Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Cognate J-домен белки сотрудничать с Hsp70 сопровождающего, чтобы помочь в множество биологических процессов, начиная от белка складывания к деградации. Здесь мы описываем на месте перевязки перевязки, которая позволяет мониторинг этих преходящее сяоченное машиностроения в бактериальных, дрожжей и человеческих клеток.

Abstract

Белки J-домена (JDP) образуют самую большую и разнообразную семейство со-чаперонов в эукариотических клетках. Недавние результаты показывают, что конкретные члены семьи JDP могут образовывать переходные гетерокомплексы в эукариотах для тонкой настройки подложки для 70 kDa теплового шока белка (Hsp70) на основе сопровождающих протеинов дезагрегазы. Комплексы JDP нацелены на острый/хронический стресс, индуцированный агрегированными белками, и, предположительно, помогают собрать дезагрегазы, набирая несколько Hsp70 на поверхность белковых агрегатов. Степень сети контроля качества белка ( P'C), образованная этими физически взаимодействующими JDPs, остается в значительной степени нехарактерной in vivo. Здесь мы описываем на основе микроскопии на основе на месте белка взаимодействия анализ называется близость перевязки анализ (PLA), который способен надежно захватить эти преходяще ежило сформированных комплексов сопровождающего в различных клеточных отсеков эукариотических клеток. Наша работа расширяет занятость НОАК от человеческих клеток до дрожжей(Saccharomyces cerevisiae) и бактерий (Escherichia coli), таким образом, что делает важным инструментом для мониторинга динамики переходно сформированных белковых сборок в обоих прокариотических и эукариотических клеток.

Introduction

Огромное количество геномной информации остается неистолималомируемым из-за нашего неполного понимания клеточных interactomes. Обычные методики обнаружения взаимодействия белка и белка, такие как белок, совместно ездовые с/без химического перекрестного соединения и колокализации белка, хотя и широко используется, представляют собой ряд недостатков. Некоторые из основных недостатков включают плохую количественную оценку взаимодействий и потенциальное введение неместных обязательных событий. Для сравнения, новые методы, основанные на близости, обеспечивают альтернативу и мощный подход к захвату белковых взаимодействий в клетках. Анализ перевязки близости (PLA)1, теперь доступен как собственный комплект, использует антитела специально целевых белковых комплексов, основанных на близости взаимодействующих подразделений.

НОАК инициируется формированием эшафота, состоящего из первичных и вторичных антител с небольшими днк-тегами (зондами НОАК) на поверхности целевого белкового комплекса(рисунок1, шаги 1-3). Далее, определяется близость днк-меток, круговая молекула ДНК генерируется путем гибридизации с разъемом олигонуклеотидов(Рисунок 1, шаг 4). Формирование круговой ДНК завершается шагом перевязки ДНК. Вновь сформированный круговой кусок ДНК служит шаблоном для последующего усиления подвижного круга (RCA) на основе полимеразы цепной реакции (ПЦР) загрунтовать одним из конъюгированных олигонуклеотидов метки. Это генерирует одноцепочечную конкатемерную ДНК-молекулу, прикрепленную к белковому комплексу через эшафот антител(рисунок1, шаг 6). Конкатемерная молекула ДНК визуализирована с помощью флуоресцентно помеченных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с несколькими уникальными последовательностями, разбросанными по усиленной ДНК(Рисунок1, шаг 7)2. Сгенерированный сигнал PLA, который выглядит как флуоресцентная точка(рисунок1, шаг 7), соответствует расположению целевого белкового комплекса в клетке. В результате анализ мог обнаружить белковые комплексы с высокой пространственной точностью. Техника не ограничивается просто захвата белковых взаимодействий, но также может быть использован для обнаружения отдельных молекул или белков изменения на белки с высокой чувствительностью1,2.

