Summary
כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.
Abstract
המחקרים הניסיוניים על תאי הקרנית. משויכים למספר קשיים קרניות של תורמים אנושיים נדירות ולעיתים רחוקות זמינות לחקירות נסיוניות כאשר הן נחוצות בדרך כלל להשתלה. תרביות תאים אנדותל לעתים קרובות לא לתרגם היטב במצבים vivo. בשל המאפיינים הביוקונסטרוקטיבי של הקרניות הבלתי-אנושיות, מסטרומה נפיחות במהלך הטיפוח-תרגול גורם לאובדן משמעותי של תאי הקרנית, מה שמקשה על הטיפוח-תרגול למשך זמן ממושך. סוכני deswelling כגון תוספי משמשים כדי לנטרל תגובה זו. עם זאת, הם גם גורמים לאיבוד משמעותי בתאי האנדותל. לכן, מודל תרבות vivo לשעבר האיברים אינו דורש הוקמה סוכנים. עיני חזיר מבית המטבחיים המקומי שימשו להכנת כפתורי הקרנית מפוצל. לאחר הסרת הקרנית חלקית, השכבות החיצוניות של הקרנית (אפיתל, שכבת באומן, חלקים של משתית) הוסרו. זה מפחית באופן משמעותי את האובדן של תא אנדותל הקרנית הנגרמת על ידי נפיחות מסיבית של הממברנה וקיפול הקרום של האמת לאורך תקופות הטיפוח הארוך יותר ומשפר את השימור הכללי של שכבת התא האנדותל. מעקב אחר הקרנית מלאה לאחר מכן ההסרה של כפתור הקרנית מפוצל מנורת העין הנותרים וטיפוח. צפיפות התא של האנדותל הוערך בשעות המעקב של עד 15 יום לאחר ההכנה (כלומר, ימים 1, 8, 15) במיקרוסקופ אור. טכניקת ההכנה המשמשת מאפשרת שימור טוב יותר של שכבת התא האנדותל, המופעלת על-ידי נפיחות ברקמות פחות מסטרומה, דבר הגורם לירידה איטית וליניארית בקצב הקרניות המפוצל בהשוואה לקרניות של תורמים אנושיים. כמו זה מודל אורגאנו-בדרך כלל מעובד מחקר בפעם הראשונה מאפשר טיפוח יציב לפחות שבועיים, זה חלופה רבת ערך לקרנית התורם האנושי לחקירות עתידיות של גורמים חיצוניים שונים לגבי השפעות. על האנדותל הקרנית
Introduction
השתלת הקרנית הליכים הם בין השתלות הנפוצות ביותר ברחבי העולם1. מאחר שקיים מחסור חמור בקרניות של תורמים אנושיים, מחקר ניסיוני מטפל בתאי הקרתל של הקרניות בקרנית אנושית קשה לביצוע1. עם זאת, המבוא של פתרונות השקיה וחומרים אחרים המשמשים בתוך העין, מכשירים למדידת התקשות אופטלמולוגית, כמו גם מכשירים כירורגיים וטכניקות (למשל, מכשירים וטכניקות phacoאמולסיה, אנרגיית אולטרסאונד) דורש חקירה חוקית ונרחבת בנוגע להשפעות שלהם על האנדותל הקרנית לפני שימוש קליני.
מעטים האלטרנטיבות לקרניות. התורמות של האדם למחקר מודלים מחקר בעלי חיים הם בעלי ערך רב, אבל באותו זמן מאוד משאבים רב והוא נחקר יותר ויותר מבחינה אתית. החיסרון העיקרי של תרביות תאים מבחנה הוא התרגום המוגבל שלהם לעין האנושית. התוצאות שהתקבלו מתרבויות התא יכול להיות לא מתאים בתנאים vivo, כי תאים עשויים לעבור מעבר אנדותל mesenchymal (האמבולנס), וכתוצאה מכך פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה הנגרמת על ידי אובדן של קוטביות התאים ושינויים בצורת תא גן ביטוי2.
ואילו הדגמים הקודמים vivo ex דיווחו על תקופות הטיפוח של עד רק 120 h, טכניקת הכנה הרומן כדי להקים מודל הקרנית של הקרניות האנדותל של הגוף על ידי הקרנית החזיר טרי לפחות לאחר 15 ימים הוצג לאחרונה3 ,4,5,6. אם אפיתל הקרנית וחלקים של משתית מוסרים (כ 300 יקרומטר בסך הכל) מן הקרנית לפני הטיפוח, נפיחות של משתית מופחת לחצני הקרנית מפוצל וכתוצאה מכך אובדן התאים האנדותל ומתוחזק היטב שכבת התא לאחר עד 15 ימים, ואילו לחצני הקרנית לא מפוצל להראות הפסד משמעותי בתאי האנדותל בשל נפיחות סטרומה מחוספס היווצרות של קפלי האמת של. בנקים עין בדרך כלל להשתמש אוסמוטי deswelling סוכנים כגון תוספי כדי להפחית נפיחות של קרניות לפני ההשתלה. עם זאת, סוכנים אלה הוכחו לגרום לאובדן של התאיםהאנדותלמוגברת 7,8,9.
