyamid 6) i stroma for at kunne differentiere endotel fra stromale side under forsøgene (figur 1B). Undgå penetration af cornea endothelium. Kassér øjepæren, hvis endotelet er trængt ind.
Bemærk: penetration af cornea-endotelet med den suturende nål vil være synlig, da væske fra det forreste øjenkammer vil lække gennem sutur kanalen. - Brug trefin uden Inlay til at fremme den tilskårne udskæring til fuld dybde, indtil det forreste øjenkammer er nået (figur 1C). Et særskilt fald i resistens og væskelækage fra den forreste øjenkammer kan opfattes efter fuldstændig penetration af hornhinden.
Bemærk: Brug en hockey kniv, hvis knappen Opdel cornea forbliver fastgjort på den ene side af Split cornea-knappen efter trephination. - Overfør den opnåede split cornea-knap, der nu består af en del af stroma (figur 2), Descemets membran og cornea-endothelium, ind i dyrkningsmediet (kulturmedium i + FCS, se punkt 1,2) i 12-brønden cellekultur pladen med side nedad, så cornea-endotelet vender opad.
Bemærk: Hvis endotelsiden vender nedad, kan endotelet blive beskadiget. - Tildel et individuelt nummer til hver split cornea-knap til identifikation under follow-ups og mærk brøndene på cellekultur pladen i overensstemmelse hermed.
- De fyldte cellekultur plader inkubates i en inkubator under standardforhold ved en temperatur på 37 °C, 5% CO2 og en relativ luftfugtighed på 95%. Skift kulturmediet (kulturmedium I + FCS) på dag 8, hvis inkubationsperioden på 7 dage overskrides.
Bemærk: inkubations proceduren ved hjælp af Split cornea-knapper er blevet valideret i op til 15 dage.
Figur 1: dissektion af svine horn for at opnå split cornea-knapper. (A) efter udmejsling af hornhinden ved hjælp af en trefin med en Inlay til at skære i en dybde på 300 μm og fjernelse af epitelet og dele af det stromale væv, (B) en sutur anbringes overfladisk i stroma uden penetration af hornhinden endotelet til senere identifikation af stromale side. C) fuld udmejsling af den resterende hornhinde efterfølges afd) fjernelse af den opnåede split cornea-knap fra øjepæren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. mikroskopi og undersøgelse af endotelet
- Udføre uplettet undersøgelse.
Bemærk: uplettet undersøgelse kan udføres flere gange (f. eks. ved ugentlige opfølgninger på dag 1, 8 og 15). Men uplettet optælling tillader kun vurdering af endotel celletæthed, ikke morfologiske parametre.- Fyld 3 mL hypotonisk afbalanceret saltopløsning (hBSS, se komposition i tabel over materialer) i hver brønd af en 12 brønd cellekultur plade. Placer forsigtigt en enkelt split cornea-knap i hBSS for at fremkalde hævelse af cornea-endotelcellerne og forbedre synligheden af cellerne for celletælling.
Bemærk: Sørg for, at endotel siden vender retningen af mikroskopet. Hvis der anvendes et inverteret fasekontrast mikroskop, skal endotelsiden vende nedad. Mens den er på plads, bør kultur pladen ikke flyttes for at forhindre endotelcelle skader. - Lad cellerne svulme op til 1-2 min før du tager et billede af endotelet med kameraet fastgjort til mikroskopet. Tag mindst tre fotografier af mindst tre forskellige områder for at opnå et repræsentativt indtryk af den faktiske tilstand af cornea endothelium. Tilføj en skala bjælke med den sande til skala længde på 100 μm til senere analyse af cornea endotel celletæthed og morfologiske parametre.
- For at forhindre osmotisk beskadigelse skal du fjerne split cornea-knappen fra Hbu'erne efter højst 5 min. og overføre den tilbage til kulturmediet3.
- Fyld 3 mL hypotonisk afbalanceret saltopløsning (hBSS, se komposition i tabel over materialer) i hver brønd af en 12 brønd cellekultur plade. Placer forsigtigt en enkelt split cornea-knap i hBSS for at fremkalde hævelse af cornea-endotelcellerne og forbedre synligheden af cellerne for celletælling.
- Udføre farves undersøgelse.