Hsp70 образует весьма универсальную систему сопровождающего фундаментально важно для поддержания клеточного белка гомеостаза, участвуя в массиве домашнего хозяйства и связанных со стрессом функций. Деятельность по ведению домашнего хозяйства системы Hsp70 включает складывание белка de novo, перенос белка через клеточные мембраны, сборку и разборку белковых комплексов, регуляцию белковой активности и увязку различных сворачиваний белков/ машины контроля качества3. Та же система сопровождающего также сбрасывает неправильно сложенные/развернутые белки, предотвращает агрегацию белка, способствует дезагрегированию белка и сотрудничает с клеточными протеазами, чтобы деградировать неизлечимо неправильно сложенные/поврежденные белки для облегчения клеточного ремонта после протеотоксические напряжения4,5. Для достижения этого функционального разнообразия, Hsp70 сопровождающий опирается на партнерские со-chaperones семьи JDP и нуклеотидных обменных факторов (NEFs), которые тонкой настройки Hsp70 в ATP-зависимый аллостерный контроль субстрата связывания и релиз3, 6. Кроме того, со-сопровождающие JDP играют жизненно важную роль в выборе субстратов для этой универсальной системы сопровождающего. Члены этой семьи подразделяются на три класса (A, B и C) на основе их структурной гомологии к прототипу JDP, E. coli DnaJ. JDPs класса A содержит N-терминальный J-домен, который взаимодействует с Hsp70, богатым глицином-фенилаланином, областью связывания субстрата, состоящей из цинкового пальца, похожего на область (ЗФЛР) и двух доменов с стволом, а также с доменом димеризации C-терминала. JDPs с N-терминал J-домен и глицин-фенилаланин богатый регион, но не хватает ЗФЛР, попадают в класс B. В целом, члены этих двух классов участвуют в сопровождающих функций. Члены, подпадающие под catchall класса C, который содержит JDPs, которые разделяют только J-домен4, набирать Hsp70s для выполнения различных функций, не связанных с сопровождающим. Важная роль JDPs как взаимозаменяемого распознавания субстрата "адапторы" системы Hsp70 находит свое отражение в расширении членов семьи в процессе эволюции. Например, люди имеют более 42 различных членов JDP4. Эти JDPs функции мономеров, гомодимеры и / или гомо / гетеро олигомеров4,5. В последнее время функциональное сотрудничество через переходное комплексное образование между классом А (например, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) и класс B (например, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotic JDPs, как сообщается, способствует эффективному распознаванию аморфных белковых агрегатов in vitro7,8. Эти комплексы смешанного класса JDP предположительно собираются на поверхности агрегированных белков для облегчения образования Hsp70- и Hsp70-Hsp100-протеиновых дезагрегаз7,8,9, 10. Критические доказательства в поддержку существования этих переходно сформированных смешанных комплексов JDP в эукариотических клетках были предоставлены PLA8.

НОАК все чаще используется для оценки белковых взаимодействий в метазоах, в первую очередь в клетках млекопитающих. Здесь мы сообщаем об успешном расширении этой техники для мониторинга переходно сформированных комплексов сопровождающего в эукариотических и прокариотических одноклеточных организмах, таких как подающий надежды дрожжи S. cerevisiae и бактерия E. coli. Важно отметить, что это расширение подчеркивает потенциальное использование НОАК в обнаружении и анализе микробов, которые инфицируют клетки человека и животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клетки HeLa