מאמר זה שואפת להמחיש מודל זה vivo ex סטנדרטית לשעבר בפרוטוקול צעד אחר צעד מפורט כדי לאפשר חוקרים עתידיים לבצע מחקר על אנדותל הקרנית באמצעות כפתורי הקרנית מפוצל. מודל זה מייצג שיטה ישירה לבדיקת חומרים וטכניקות המשמשים בתוך העין, כגון מכשירים אלסטיים, פתרונות השקיה, ואנרגיית אולטרסאונד, או הליכים אחרים שבהם מדובר באנדותל הקרנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מלווה את ההנחיות האתיות של המוסד שלנו. בהתאם לחוקים של ועדת הביקורת האתית של המוסד שלנו לא היה צריך לקבל אישור מוסרי לפני הניסויים, כמו כל הקרניות שהתקבלו מהמטבחיים המקומי.
1. התרבות העוגב
- . הכן את עיני החזיר
- מתוך המטבחיים המקומי, להשיג עיניים חזיר שהוסרו זמן קצר לאחר המוות, אבל לפני טיפול תרמי. להעביר את העיניים למעבדה. ולעבד אותם תוך כמה שעות במהלך ההובלה, שמרו את העיניים בטמפרטורת החדר (כ -21 ° c) לפני העיבוד.
- הסר את כל adnexes מסלולית (שרירי העין, לחמית, רקמת האדיפוז) לפני חיטוי באמצעות מספריים העין מלקחיים. להפריד ולמחוק את כל העיניים עם טראומה ברורה, נזק חיצוני (למשל, חיתוך סכין), או להציג הקרניות הקרנית.
- הכינו 5% יוד-PBS-פתרון (1:20) בספל סטרילי על ידי הוספת 3 מ ל של 7.5% povidone יוד ל 57 mL של תמיסת מלח פוספט מאגור (PBS). כמו כן להכין גביע סטרילי נפרד המכיל 60 mL טהור PBS.
הערה: הסכום הכולל של השימוש יוד-PBS-פתרון ואת גודל הספל תלוי במספר של קרניות לגזור. חמש עד שישה עיניים דורשים כ 60 mL של 5%-יוד-PBS-פתרון להיות חיטוי כראוי. - שים חמש עד שש עיניים לתוך 5%-יוד-PBS פתרון עבור סך של 5 דקות כדי לחטא כראוי את פני השטח של העיניים. מערבבים בזהירות כל דקה כדי להבטיח את פני השטח של העיניים הוא שקוע לחלוטין מחוטא לגמרי בתמיסה יוד.
- לאחר 5 דקות, העבר את העיניים החיטוי לגביע המוכן ממולא ב-PBS טהור. שוב, בזהירות מערבבים כדי להבטיח את התמיסה יוד-PBS נשטף הרחק מפני השטח של העיניים.
הערה: בצע צעד זה על ספסל נקי כדי למנוע זיהום של העיניים החיטוי.
- הכן את לוחיות התרבות של התאים.
הערה: בצע את השלבים הבאים על ספסל נקי עם זרימה מתמדת של אוויר שכבתית.- הפשרת 2 מ ל סרום לעגל עוברי (FCS). ממלאים מזרק (5 מ ל) עם ה-FCS באמצעות צינורית קהה. לרוקן את המזרק דרך מסנן מזרק (0.22 μm) כדי למנוע זיהום חיידקי אפשרי FCS לתוך 80 mL של בינונית התרבות ללא דקטרן I (מדיום חיוני מינימלי [הגברת] עם מלחים של ארל, פניצילין/סטרפטומיצין, L-גלוטמין [200 mM], אמפוריטיצין B [250 μg/mL], מאגר Hepes [1 מ'] [50x], נחקו3, ו מים מזוקקים). מתפרעים את התערובת כדי להבטיח גם התפלגות המצע.
- ממלאים כל באר של 12 היטב לוחית התרבות תא עם 3 מ ל של תערובת המצע.
- לבצע ניתוח הדגירה.
הערה: בצע שלב זה על ספסל נקי. אל תגעו באנדותל הקרנית. עם כלים כלשהם- העבר הנורה העין מן הספל עם PBS לתוך מחזיק הנורה העין עם הקרנית פונה כלפי מעלה ולמקם אותו מתחת מיקרוסקופ כירורגי אופטלמולוגי. השתמש מזרק מלא עם 0.9% הנאגל כדי להחיל מעט יניקה על העין על מחזיק נורת העין כדי לקבוע את העין בעמדה לניתוח.
- השתמש טרפין (ø 7.5 מ"מ) המכיל שיבוץ סטנדרטית, אשר מבטיח את עומק הטרפן לא יעלה על 300 μm, כדי לחתוך שטחי לתוך הקרנית המרכזית (איור 1א).
- השתמש מלקחיים co, ו אזמל יחיד לשימוש עם להב משולש כדי לגזור ולהסיר את החלק הטרפלורי חלקית של קרנית אופקית דרך משתית. להיפטר חלק הקרנית מופרדים המורכב האפיתל הקרנית, שכבת באומן, וחלק של הסטרומה.