Bemærk: farvning afslutter forsøgene, da de anvendte farvnings stoffer er cytotoksiske. Derfor kan farvning kun foretages ved udgangen af observationsperioden for vurdering af morfologiske parametre (reformation tal, Rosette formationer, alizarin røde farvede celler).- Forbered en 0,25% trypan og et blå opløsning og 0,2% alizarin Red S opløsning til farvnings proceduren.
- For 0,25% trypan og et blå opløsning fortyndes 0,4% trypan og et Blue-opløsningen med en 0,9% NaCl-opløsning.
Bemærk: for eksempel for at få 20 mL af en 0,25% trypan og et blå opløsning fortyndes 12,5 mL af den 0,4% trypan og et blå opløsning med 7,5 mL af 0,9% NaCl-opløsningen. Trypan og et Blue-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger eller måneder. - For at opnå en 0,2% alizarin Red S opløsning opløses 100 mg af alizarin rødt pulver i 50 mL af en 0,9% NaCl-opløsning under konstant omrøring og opvarmning til 50 °C på en magnet omrørings plade med varmefunktion. For at fjerne mulige bundfald, filtrere den opnåede opløsning. PH-værdien af alizarin Red S-opløsningen justeres til pH 4,2 ved tilsætning af natriumhydroxid eller saltsyre i overensstemmelse hermed.
Bemærk: før hver påføring af alizarin Red S-opløsningen skal du sørge for, at pH-værdien korrigeres til 4,2, og at der ikke er bundfald i opløsningen. Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur. Opløsningen må ikke opbevares i mere end 4 uger.
- For 0,25% trypan og et blå opløsning fortyndes 0,4% trypan og et Blue-opløsningen med en 0,9% NaCl-opløsning.
- Placer de opdelte cornea-knapper i Petri skåle med endotel siden opad for at plette endotelcellerne. Brug en pipette til langsomt at dryppe 0,25% trypan og et blå opløsning dråbe ved dråbe på cornea endotelet for 90 s.
Bemærk: Trypan Blue gør det muligt at identificere beskadigede cornea-celler med en permeabel membran, fordi det pletter deres kerner. - Skyl forsigtigt den opdelte cornea-knap 3x i 0,9% NaCl i et lille bægerglas. Igen, brug en pipette til langsomt at dryppe 0,2% alizarin rød S-opløsning falde ved dråbe på cornea endotelet for 90 S.
Bemærk: alizarin røde pletter på descemetets membran, som hjælper med at fremhæve cellekanter i ubeskadigede cornea-endotelceller og fremhæve ødelagte celler, når den underliggende membran bliver synlig. Det gør det også nemt at identificere større ødelagte områder. - Til undersøgelse af den farvede cornea endotelet følge trinene forklaret for uplettet optælling i afsnit 2,1.
- Forbered en 0,25% trypan og et blå opløsning og 0,2% alizarin Red S opløsning til farvnings proceduren.
3. analyse af cornea endotel celletæthed og morfologiske parametre
- Project tæller kvadrater på billederne ved hjælp af en grafik redigeringssoftware (tabel over materialer).
- Åbn softwaren og Åbn et billede af cornea endotelet ved at vælge fil | Åben | Vælg.
- Projicer en firkant med en sand for at skalere sidelængden på 100 μm på billedet.
Bemærk: følgende trin i afsnit 3.1.2 kan ignoreres, hvis visnings softwaren giver mulighed for projicering af optælling af firkanter på billedet. Sidelængden på firkanten afhænger af opløsningen af de billeder, der er taget med mikroskopets kamera, og kan beregnes med skala bjælken.- Beskær skala bjælken fra fotografiet, der er taget med mikroskopet: Vælg det rektangulære markeringsrammeværktøj på værktøjslinjen, eller tryk på M, og derefter på Skaler bjælken, og vælg derefter Rediger | Beskær eller tryk på CTRL + X.
- Klik på filer | Ny (eller tryk på CTRL + N). Vælg Udklipsholder på rullelisten dokument type i det kommende vindue. Antallet af viste pixels er sidelængden på optællings pladsen. Noter de tilsvarende pixel for de andre billeder, og klik på OK.
- Vælg fil | Ny (eller CTRL + N). Indsæt bredde og længde (i pixels) af tælle pladsen i det kommende vindue i henhold til længden af skalaen bar. Vælg baggrundsfarve hvid, og tryk derefter på OK.
- Klik på Vælg | Vælg alle (eller CTRL + A). Vælg Rediger | Kopier (eller CTRL + C).