  1. Подготовьте следующие материалы: PBS (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мм КХ2PO4),рН 7,4; DMEM, дополненный 10% FCS и 1% Pen-Strep; 4% параформальдегида в PBS; 0,5% Тритон-X100 в PBS; TBS-T (150 мМ NaCl, 20 мм Трис, 0.05% Tween), рН 7,4; 0,0001% стерильный поли-l-лизинный раствор; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера; бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной эффективности фиксации, параформальдегидные растворы должны быть подготовлены свежими перед каждым экспериментом.
  2. Подготовка влажной камеры, покрывая дно закрытой коробки с мокрыми тканями. Поместите влажную камеру при температуре 37 градусов по Цельсию перед началом эксперимента, чтобы обеспечить температуру камеры на уровне 37 градусов по Цельсию при инкубации ферментативных реакций.
  3. Культура HeLa клетки в T25 колбы, в 5 мл DMEM (Высокая глюкоза, глутамат и натрий Pyruvate дополняется) дополнены 10% FCS и 1% Pen-Strep, в 37 C CO2 инкубатор, содержащий 5% CO2. Диссоциативные клетки адептов, используя 0,05% трипсин-ЭДТА. После добавления свежего DMEM для разъединения клеток, подсчитайте клетки с помощью камеры подсчета клеток и растете на диагностических слайдах внутри влажной камеры.
  4. Стерилизовать диагностические слайды с помощью УФ-облучения в стерильной культуре клеток капот в течение 30 минут.
  5. Добавьте 100 л стерильного фильтрованного 0,0001% поли-л-лизина к каждой скважине, необходимой для эксперимента. Инкубировать в течение 30 мин. Смойте избыток поли-L-лизин, промывая каждый колодец 3x с 50 л ультрачистой воды.
  6. Попробуйте клетки HeLa и добавить около 15000 клеток к каждой скважине. При необходимости разбавить клетки, по крайней мере, до 30-50 л DMEM на скважину.
  7. Выращивайте клетки во влажной камере в пределах инкубатора CO2 37 градусов по Цельсию 5% для приблизительно 24 ч. Клетки должны быть 60%-80% сливочные до начала PLA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком высокая выпуклость уменьшает поглощение реагентов, уменьшая полученный сигнал в конце протокола.
  8. Удалите среду, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте скважины 3x с 50 Л Л PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут отделяться, когда жидкости добавляются жестко. Это можно предотвратить, не давая скважины полностью высохнуть, прежде чем добавлять новую жидкость и, добавив новую жидкость осторожно к краю скважины.
  9. Исправьте клетки, добавив 50 л свежеприготовленного 4% параформальдегида в PBS к каждому колодцу. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  10. Вымойте слайды 3x в PBS. Выполните стирки в слайд-окрашивание банку Коплин, содержащий 100 мл PBS. Для каждой стирки, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без тряски.
  11. Permeabilize клеточной мембраны путем погружения слайдов в 100 мл 0,5% Triton-X100 в PBS в Коплин слайд-окрашивания банку. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре без тряски.
  12. Вымойте слайды 3x в TBS-T. Выполните стирки в слайд-окрашивной банке Коплина, содержащей 100 мл TBS-T. Для каждой стирки, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без тряски.
  13. После последней стирки удалите лишний буфер с помощью бумажной бумаги. На данный момент ячейки готовы к протоколу проверки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

2. S. cerevisiae Подготовка клеток

  1. Подготовьте следующие материалы: 100 мМ KPO4, pH 6.5, именуемый Wash Buffer; 37% формальдегида; 4% параформальдегид в 100мМ КПО 4, рН 6,5; 1,2 м сорбитола в 100мМ КПО 4, рН 6,5; литикасный раствор (500 мкг/мл литикса, 20 мм-меркаптоэтанол, 100 мМ КПО4,рН 6,5); 0,0001% поли-L-лизинового раствора; 1% Тритон-X100 в 100мМ КПО 4, рН 6,5; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера (подготовлена как в шаге 1.2); бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной эффективности фиксации, параформальдегидные растворы должны быть подготовлены свежими перед каждым экспериментом.
  2. Выращивайте ночную культуру в неселективном дрожжевом экстракте, Пептоне и Декстрозе (YPD) при 30 градусах Цельсия во время встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных требований S. cerevisiae клетки могут быть выращены в синтетических Полный (SC) среды или селективного синтетического минимального (SM) среды вместо.
  3. Разбавить стационарную культуру доOD 600 из 0,1 в среде 20 мл. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия, пока встряхнись, пока OD600 не достигнет 0,5.
  4. Перенесите культуру 20 мл на центрифугу 50 мл. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приготовьте клетки в 5 мл свежей среды.
  5. Исправить клетки, добавив 550 л 37% формальдегида в культуру. Инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
  6. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Отдохните гранулы в 1 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида в Wash Buffer. Инкубировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
  7. Во время инкубации подготовьте диагностические слайды, добавив 100 л из 0,01% поли-л-лизинового раствора к каждой скважине. Инкубировать горки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. После 30 минут смойте излишки поли-L-лизин ультрачистой водой и дайте горки высохнуть. Сухие горки готовы к использованию.
  9. Вымойте клетки дважды с 1 мл мытья буфера. Выполните моет центрифугирование клеток при 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант и resuspend клетки в мытье буфера.
  10. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приостановите действие клеток в 1 мл 1,2 М сорбитола в wash Buffer.
  11. Пелле клетки центрифугации на 665 х г в течение 3 мин. Удалить супернатант. Приостановите гранулы в 250 л свежеподготовленного раствора Lyticase для переваривания клеточной стенки. Инкубировать клетки в растворе Lyticase в течение 15 мин при 30 градусах По Цельсия во время встряхивания.
  12. После пищеварения, мыть клетки 3x центрифугирование на 665 х г в течение 3 мин и удалить супернатант. Приостановите действие клеток в 250 зл 1,2 М сорбитола в стиральном буфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что клетки хрупкие после переваривания стенки клетки, resuspend их очень тщательно, чтобы не повредить клетки.
  13. Добавьте 20 зл и подвесных клеток к поли-L-лизинпокрытие покрытые слайды. Разрешить им прикрепить к слайдам в течение 30 мин. Смойте неприсоединения клеток путем мытья скважин 3x с 50 Зл мыть буфера.
  14. Пермяки клетки мембраны путем мытья 3x с 50 зл и 1% Triton-X в мытье буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент ячейки готовы к протоколу перевязки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