הערה: לשמור בקפדנות על כיוון החיתוך האופקי כדי לקבל עובי אפילו של הסטרומה שנותרו. - מקום שטחי 10-0 תפר (10-0 פוליאמיד 6) לתוך משתית כדי להיות מסוגל להבדיל את האנדותל מן הסטרומה בצד במהלך הניסויים (איור 1B). למנוע חדירה של. הקרנית האנדותל להשליך את הנורה העין אם האנדותל היא חדרה.
הערה: חדירה של אנדותל הקרנית עם המחט תפירה יהיה גלוי, כמו נוזל מחדר העין הקדמי לדלוף דרך תעלת תפר. - השתמשו בטרפין ללא שיבוץ כדי לקדם את הטרפריק לעומק מלא עד שיגיע לחדר העין הקדמי (איור 1ג). ירידה ברורה בהתנגדות נוזל דולף מן התא העין הקדמי ניתן להיתפס לאחר חדירה מלאה של הקרנית.
הערה: השתמש סכין הוקי אם לחצן הקרנית מפוצל נשאר מחובר בצד אחד של לחצן הקרנית מפוצל לאחר התרפלוקס. - העבר את לחצן הקרנית המפוצל שהושג, המורכב כעת מחלק מסטרומה (איור 2), הקרום של הספר, והאנדותל הקרנית, לתוך מדיום התרבות (התרבות הבינונית I + fcs, ראה סעיף 1.2) לצלחת תרבות התא 12 היטב עם ה מתויג לצד כלפי מטה, כך אנדותל הקרנית פונה כלפי מעלה.
הערה: אם צד האנדותל מפונה כלפי מטה, האנדותל עלול להיפגע. - הקצה מספר בודד לכל לחצן הקרניות המפוצל לזיהוי במהלך עליות המעקב ותייג את הבארות בלוח התרבות של התא בהתאם.
- מודטה את לוחיות התרבות של התאים המלאים בחממה תחת תנאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 ° c, 5% CO2 ו לחות האוויר היחסי של 95%. שנה את מדיום התרבות (בינוני בתרבות I + FCS) ביום 8 אם יש חריגה מתקופת דגירה של 7 ימים.
הערה: תהליך הדגירה באמצעות לחצני הקרנית מפוצל אומת עד 15 ימים.
איור 1: חיתוך של הקרנית חזירי להשיג כפתורי הקרנית מפוצל. (א) לאחר trephination של הקרנית באמצעות טרפין עם שיבוץ לחתוך לעומק של 300 יקרומטר והסרה של האפיתל וחלקים של רקמת סטרומה, (ב) תפר ממוקם שטחי לתוך משתית ללא חדירה של הקרנית אנדותל לזיהוי מאוחר יותר של הצד של סטרומה. (ג) trephination מלא של הקרנית הנותרים ואחריו (ד) הסרת כפתור הקרנית מפוצל השיגה מנורת העין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. מיקרוסקופיה ובחינת האנדותל
- בצע בדיקה בלתי מוכתמת.
הערה: ניתן לבצע בדיקה ללא ויטראז מספר פעמים (למשל, במעקב שבועי ביום 1, 8, ו -15). עם זאת, ספירה בלתי מוכתמת רק מאפשר הערכה של צפיפות התא אנדותל, לא פרמטרים מורפולוגיים.- מילוי 3 מ ל של תמיסת היפוטוניקה מאוזנת מלח (hBSS, ראה קומפוזיציה בטבלה של חומרים) בכל באר של 12 היטב התרבות תא לוחית. בזהירות המקום כפתור הקרנית מפוצל יחיד hBSS לגרום נפיחות של תאי הקרנית אנדותל ולשפר את הניראות של התאים עבור ספירת תאים.
הערה: ודא שהצד האנדותל פונה לכיוון המיקרוסקופ. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגודיות של שלב הפוך, הצד האנדותל צריך להיות פונה כלפי מטה. במקום זאת, אין להזיז את לוח התרבות כדי למנוע נזק לתאי האנדותל. - תן לתאים להתנפח 1-2 דקות לפני נטילת תמונה של האנדותל עם המצלמה המצורפת למיקרוסקופ. קח לפחות שלוש תמונות של לפחות שלושה אזורים שונים כדי לקבל רושם מייצג של המצב הממשי של אנדותל הקרנית. הוסף סרגל קנה מידה עם האמת לאורך קנה המידה של 100 יקרומטר לניתוח מאוחר יותר של צפיפות התא של הקרנית אנדותל ופרמטרים מורפולוגיים.
- כדי למנוע נזק אוסמוטי, להסיר את לחצן הקרנית מפוצל מן hBSS לאחר מקסימום של 5 דקות ולהעביר אותו בחזרה למדיום התרבות3.
- מילוי 3 מ ל של תמיסת היפוטוניקה מאוזנת מלח (hBSS, ראה קומפוזיציה בטבלה של חומרים) בכל באר של 12 היטב התרבות תא לוחית. בזהירות המקום כפתור הקרנית מפוצל יחיד hBSS לגרום נפיחות של תאי הקרנית אנדותל ולשפר את הניראות של התאים עבור ספירת תאים.
- ביצוע בדיקה ויטראז '.
הערה: כתמים מסיים את הניסויים, כמו חומרים מכתים בשימוש הם ציטוטוקסיים. לכן, כתמים ניתן לבצע רק בתום תקופת התצפית להערכת פרמטרים מורפולוגיים (הרפורמציה דמויות, תצורות שושנת, מוכתם אדום תאים אדומים).- הכינו 0.25% טריבן הפתרון הכחול 0.2% אליזרין הפתרון האדום של הליך הצביעת.