- Vælg billedet af cornea endotelet åbnet i trin 3.1.1. Vælg Rediger | Indsæt (eller CTRL + V) for at indsætte firkanten på billedet af cornea endothelium.
- Vælg kvad ratets lag og justere gennemsigtigheden. Vælg lag | Lagtype | Blandingsindstillinger | Angiv opacitet til 30% | Det er okay.
- Gem billedet med den projicerede firkant med en True til at skalere sidelængden på 100 μm. Gentag med de andre billeder, der er nødvendige til analyse.
- Vurder endotel celletæthed og morfologiske parametre.
- Åbn billederne med de projekterede firkanter i ImageJ (version 1.50 i), og brug CellCounter-plugin'et til at tælle cellerne i firkanten. Åbn ImageJ, Vælg fil | Åbn (eller CTRL + O) | Vælg billede.
Bemærk: ImageJ og CellCounter PlugIn er freeware tilgængelige for download online. - Vælg plugins | Cell_Counter | Celle tæller | Initialiser. Tæl endotheliale celler og registrere resultatet. På to sider af pladsen, tælle de celler, der skæres af kvadratens kant. Tæl ikke afskårne celler på de to andre sider.
- Analysér mindst seks kvadrater pr. hornhinde fra forskellige områder (f. eks. tre billeder, to firkanter pr. billede), og Bestem den gennemsnitlige endotelencelle tæthed for cornea pr. kvadrat (100 μm2). Ekstrapolere endotel celletætheden pr. 100 μm2 til 1 mm2 ved at gange med 100.
- Åbn billederne med de projekterede firkanter i ImageJ (version 1.50 i), og brug CellCounter-plugin'et til at tælle cellerne i firkanten. Åbn ImageJ, Vælg fil | Åbn (eller CTRL + O) | Vælg billede.
- Til vurdering af morfologiske ændringer, tælle reformationen tal (fælles møde på ≥ 4 celler/cellegrænser i stedet for tre), Rosette formationer (karakteristisk Rosette-formet udseende, fem eller flere radialt arrangeret celler omkring en ødelagt celle ), eller alizarin røde områder (ødelagte celler) i de projekterede kvadrater.
Bemærk: Alternativt kan det være nyttigt at bruge større firkanter (f. eks. 200 x 200 μm2) til morfologisk analyse i velbevarede prøver for at opnå mere repræsentative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede dissektions teknik indebærer delvis fjernelse af stromale væv, hvilket resulterer i en tyndere cornea prøve og dermed mindre stromale hævelse (figur 1 og figur 2). Mindre stromale hævelse inducerer mindre forskydning og knibe kræfter, der har en negativ indvirkning på cornea endothelium, dermed forårsager lavere endoteliale celle tab satser6. Split cornea-knapper viser et signifikant bedre bevaret endotel-cellelag efter 15 dages dyrkning sammenlignet med ikke-opdelte cornea-knapper og hele korneosclerale prøver, hvilket afspejler mindre endotel-celletab og et lavere antal reformationen tal (≥ 4 celler/cellekanter blev sammenføjet i stedet for tre), Rosette formationer (fem eller flere radialt arrangerede celler, der mødes på et enkelt sted) og alizarin røde (ødelagte) celler efter 15 dage6.
Over en periode på 15 dage viser split cornea-knapper et støt fald i endotelcellernes densitet med et gennemsnitligt ugentligt procental endothelialcelletab på 4,90% (n = 40, figur 3). Start på dag 1 med en endotelcelle tæthed på 4.033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% quartiles) faldt celletætheden til 3.850 ± 167/233 celler/mm2 på dag 8 og 3.650 ± 200/233 celler/mm2 på dag 15. Bestemte celle tab var ens for den første og anden uge. På dag 1 − 8, 4,00 ± 2.17/1.93% (median ± 25%/75% quartiles); dag 8 − 15, 4,88 ± 5.52/4.42%; dag 1 − 15, 8,64 ± 4.32/2.71%). Således er den givne tilbagegang sats svarer til den sats, der indberettes i human donor hornhinder under dyrkning i tidligere undersøgelser10,11,12.
Morfologiske parametre blev vurderet efter farvning af endotel cellelag på dag 15 (n = 28, figur 4). Reformation-tallene består af 7,18 ± 2.36/2.90% (median ± 25%/75% quartiles) af de fusionerende cellekanter. En median på 1,11 ± 1.11/15.56 Rosette formationer/mm2 (median ± 25%/75% quartiles) var til stede i de undersøgte prøver, hvorimod 13,33 ± 4.44/11.67 alizarin røde bejdsede celler/mm2 (median ± 25%/75% quartiles) markerede punktuelle celletab.