3. E. coli Cell Preparation

  1. Подготовьте следующие материалы: PBS-T (140 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 8 мМ K2HPO4, 1,5 мМ КХ2PO4, 0.05% Tween-20), pH 7.4; раствор лизозима (2 мг/мл lysozyme, 25 мм Tris-HCl pH 8.0, 50 мМ Глюкоза, 10 мм EDTA); 0,0001% поли-L-лизинового раствора; 99% ледяного метанола; 99% комнатной температуры метанола; 99% ацетона; 10-ну хорошо диагностические слайды; влажная камера (подготовлена как в шаге 1.1.1); бумага ткани; и Коплин слайд-окрашивания банки.
  2. Выращивайте ночную культуру в средней среде Лурия-Бертани (LB) при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.
  3. Разбавить стационарную культуру до OD600 0.02 в свежем носителе LB. Выращивайте клетки при 30 градусах Цельсия, пока встряхнись, пока OD600 не достигнет 0,4 для клеток фазы журнала.
  4. Приблизительно 15 минут, прежде чем клетки достигнут OD600 из 0,4, подготовить поли-L-лизин покрытием слайды, добавив 100 зл и 0,0001% поли-L-лизин к каждой скважине. Инкубировать горки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  5. После 30 минут смыть излишки поли-L-лизин с ультрачистой водой и дайте горки воздух ассоциироваться. Сухие горки готовы к использованию.
  6. Когда клетки достигают OD600 из 0,4, перенесите 1 мл культуры в стерильную микроцентрифуговую трубку и клетки гранул при 2650 х г в течение 2 мин.
  7. Повторное действие клеток в 50 злителе среды LB.
  8. Исправить клетки, добавив 1 мл ледяного 99% метанола. Смешайте очень осторожно вручную. Инкубировать клетки в течение 30 мин при -20 градусах Цельсия.
  9. После фиксации добавьте 20 злиц ячеек к поли-L-лизин покрытием слайдов. Пусть горки воздух ассоциируется в течение 30 минут.
  10. Добавьте 50 зл свежеприготовленного раствора лиззима к каждому колодцу, чтобы переварить клеточную стенку. Инкубировать во влажной камере в течение 30 мин при 25 градусах Цельсия.
  11. Удалите раствор лизозима из колодцев, добавив бумажную к краю колодца. Вымойте слайды 3x в 100 мл PBS-T. Выполните каждую стирку в коплин слайд-окрашивания банку для 30 с, без тряски.
  12. Удалите буфер стирки со слайдов, нажав слайды на бумажную ткань.
  13. Пермяки клетки мембраны, добавив 50 зл 99% метанола к каждой скважине. Инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  14. Удалить метанол, поместив бумагу на краю колодца.
  15. Добавьте 50 л из 99% ацетона к каждому колодцу. Инкубировать 1 мин.
  16. Удалите лишний ацетон, поместив бумагу на край колодца. Разрешить слайды воздух ассоциироваться. На данный момент ячейки готовы к протоколу перевязки близости, который будет обсуждаться в разделе 4.