- לקבלת הפתרון הכחול 0.25%, דלל את הפתרון הכחול 0.4% באמצעות פתרון כחול של 0.9%.
הערה: לדוגמה, כדי להשיג 20 מ ל של 0.25% מהפתרון הכחול של הפתרון, יש לדלל 12.5 mL של הפתרון הכחול של 0.4%, עם 7.5 mL מתוך הפתרון של 0.9%. הפתרון הכחול עשוי להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות או חודשים. - כדי להשיג 0.2% aliזרין אדום הפתרון התמוססות 100 mg של אבקת S האדום אליזרין 50 mL של 0.9% הפתרון מתחת לערבוב קבוע וחימום כדי 50 ° c על צלחת ערבוב מגנט עם החום הפונקציה. כדי להסיר מאיצים אפשריים, סנן את הפתרון שהושג. להתאים את ה-ph של הפתרון האדום של אליזרין כדי ph 4.2 על ידי הוספת נתרן הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית בהתאם.
הערה: לפני כל יישום של הפתרון האדום האליזרין ודא כי ה-pH מתוקן ל-4.2 ושאין מאיצים בפתרון. הפתרון עשוי להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר. אין לאחסן את הפתרון למשך יותר מ -4 שבועות.
- לקבלת הפתרון הכחול 0.25%, דלל את הפתרון הכחול 0.4% באמצעות פתרון כחול של 0.9%.
- הניחו את לחצני הקרניות הפוצלים במנות פטרי, כשצד האנדותל פונה כלפי מעלה כדי להכתים את תאי האנדותל. השתמש בפיפטה כדי לטפטף באיטיות את 0.25% טריפי הפתרון הכחול ירידה על ידי ירידה אל אנדותל הקרנית עבור 90 s.
הערה: טרילון כחול מאפשר זיהוי של תאי הקרנית פגום עם קרום חדיר כי זה מכתים את הגרעינים שלהם. - לשטוף בזהירות את כפתור הקרנית מפוצל 3x ב 0.9% בתוך מיכל זכוכית קטן. שוב, השתמש בפיפטה כדי לטפטף לאט את 0.2% אליזרין אדום הפתרון ירידה על ידי ירידה אל אנדותל הקרנית עבור 90 S.
הערה: אליזרין אדום כתמי הקרום של האור, המסייע להדגיש את גבולות התאים בתאי הקרנית שאינם תקינים ולהדגיש תאים שנהרסו כאשר הקרום של האור המשמש כבסיס הופך גלוי. כמו כן, היא מאפשרת זיהוי קל של אזורים נהרסו גדולים יותר. - לבדיקה של אנדותל הקרנית המוכתמת בעקבות הצעדים שהוסברו לספירה בלתי מוכתמת בסעיף 2.1.
- הכינו 0.25% טריבן הפתרון הכחול 0.2% אליזרין הפתרון האדום של הליך הצביעת.
3. ניתוח צפיפות תא הקרנית ופרמטרים מורפולוגיים
- Project מספור ריבועים על התמונות באמצעות תוכנת עריכת גרפיקה (טבלת חומרים).
- פתח את התוכנה ופתח תמונה של אנדותל הקרנית על ידי בחירת קובץ | פתח | . בחרובו
- פרוייקט ריבוע בעל אורך מדויק לרוחב הקצה של 100 יקרומטר על התמונה.
הערה: ניתן להתעלם מהשלבים הבאים של מקטע 3.1.2 אם תוכנת הצפייה מאפשרת הקרנת ריבועי הספירה על התמונה. האורך הצדדי של הכיכר תלוי ברזולוציה של התמונות שצולמו עם המצלמה של המיקרוסקופ ניתן לחשב עם סרגל סרגל.- חתוך את סרגל קנה המידה מהתמונה נלקח עם המיקרוסקופ: בחר את הכלי סימון מלבני בסרגל הכלים או הקש M, לאחר מכן הגבול סרגל סרגל, ולאחר מכן בחר עריכה | חתוך או הקש Ctrl + X.
- לחץ על קובץ | חדש (או הקש Ctrl + N). בחלון הקרוב, בחר בלוח ברשימה הנפתחת סוג מסמך . מספר הפיקסלים המוצגים הוא האורך הצדדי של ריבוע הספירה. שים לב לפיקסלים המתאימים לתמונות האחרות ולחץ על הלחצן ' אשר'.
- בחר קובץ | חדש (או Ctrl + N). הוסף רוחב ואורך (בפיקסלים) של ריבוע הספירה בחלון הקרוב בהתאם לאורך סרגל הסרגל. בחר צבע רקע לבןולאחר מכן לחץ על אישור.
- לחץ על בחר | בחר הכל (או Ctrl + A). בחר באפשרות ' עריכה ' | העתקה (או Ctrl + C).
- בחר את התמונה של אנדותל הקרנית שנפתחה בשלב 3.1.1. בחר באפשרות ' עריכה ' | הדבק (או Ctrl + V) כדי להוסיף את הריבוע על התמונה של אנדותל הקרנית.