Figur 5 giver repræsentative billeder af cornea-endotelet under mikroskopisk evaluering i hbss (figur 5A) og efter farvning med trypan og et Blue og alizarin Red S (figur 5B). Vurderingen af endotelcellernes tæthed i Hbu'erne kan udføres flere gange (f. eks. på dag 1, 8 og 15), hvorimod farvede prøver kan anvendes til vurdering af morfologiske parametre (reformation, Rosette formationer, alizarin rød bejdset celler) eller bestemmelse af endotel celletæthed ved afslutningen af forsøgene på grund af de cytotoksiske egenskaber af de fleste farvning stoffer.
Hvis de opdelte cornea-knapper anbringes og dyrkes med endotelsiden nedad ved et uheld, kan der forventes omfattende endotelcelle skader (figur 6A). Ikke-opdelte cornea-knapper lider signifikant øget endotelcelletab som følge af stromale hævelse, hvilket medfører, at Descemets membran foldes over 15 dages dyrkning (figur 6B), hvorimod split cornea-knapper viser en stort set bevaret cornea endotelet efter 15 dages dyrkning, indikeret af spredte punktuelle alizarin røde farvede områder, der indikerer enkelt ødelagte celler (figur 6C).
Figur 2: skematisk illustration af ikke-opdelte cornea-knapper og split cornea-knapper. Efter fjernelse af 300 μm af svin hornhinden, herunder epitel og store dele af det stromale væv, tykkelsen af Split cornea knapper er reduceret til fordel for bedre bevaring af cornea endotelet på grund af nedsat stromale hævelse i hele dyrkning på op til 15 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Endothelial celletæthed (ECD) af Split cornea-knapper over 15 dage. Split cornea-knapper (n = 40) viste en støt nedgang. ECD på dag 1, 4.033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% quartiles); dag 8, 3.850 ± 167/233 celler/mm2; dag 15, 3.650 ± 200/233 celler/mm2. Data er afbildet som median ± 25%/75% quartiles, whiskers repræsenterer enten minimum og maksimum eller 1,5 af interkvartil intervallet (IQR). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: morfologiske parametre for yderligere evaluering af celleskader og omorganisering processer. Mikroskopiske fotografier af cornea endotelet i 400x forstørrelse efter 15 dages dyrkning og farvning med trypan og et blå og alizarin Red S viser (A) reformationen tal (pile, fælles møde af fire eller flere celler/cellekanter i stedet for tre), (B) Rosette formationer (punkteret cirkel, central aftagende celle med karakteristiske Rosette formationer af fem eller flere tilstødende celler) og (C) alizarin røde farvede celler (stiplede cirkler, ødelagte celler). Data (n = 28) er afbildet som median ± 25%/75% quartiles. Whiskers repræsenterer enten minimum og maksimum eller 1,5 af interkvartil området (IQR). Cirkler repræsenterer outliers ikke inden for IQR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: uplettet og plettet cornea endothelium. Endotel cellelag som set under mikroskopisk evaluering (400x forstørrelse) i (A) hypotonisk afbalanceret saltopløsning (hbss) forårsager endotel celle hævelse og dermed bedre celle synlighed og (B) efter farvning med trypan og et blå og alizarin Red S. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Oversigt fotografier af cornea-endotelet af (a) en split cornea-knap, der er opdyrket på hovedet, (B) en ikke-opdelt cornea-knap, og (C) en split cornea-knap efter farvning. Fotografier viser cornea-endotelet efter farvning med trypan og et Blue og alizarin Red S.a) der observeres omfattende cornea-endotelcelleskader (rødt område), efter at der er dyrket split cornea-knapper med endotelsiden nedad efter en uge af dyrkning. B) signifikant forøget endotelcelle beskadigelse i ikke-opdelte cornea-knapper på grund af afstikning af Descemets membran og stromale hævelse efter 15 dages dyrkning (røde striber). (C) split cornea-knapper viser et velbevaret endotelcellelag efter 15 dages dyrkning, der kun viser punktlig ødelagte celler set i alizarin røde farvede områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en metode til fremstilling af svin split cornea-knapper, som repræsenterer en standardiseret og billig ex vivo cornea endotel organ kulturmodel til forskningsformål6. Porcin split cornea-knapper viste et fald i endotel celletætheden, der kan sammenlignes med endotelcelletab observeret i human donor hornhinder dyrket i øjen banker over en to-ugers periode6,10,11, 12.