4. Проверка лиги

  1. Подготовьте следующие материалы: Блокирование буфера; Буфер разбавления антител; Мойка буфера 'A' - (10 мм Трис, 150 мм NaCl, 0.05% Tween-20) рН 7.4; Мыть буфер 'B' - (200 мм Трис, 100 мм NaCl) рН 7,4; Анти-Кролик Вторичное Антитело PLUS; Анти-мышь Вторичное Антитело МИНУС; 5x Ligation Buffer; лигаза; 5x Усиление Буфер (оранжевый: йex 554 нм;em 576 нм); полимераза; ультрачистая вода; и монтаж среды, содержащей DAPI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты обнаружения PLA также доступны в вариантах Зеленый (Noex 495 нм;й ет 527 нм), Красный (ex 594 нм;й 624 нм), FarRed (Ex 644 нм;м 669 нм) или Брайтфилд (хиндаиш пероксидаза (HRP) конъюгированный).
  2. Блокируйте ячейки, добавляя каплю блокирующего буфера к каждому колодцу. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  3. Подготовка антител решения путем разбавления запасов антител в антитела разбавления буфера. Для каждой скважины требуется 40 л антитела.
  4. Удалите блокирующий буфер, поместив бумагу на краю скважины. Добавьте 40 л антител, разбавленных в буфере разбавления антител к каждому колодцу. Инкубировать в течение 60 минут во влажной камере при 37 градусах Цельсия или на ночь при 4 градусах Цельсия.
  5. Удалить раствор антител из скважин, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 5 минут, без тряски.
  6. Во время мытья шаги, разбавить 5x вторичных зондов антитела, анти-кроличьи PLUS и анти-мышь MINUS (видовспецифика зондов зависит от первичных используемых антител), в антитела разбавления буфера. Приготовьте 40 л раствора антител на скважину.
  7. Добавьте 40 qL вторичного раствора антитела к каждому хорошо. Инкубировать в течение 60 мин при 37 градусах по Цельсию во влажной камере.
  8. Удалите вторичный раствор антитела из колодцев, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 5 минут, без тряски.
  9. Во время стирок приготовьте 40 л перевязочной смеси на скважину, смешивая 8 зл и 5-х лигации буфера, 31 л ультрачистой воды и 1 зл лигации.
  10. Добавьте 40 qL перевязочной смеси к каждому колодцу. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  11. Удалите перевязочную смесь из колодцев, поместив бумагу на краю колодца. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'A' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 2 минут, без тряски.
  12. Во время стирок приготовьте 40 ql смеси усиления на скважину, путем смешивания 8 злификации раствора 5x, 31,5 л ультрачистой воды и 0,5 л полимеразы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Усилитель 5x содержит флуоресцентные зонды. Защитите эту смесь от света. Кроме того, защитить слайды от света во время каждого из следующих шагов. При использовании полупрозрачных Коплин слайд-окрашивания банки и влажные камеры, оберните их в алюминиевую фольгу.
  13. Добавьте 40 qL смеси усиления в скважину. Инкубировать в течение 100 мин при 37 градусах По Цельсию во влажной камере.
  14. Удалите смесь усиления из колодцев. Вымойте слайды 2x в 100 мл мыть буфера 'B' в Коплин слайд-окрашивания банку в течение 10 минут без тряски.
  15. Вымойте слайды в 100 мл мыть буфера 'B' разбавленной 1:100 в ультрачистой воде в Коплин слайд-окрашивания банку для 30 с.
  16. Добавьте к слайдам 20 КЛ DAPI, содержащий монтажную среду на скважину. Закройте слайды с крышкой и уплотнения слайды с лаком для ногтей.
  17. Если изображение, немедленно инкубировать DAPI, содержащий монтаж среды в течение 10-15 мин, в то время как защищены от света. Если нет, храните горки при -20 градусов по Цельсию в течение 1 недели, защищенные от света.