- בחרו בשכבת הריבוע והתאימו את השקיפות. בחר שכבה | סגנון שכבה | אפשרויות מיזוג | קבעו אטימות ל-30% | . אנימבין.
- שמור את התמונה עם הכיכר המתוכננת עם האורך הנכון עד קנה המידה של 100 μm. חזור על התמונות האחרות הדרושות לניתוח.
- העריכו את צפיפות התא האנדותל ופרמטרים מורפולוגיים.
- פתח את התמונות עם ריבועים מוקרן ב ImageJ (גירסה 1.50 i) ולהשתמש בתוסף CellCounter כדי לספור את התאים בתוך הכיכר. פתח את ImageJ, בחר קובץ | פתח (או Ctrl + O) | בחרו ' תמונה '.
הערה: ImageJ ו-CellCounter PlugIn הם freeware זמין להורדה באינטרנט. - בחר תוספים | Cell_Counter | מונה תאים | . לאתחלאת זה הרוזן את תאי האנדותל ותעד את התוצאה. בשני צידי הכיכר, ספור את התאים החתוכים על-ידי קצה הריבוע. אל תספרו תאים חתוכים. בשני הצדדים האחרים
- לנתח לפחות שישה ריבועים לקרנית מאזורים שונים (למשל, שלוש תמונות, שני ריבועים לתמונה) ולקבוע את צפיפות תא הקרנית הממוצעת לאנדותל לכל ריבוע (100 יקרומטר2). לשער את צפיפות התא האנדותל לכל 100 יקרומטר2 עד 1 מ"מ2 על ידי הכפלת על-ידי 100.
- פתח את התמונות עם ריבועים מוקרן ב ImageJ (גירסה 1.50 i) ולהשתמש בתוסף CellCounter כדי לספור את התאים בתוך הכיכר. פתח את ImageJ, בחר קובץ | פתח (או Ctrl + O) | בחרו ' תמונה '.
- להערכת שינויים מורפולוגיים, ספירת הרפורמציה (מפגש משותף של ≥ 4 תאים/גבולות תאים במקום שלושה), תצורות שושנת עלים (המראה האופייני של שושנת העלים, חמישה או יותר תאים מסודרים בקרינה סביב תא נהרס ), או אליזרין שטחים אדומים (הרסו תאים) בריבועים המוקרנת.
הערה: לחלופין, ייתכן שיהיה שימושי להשתמש בריבועים גדולים יותר (למשל, 200 x 200 יקרומטר2) עבור ניתוח מורפולוגית בדגימות שהשתמרו היטב כדי להשיג תוצאות מייצגות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכניקת החיתוך המוצג מרמז על הסרה חלקית של רקמת סטרומה, וכתוצאה מכך דגימת קרנית דק יותר ובכך מסטרומה פחות נפיחות (איור 1 ואיור 2). הנפיחות פחות מסטרומה גורמת פחות להטות ולצבוט כוחות שיש להם השפעה שלילית על אנדותל הקרנית, ובכך גורם נמוך יותר הפסד תא אנדותל שיעורי6. לחצני הקרניות המפוצלים מציגים שכבת שכבה שנשמרה באופן משמעותי בצורה משמעותית לאחר 15 יום של טיפוח בהשוואה ללחצני הקרניות שאינם מפוצלים ודוגמאות לקרניות שלמות, המשקפות את הפסד התאים הקטן פחות ומספר נמוך יותר של הרפורמציה דמויות (≥ 4 תאים/תא גבולות המאוחדים במקום שלושה), תצורות שושנת העלים (חמישה או יותר מאורגנים בתאים מסודרים במקום אחד), ו aliזרין אדום (נהרס) תאים אחרי 15 ימים6.
במשך תקופה של 15 ימים, לפצל לחצני הקרניות להראות ירידה קבועה בצפיפות התא של האנדותל עם ממוצע שבועי השלישי הפסד של תא של 4.90% (n = 40, איור 3). מתחיל ביום 1 עם צפיפות תא אנדותל של 4,033 ± 146/163 תאים/mm2 (חציון ± 25% רבעוני), צפיפות התא ירד ל 3,850 ± 167/233 תאים/mm2 ביום 8, ו 3,650 ± 200/233 תאים/mm2 ביום 15. תביעות התאים הקבועות היו דומות לשבוע הראשון והשני. בימים 1 עד 8, 4.00 ± 2.17/1.93% (חציון ± 25/75% רבילקלס); ימים 8 עד 15, 4.88 ± 5.52/4.42%; ימים 1-15, 8.64 ± 4.32/2.71%). לפיכך, שיעור הירידה הנתון דומה לקצב המדווח בקרניות של התורמים האנושיים במהלך התרגול במחקרים קודמים10,11,12.
פרמטרים מורפולוגיים העריכו לאחר כתמים של שכבת התא האנדותל ביום 15 (n = 28, איור 4). הרפורמציה דמויות מורכב 7.18 ± 2.36/2.90% (חציון ± 25%/75% רביאולים) של גבולות התא מיזוג. חציון של 1.11 ± 1.11/15.56 שושנת התצורות/mm2 (חציון ± 25%/75% רבעוני) היו נוכחים בדגימות שנחקרו, בעוד 13.33 ± 4.44/11.67 אליזרין אדום ויטראז ' תאים/mm2 (חציון ± 25% ברבילקלס) מסומנים הפסדים תאים דייקנים.