Overlegenhed over ikke-opdelte cornea-knapper samt hele Porcin-korneosclerale prøver blev tidligere vist6. I denne undersøgelse blev tre grupper sammenlignet på dag 1, 8 og 15. Cornea endotelet af alle grupper (corneoscleral knapper, ikke-split cornea knapper, split cornea knapper) var i god stand på dag 1, repræsenteret ved en velbevaret endotel celle lag6. Men, på grund af stromale hævelse, foldning af Descemets membran ødelagt store områder af endotelet af hele corneoscleral prøver, således at en repræsentativ vurdering af cornea endotel celletæthed på dag 8 og 15 ikke kunne udføres. Selv om endotelet af de ikke-opdelte hornhinde knapper var godt bevaret indtil dag 15, nogle Descemets membran folder var også til stede. Selvom sammenlignet med de corneosclerale prøver endotel cellelag af ikke-split hornhinden knapper var i bedre stand, endotel cellelag af Split cornea knapper var i langt bedre stand. Dette kan ses i kvantitative og kvalitative parametre, da endotel celle tabet inden for 15 dages dyrkning var signifikant højere (p = 0,041) i ikke-opdelte cornea-knapper (-575 ± 25/250 celler/mm2) sammenlignet med split cornea-knapper (-417 ± 138/179 celler/mm2), som er sammenfaldende med de fastsatte morfologiske egenskaber, der er tydelige i et mere regelmæssigt hexagon celle mønster, færre reformationen figurer og Rosette formationer samt færre ødelagte celler (alizarin røde områder) i Split cornea-knapper6. Procental endotheliale celletab bekræfter disse fund, da det procentale celle tab inden for 15 dage i ikke-opdelte og opdelte cornea-knapper er 14,89% og 10,2% (p = 0,032) henholdsvis6. Da denne metode blev valideret i en periode på op til 15 dage, giver den mulighed for længere observationsperioder end offentliggjorte undersøgelser indtil videre (72 til 120 h)3,4,5.
Forbedringerne i bevarelsen af endotelcellelag, anvendelse af fælles dyrknings protokoller, der også anvendes i øjen banker, kan udelukkende tilskrives den reducerede hævelse af hornhinden stroma, da en stor del (300 μm) af stroma fjernes før dyrkning6,13. Normalt stroma tendens til at svulme enormt under dyrkning på grund af sine hydrofile egenskaber og molekyler indlejret i stromale væv14,15. Hævelse, som inducerer shear og klemme kræfter og Descemets membran foldning, som også forårsager mekanisk belastning på cornea endotelet og endotelcelletab, reduceres efter delvis fjernelse af stroma6,10. I modsætning til øjen banker, som ofte bruger osmotiske midler såsom dextran til deswell Human donor hornhinder før transplantation, behøver split cornea knapper ikke osmotisk deswelling16,17. Da kulturmedium suppleret med dextran er kendt for at blive absorberet af cornea endotheliale celler og for at inducere øget celletab7,8,9,18,19 ,20, dyrkning af Split cornea knapper uden dextran (eller andre osmotiske midler) eliminerer så mange negative toksiske faktorer som muligt6. Da dyrkningsmediet ikke suppleres med tilsætningsstoffer i den præsenterede metode, forventes der ingen toksiske påvirkninger forårsaget af noget tilsat stof, hvilket gør denne modelværdi fuld for undersøgelser af biokompatibilitets tests af nye stoffer.