5. Обнаружение

  1. Используйте конфокальную микроскопию для получения изображений клеток HeLa, S. cerevisiae и E. coli с 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA и 100x/1.4 NA Plan Apochromat целей, соответственно. Возбуждайте ОКРАШЕННЫй ДНК DAPI с помощью импульсного диодного лазера площадью 405 нм. Для сигнала PLA (для этого изучения) excite с лазером твердого тела 561 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наши предыдущие исследования in vitro с использованием очищенных белков показали, что подмножество человеческого класса А и класса B JDPs образуют переходные комплексы смешанного класса JDP для эффективного таргетирования широкого спектра агрегированных белков и, возможно, облегчает сборку Hsp70 на основе белковые дезагрегаты7. Мы использовали PLA, чтобы определить, являются ли смешанные комплексы jDP класса (AB) в клетках рака шейки матки (HeLa). Человеческие JDPs DNAJA2 (класс A) и DNAJB1 (класс B) были направлены с высокоспецифическими первичными антителами и вторичными зондами PLA(рисунок 2A-C). Появление красных флуоресцентных токсов указывает на наличие смешанных комплексов DNAJA2 и DNAJB1 в клетках HeLa(Рисунок 2C),подтверждающих наши предыдущие биохимические результаты7. Каждый пунктум представляет собой отдельное событие взаимодействия белка в цитозоле клетки HeLa/ядре.