איור 5 מספק תמונות מייצגות של האנדותל הקרנית במהלך הערכה מיקרוסקופית ב hBSS (איור 5א) ולאחר כתמים עם טריפה כחול ואליזרין אדום (איור 5ב). הערכה של צפיפות התא אנדותל ב hbss ניתן לבצע מספר פעמים (למשל, בימים 1, 8, ו 15), בעוד דגימות מוכתם ניתן להשתמש להערכת פרמטרים מורפולוגיים (הרפורמציה דמויות, שושנת תצורות, אליזרין אדום ויטראז ' תאים) או קביעת צפיפות תא אנדותל בסוף הניסויים עקב התכונות הציטוטוקסיות של החומרים המכתמים ביותר.
אם לחצני הקרניות המפוצל ממוקמים ומעובדים עם הצד האנדותל הפונה כלפי מטה בטעות, נזק לתאי האנדותל הרחב הוא צפוי (איור 6א). לחצני הקרניות ללא פיצול סובלים באופן משמעותי הפסד תא אנדותל בעקבות נפיחות סטרומה, גרימת קיפול הממברנה של הספר מעל 15 ימים של טיפוח (איור 6ב), ואילו לחצני הקרנית מפוצל להראות ברובו נשמר הקרנית אנדותל לאחר 15 ימים של טיפוח, המצוין על ידי הפזורים אזורים בצבע אדום ויטראז ' דייקן המציין תאים הרסו אחד (איור 6ג).
איור 2: איור סכמטי של כפתורי הקרניות שאינם מפוצלים וכפתורי הקרנית מפוצלים. לאחר ההסרה של 300 יקרומטר של הקרנית חזירי, כולל אפיתל וחלקים עיקריים של רקמת סטרומה, העובי של לחצני הקרנית מפוצל מופחת לטובת שימור טוב יותר של אנדותל הקרנית בשל הנפיחות סטרומה ברחבי טיפוח של עד 15 יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צפיפות התא של האנדותל (ECD) של כפתורי הקרניות המפוצלים מעל 15 יום. לחצני הקרניות המפוצל (n = 40) הראו ירידה מתמדת. ECD ביום 1, 4,033 ± 146/163 תאים/mm2 (חציון ± 25/75% רביאולים); יום 8, 3,850 ± 167/233 תאים/mm2; יום 15, 3,650 ± 200/233 תאים/mm2. נתונים מתוארים כחציון ± 25/75% רביאולים, שפקרס מייצגים מינימום ומקסימום או 1.5 של טווח בין רבעוני (IQR). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרמטרים מורפולוגיים להערכה נוספת של נזקי תאים ותהליכי סידור מחדש. תמונות מיקרוסקופיים של אנדותל הקרנית בהגדלה של 400 x לאחר 15 יום של טיפוח וכתמים עם טריפה כחול ואליזרין אדום מראה (א) הרפורמציה דמויות (חיצים, מפגש משותף של ארבעה תאים או יותר או גבולות תא במקום שלוש), (ב) תצורות שושנת העלים (מעגל מנוקד, תא מרכזי הפוחתת עם תצורות שושנת מאפיינים של חמישה תאים סמוכים או יותר) ו (ג) אליזרין אדום מוכתם תאים (עיגולים מקווקווים, הרסו תאים). נתונים (n = 28) מתוארים כחציון ± 25/75% רביאולים. שפקרס מייצגים מינימום ומקסימום או 1.5 של הטווח הבין-רבעוני (IQR). העיגולים מייצגים החוצה. לא בתוך ה-IQR אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בלתי מוכתם ומוכתם בקרנית אנדותל. שכבת התאים האנדותל כפי שנראה במהלך הערכה מיקרוסקופית (400 xהגדלה) ב (א) היפוטוניקה תמיסת מלח מאוזנת (hBSS) גרימת נפיחות תא אנדותל ובכך נראה תאים טובים יותר ו (ב) לאחר צביעת עם כחול טריכאני ואליזרין רד ס' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות של מבט כולל על כפתור הקרנית של (א) לחצן הקרנית מפוצל מעובד הפוך, (ב) לחצן הקרנית לא מפוצל, ו (ג) כפתור הקרנית מפוצל לאחר כתמים. תמונות להראות את האנדותל הקרנית לאחר כתמים עם טריפה כחול ואליזרין אדום (A) נזק מקיף בתאי הקרנית (אזור אדום) הוא ציין לאחר לחצני הקרנית מפוצל מעובדים עם צד אנדותל הפונה כלפי מטה אחרי אחד שבוע של טיפוח. (ב) הגביר באופן משמעותי את נזקי התאים האנדותל בלחצני הקרניות שאינם מפוצלים בשל קיפול הממברנה של