Selvom cornea endotelet er et meget delikat cellelag, og forberedelsen af Split cornea-knapper kræver moderate kirurgiske færdigheder og skånsom håndtering, kan denne teknik være en standardiseret metode til at arbejde med og opnå pålidelige resultater med hensyn til virkninger af forskellige faktorer på cornea endotelet inden for en meget rimelig tidsramme. Ikke desto mindre, der er et par skridt i denne protokol, hvor cornea endotelet er i fare. Naturligvis beskadigede eller uigennemsigtige øjne skal nøje identificeres og kasseres i begyndelsen for at forhindre mulige bias. Desuden skal cornea endotelet altid være uberørt under trephination, dissektion, ekstraktion og håndtering (f. eks. overførsel fra øje til kultur plade, fra kultur plade til kultur plade osv.) af Split cornea-knapper for at undgå mekaniske skader. Når suturen anbringes overfladisk i stroma, kan endotelet potentielt blive gennemtrængt, hvis nålen ved et uheld indsættes for langt i dybden. Hvis det er tilfældet, vil mærkbar væske fra det forreste øjenkammer passere gennem sutur kanalen, og det tilsvarende øje skal kasseres. For at undgå dette skal nålen holdes overfladisk inden for stroma. Desuden skal man være forsigtig med at opdele cornea-knappen horisontalt ved hjælp af skalpel. Ujævn skæring vil resultere i ujævn hævelse under dyrkning, muligvis forårsager øget endotel celle tab.
Undersøgelsen af ufarvede cornea endotheliale celler i hBSS er almindeligvis udføres i human donor corneas. Der er ingen tegn på signifikant celle skade forårsaget af osmotisk hævelse af endotelcellerne for den valgte undersøgelsestidspunkt for Split cornea-knapper i hBSS3. Selv om farvning øger synligheden af cellekanter, ikke plettet optælling resulterer ikke i signifikant forskellige resultater af endotelcelle tæthed sammenlignet med farvede tælle21. Den klare fordel ved uplettet optælling er, at den giver mulighed for flere opfølgende undersøgelser under hele eksperimenterne, hvorimod farvnings stofferne sædvanligvis er cytotoksiske og afslutter observationsperioden. Plettet tælling er dog stadig vigtigt at vurdere endotelens morfologiske egenskaber. Trypan Blue fremhæver kerner af beskadigede celler, der ofte synes ubeskadiget i uplettet optælling. Alizarin Red S øger tydeligt synligheden af cellekanterne og beskadigede celler ved at farvning af Descemetets membran, hvilket letter vurderingen af endotelcellernes tæthed og gør det muligt at analysere morfologiske egenskaber af cornea-endotelet , såsom reformationen figurer, Rosette formationer, og alizarin røde farvede celler (figur 4).
En væsentlig begrænsning af Split cornea-knapper som en ex vivo-model er, at de ligesom in vitro-modeller kun egner sig til at undersøge ydre påvirkninger af cornea-endotelceller. Derfor er in vivo-modeller uerstattelige for forskning i systemiske sygdomme og tilstande med indvirkning på øjet og cornea endothelium. Uanset, denne forberedelse teknik kan generere gyldige data til afprøvning af virkningerne af forskellige eksterne faktorer på cornea endotelet (f. eks, i biokompatibilitet test af nye stoffer)22. Efter 3R-princippet (udskiftning, reduktion, raffinement) for at reducere antallet af levende dyr eksperimenter, denne metode giver en passende forskningsmodel til yderligere at lukke kløften mellem in vitro cellekulturer, hvor resultaterne er ofte inkongruous til i vivo situation i mennesker, og dyreforsøg, som kræver en betydelig indsats og i stigende grad rejser etiske bekymringer23.
På grund af deres egenskaber og tilgængelighed, svine øjne synes at være den eneste passende erstatning for menneskelige øjne til forskningsformål. Corneas fra ikke-menneskelige primater er ikke et godt alternativ på grund af etiske grunde og tilgængelighed, selv om disse dyr er den nærmeste art til mennesker. På den anden side, øjnene af mindre dyr er simpelthen for små til at tillade effektiv cornea fjernelse. Svine øjne kan sammenlignes med menneskelige øjne i størrelse og viser lignende egenskaber af cornea-endotelcellerne, hvilket også afspejles i forskningen vedrørende eventuel fremtidig xenotransplantation af genetisk modificerede ornesæer24, 25,26. Også, at være et biprodukt af slagterier, de er nemme at opnå.
Afslutningsvis, den præsenterede metode ved hjælp af svin hornhinder tilbyder en meget reproducerbar organo-typisk dyrket forskningsmodel muliggør omkostningseffektiv forskning på cornea endotheliale celler. Fremtidige undersøgere kan bruge split cornea knapper til at analysere virkningerne af forskellige faktorer såsom nye stoffer, kirurgiske teknikker, udstyr, og andre mulige ydre påvirkninger, hvor cornea endotelet er af stor interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Etableringen af den præsenterede forskningsmodel blev støttet af KMU-Inno (FKZ: 13GW0037F) fra Forbundsministeriet for undervisning og forskning Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