הספר והנפיחות בסטרומה לאחר 15 ימי טיפוח (פסים אדומים). (C) לפצל לחצני הקרניות להראות שכבת התאים אנדותל משומרת היטב לאחר 15 ימים של טיפוח רק מראה תאים הושמדו דייקן לראות באזורים ויטראז אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה להכנת כפתורי הקרנית מפוצל חזירי, אשר מייצגת מודל סטנדרטית ובעלות נמוכה לשעבר הקרנית vivo הקרתל למטרות מחקר6. Porcine לחצני הקרנית לפצל הראה ירידה של צפיפות התא האנדותל הדומה הפסדים התאים האנדותל שנצפו בקרנית התורם האנושי שטיפח בבנקים העין במשך שבועיים6,10,11, . שתיים עשרה
העליונות על פני לחצני הקרניות לא מפוצל, כמו גם בדוגמאות שלמות של הקרניות הוצגו בעבר6. במחקר זה, שלוש קבוצות הושוו בימים 1, 8, ו -15. האנדותל הקרנית של כל הקבוצות (לחצני הקרניות, כפתורי הקרניות הבלתי מפוצלים, כפתורי הקרניות המפוצלים) היו במצב טוב ביום 1, המיוצג על-ידי שכבת תא אנדותל משומרת היטב6. עם זאת, בשל נפיחות בסטרומה, קיפול הקרום של הממברנה השמיד אזורים נרחבים של האנדותל של דגימות קרניות שלמות, כך שהערכה ייצוגית של צפיפות התא של הקרנית בימים 8 ו -15 לא הצליחה להתבצע. למרות האנדותל של כפתורי הקרנית שאינם מפוצלים השתמר היטב עד יום 15, חלק מקפלי הקרום של הספר היו גם נוכחים. למרות ששכבת הקרניות של כפתורי הקרניות הלא מפוצלת הייתה במצב טוב יותר, השכבה התאית של כפתורי הקרניות הייתה במצב הרבה יותר טוב. ניתן לראות זאת בפרמטרים כמותיים ואיכותניים, כגון הפסד התאים האנדותל בתוך 15 ימים של הטיפוח היה גבוה באופן משמעותי (p = 0.041) בלחצני הקרניות שאינם מפוצלים (-575 ± 25/250 תאים/mm2) לעומת כפתורי הקרניות המפוצלים (-417 ± 138/179 תאים/mm2), אשר מתאים למאפיינים מורפולוגיים נחוש להיות בתבנית רגילה יותר משושה בדפוס, פחות הרפורמציה דמויות ותצורות שושנת, כמו גם תאים נהרסו פחות (אליזרין באזורים אדומים) בפיצול כפתורי הקרנית6. את ההפסדים הסלולריים באמצעות התביעות מאשרים את הממצאים הללו, כאשר הפסד התאים בתוך 15 ימים בטווח שאינו מפוצל ומפוצל כפתורי הקרניות הוא 14.89% ו 10.2% (p = 0.032) בהתאמה6. מאחר ששיטה זו אומתה לתקופה של עד 15 יום, היא מאפשרת תקופות תצפית ארוכות יותר מאשר לימודים שפורסמו עד כה (72 עד 120 h)3,4,5.
השיפורים בשימור שכבת התא אנדותל, החלת הפרוטוקולים טיפוח משותף גם בשימוש בבנקים העין, ניתן לייחס בלבד את הנפיחות מופחתת של משתית הקרנית, מאז חלק גדול (300 μm) של משתית מוסר לפני טיפוח6,13. בדרך כלל משתית נוטה להתנפח מאוד במהלך הטיפוח בשל המאפיינים הידרופילי שלה מולקולות מוטבע בתוך רקמת סטרומה14,15. נפיחות, הגורמת להטיה וקמצוץ של כוחות וקיפול הקרום של החומר, הגורם גם למתח מכני על הקרנית אנדותל ולאובדן התאים האנדותל, מופחת לאחר הסרה חלקית של משתית6,10. בניגוד לבנקים עין, אשר לעתים קרובות להשתמש סוכני אוסמוטי כגון דקטרן כדי הקרנית האדם deswell לפני השתלת, לפצל לחצני הקרנית לא דורשים אוסמוטי deswelling16,17. כמו בינוני התרבות בתוספת תוספי ידוע נספג על ידי תאי הקרנית אנדותל ולגרום לאובדן תאים מוגבר7,8,9,18,19 ,20, הטיפוח של לחצני הקרנית מפוצל ללא תוספי (או סוכני אוסמוטי אחרים) מבטלת כמה גורמים רעילים שליליים ככל האפשר6. כאשר המדיום התרבותי אינו מתווסף לתוספים כלשהם בשיטה המוצגת, לא צפויות השפעות רעילות הנגרמות על-ידי חומר מוסף, מה שהופך את המודל הזה לחשוב עבור חקירות של בדיקות ביותאימות של חומרים חדשים.
למרות שאנדותל הקרנית היא שכבת תא עדינה מאוד והכנת כפתורי הקרנית מפוצלת דורשת כישורי ניתוח מתונים וטיפול עדין, טכניקה זו יכולה להיות שיטה סטנדרטית לעבודה עם ולהשגת תוצאות אמינות בנוגע ל תופעות של גורמים שונים על אנדותל הקרנית בתוך מסגרת זמן סביר מאוד. למרות זאת, יש כמה צעדים בפרוטוקול הזה. שהאנדותל של הקרנית נמצאת בסיכון ברור לעין פגום או אטום צריך להיות מזוהה בקפידה מושלך בתחילת למנוע הטיות אפשרי. כמו כן, על אנדותל הקרנית להיות תמיד נשאר ללא שינוי במהלך מיצוי, ניתוח, חילוץ, וטיפול (למשל, העברת מעין ללוח תרבות, מלוח תרבות ללוח תרבות, וכו ') של כפתורי הקרנית מפוצל כדי למנוע כל . נזק מכני כאשר הצבת תפר באופן שטחי בסטרומה, האנדותל עשוי להיות חודר אם המחט מוכנס בטעות רחוק מדי. אם כן, נוזל בולט מן התא העין הקדמי יהיה עובר דרך תעלת תפר ואת העין המתאימה צריך להיות מושלך. כדי למנוע את זה, את המחט צריך להישמר בתוך הסטרומה. יתר על כן, הטיפול יש לנקוט כדי לפצל בקפדנות את כפתור הקרנית אופקית באמצעות האזמל. חיתוך אחיד יגרום לנפיחות לא אחידה במהלך הטיפוח, ואולי גורם לאובדן מוגבר של תאים אנדותל.
בדיקת תאי הקרנית הבלתי מוכתמת של הקרניות ב-hBSS מבוצעת בדרך כלל בקרניות של תורמים אנושיים. אין ראיות של נזק תאים משמעותיים הנגרמת על ידי נפיחות אוסמוטי של תאי האנדותל עבור זמן הבדיקה הנבחר של כפתורי הקרנית מפוצל ב hBSS3. למרות שהכתמים מגביר את הניראות של גבולות התאים, הספירה הבלתי מוכתמת אינה גורמת לתוצאות שונות באופן משמעותי של צפיפות התא האנדותל בהשוואה לספירה של21. היתרון הברור של הספירה הבלתי מוכתמת הוא שהוא מאפשר בדיקות מעקב מרובות במהלך הניסויים, בעוד שחומרים מכתמים הם בדרך כלל ציטוטוקסיים ומסתיימות בתקופת התצפית. ויטראז ', עם זאת, נשאר חשוב להעריך את המאפיינים מורפולוגיים של האנדותל. טרילאן כחול מדגיש את הגרעינים של תאים פגומים, כי לעתים קרובות נראה ניזוק בספירה בלתי מוכתמת. אליזרין אדום מגביר בבירור את הניראות של גבולות התא והתאים הפגומים על ידי צביעת קרום ההדמית, המאפשרת להעריך את צפיפות התא האנדותל ומאפשרת ניתוח של תכונות מורפולוגיות של הקרנית , כגון הרפורמציה הדמויות, תצורות שושנת העין, ו אליזרין ויטראז ' תאים אדומים (איור 4).
הגבלה מרכזית של לחצני הקרנית מפוצל כמו מודל vivo ex היא כי, בדיוק כמו במודלים מבחנה, הם מתאימים רק לחקירת השפעות חיצוניות על תאים אנדותל הקרנית. לכן, במודלים vivo הם ללא תחליף למחקר על מחלות מערכתיות ותנאים עם השפעה על העין ואת אנדותל הקרנית. ללא קשר, טכניקת ההכנה הזו יכולה ליצור נתונים חוקיים לבדיקת ההשפעות של גורמים חיצוניים שונים על אנדותל הקרנית (לדוגמה, בדיקות תאימות של חומרים חדשים)22. לאחר שלושה r-עיקרון (החלפת, הפחתה, עידון) כדי להפחית את מספר ניסויים בעלי חיים חיים, שיטה זו מספקת מודל מחקר הולם כדי לסגור את הפער בין תרביות תאים מבחנה, כאשר התוצאות הן לעתים קרובות לא מתאים ל מצב vivo בבני אדם, מחקר בעלי חיים, אשר דורש מאמצים משמעותיים ויותר ויותר מעלה חששות אתיים23.
בשל התכונות והזמינות שלהם, עיניים חזיר נראה התחליף המתאים רק לעיני האדם למטרות מחקר. קרניות מפרימטים לא אנושיים אינן חלופה טובה בשל סיבות מוסריות וזמינות, למרות שבעלי חיים אלה הם המינים הקרובים ביותר לבני אדם. מצד שני, העיניים של בעלי חיים קטנים הם פשוט קטנים מדי כדי לאפשר הסרת קרנית יעילה. עיניים חזיר הן דומות לעיני האדם בגודל ולהראות מאפיינים דומים של התאים אנדותל הקרנית, אשר משתקף גם במחקר העוסקים בעתיד אפשרי xenotransplantation שתלת של שונה גנטית של קרניות ששונו כמו24, 25,26. כמו כן, להיות תוצר לידי של משחטות, קל להשגה.
לסיכום, השיטה המוצגת באמצעות הקרנית חזירי מציעה מודל מחקר מטופח ביותר בדרך כלל, המאפשר מחקר חסכוני על תאי הקרנית. חוקרי העתיד רשאים להשתמש בלחצני הקרניות המפוצל כדי לנתח את ההשפעות של גורמים שונים כגון חומרים חדשים, טכניקות כירורגיות, ציוד והשפעות חיצוניות אפשריות אחרות, שבהן הקרנית היא בעלת עניין רב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
הקמת מודל המחקר המוצג נתמך על ידי KMU-חדשנות (FKZ: 13GW0037F) של המשרד הפדרלי לחינוך ומחקר גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