Предыдущие биохимические результаты, полученные от рецензированной рецензой Фюрстерской ретрансляции энергии (FRET), которая обнаруживает белковые взаимодействия как считывание количества энергии, передаваемых от возбужденного донорского фторофора, прикрепленного к одному белку к подходящему принимаяку фторофору прилагается ко второму белку, указал, что аналогичные комплексы смешанного класса может также произойти между дрожжами JDPs, in vitro8. Подтверждая наши биохимические находки, мы наблюдали образование комплексов смешанного класса между Ydj1 (класс A) и Sis1 (класс B) в одноклеточных эукариот s. cerevisiae (дрожжи пекаря) клеток с PLA (Рисунок 2F). В дрожжах, из-за их небольшого размера клетки и коалесценции нескольких punctae, отдельные флуоресцентные точки, генерируемые НОАК часто может быть менее различимы. Значительное снижение флуоресцентных пункций было отмечено после нокаута или нокдауна взаимодействующих JDPs в человеческих и дрожжевых клетках8, что свидетельствует о высокой специфике НОАК в захвате этих комплексов совместного сопровождаемого в различных типы клеток. В отличие от своих аукариотических коллег, прокариотические (E. coli) JDPs не хватало способности формировать смешанный класс JDP комплексов и функционально сотрудничать, чтобы увеличить дезагрегирование белка, in vitro8. В соответствии с биохимическим анализом, мы не наблюдали смешанного класса JDP комплекс формирования между бактериальной DnaJ-YFP (класс A) и CBpA-mCherry (класс B), только JDPs в кишечной палочке (Рисунок 2I). Тем не менее, наша установка PLA удалось захватить другие сборки сопровождающего с участием двух JDPs. Например, мы обнаружили комплексы сопровождающего между DnaJ-YFP и DnaK (бактериальная Hsp70)(рисунок 2L)и CBpA-mCherry и DnaK8 (данные не показаны). Эти два бактериальных комплекса сопровождающего широко характеризуются как invitro, так и in vivo 8,11,12, тем самым подтверждая наши результаты PLA. Вместе эти наблюдения демонстрируют способность НОАК надежно фиксировать переходно сформированные машины сопровождающего в одноклеточных/многоклеточных эукариотических и прокариотических клетках. Технические элементы управления не хватает первичного антитела против одного из взаимодействующих JDPs / chaperones, но содержащие как мыши и кролика полученных вторичных зондов PLA, показали практически нет фонового сигнала флуоресценции (Рисунок 2A,B,D,E,G, H, J,K) указывает на отсутствие ложноположительного усиления сигнала в нашей экспериментальной установки.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление хронологических шагов проверки лиги близости. (1) Комплекс между белком А и белком B. (2) Связывание первичных антител (зеленых и светло-коричневых) к белкам А и В. Два основных антитела должны быть подняты в различных видах хозяина (например, мышь, кролик или коза). (3) Первичные антитела распознаются видовыми вторичными (2") антителами, ковалентно прикрепленными с тегами олиго ДНК (зонды НОАК). (4) Когда белки A и B находятся в комплексе, связанные зонды PLA находятся в непосредственной близости для облегчения олиго днк для гибридизации с нитями разъема ДНК, что приводит к образованию круговой молекулы ДНК. Впоследствии лигаза ДНК способствует объединению нитей ДНК, катализируя образование фосфодиестерной связи. (5) Инициирование Rolling Circle Усиление (RCA) круговой молекулы ДНК бактериальной полимеразы ДНК при 37 "C. RCA реакция загрунтованодины один из антител-конъюгированных ДНК олиго метки. (6) Поколение одноцепочечной молекулы конкатемерной ДНК, прикрепленной к одному из вторичных антител. (7) Гибридизация флуоресцентно-маркированных дополнительных олигонуклеотидных зондов к уникальной повторяющейся последовательности в молекуле конкатемерной ДНК. После шага гибридизации молекула конкатемерной ДНК может быть визуализирована как яркая флуоресцентная точка в расположении целевого белкового комплекса в фиксированных клетках. Внизу обозначают прокариотические и эукариотические типы клеток, в которых применяется техника НОАК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Молекулярные сборки сопровождающего захвачены НОАК в прокариотических и эукариотических клетках. (A-C) Обнаружение смешанных комплексов JDP, образованных между DNAJA2 (класс A) и DNAJB1 (класс B) в линии клеток рака шейки матки HeLa. PLA выполняется с (A) анти-DNAJA2 антитела в одиночку (отрицательный технический контроль); (B) анти-DNAJB1 антитела в одиночку (отрицательный технический контроль); (C) анти-DNAJB1 и анти-DNAJA2 антитела вместе. Появление нескольких флуоресцентных точек в панели С (положительный сигнал) указывает на наличие белковых комплексов, образуювшихся между DNAJA2 и DNAJB1. Каждая красная флуоресцентная точка/пункт представляет собой единое взаимодействие. Ядра (ДНК) окрашены DAPI (циан). (D-F) Обнаружение комплексов JDP смешанного класса, образовавшихся между Ydj1 (класс Омс1) и Sis1 (класс B) в клетках S. cerevisiae. (D) PLA выполняется только с анти-Ydj1 антитела (отрицательный технический контроль); (E) PLA выполняется с анти-Sis1 антитела в одиночку (отрицательный технический контроль); (F) PLA выполняется с анти-Ydj1 и анти-Sis1 антител вместе. Положительный флуоресцентный сигнал обозначает наличие комплексов Ydj1 и Sis1 в S. cerevisiae. Дрожжевые ядра, окрашенные DAPI (циан). (G-L) Обнаружение комплексов сопровождающего, образовавшихся между прокариотическими Hsp70 (DnaK) и JDPs (DnaJ и CBpA) в клетках кишечной палочки. Из-за отсутствия конкретных первичных антител против prokaryotic JDPs, E. coli DnaJ (класс A) и CBpA (класс B) были помечены YFP и mCherry, соответственно. (G, J) НОАК выполняла только с анти-YFP (отрицательный технический контроль); (H) PLA выполняется только с анти-mCherry (отрицательный технический контроль). (I) НОАК выполняется с анти-YFP и анти-mCherry антитела. Отсутствие люминесцентных точек образования указывает на отсутствие сложного образования между DnaJ и CBpA. (K) PLA выполняется только с анти-DnaK антитела (отрицательный технический контроль). (L) PLA выполняется с анти-YFP и анти-DnaK антител вместе. Положительный флуоресцентный сигнал указывает на сложное образование между DnaK и DnaJ. Бактериальная ДНК, окрашенная DAPI (циан). В дополнение к содержанию одного первичного антитела, все отрицательные технические средства контроля были выполнены в присутствии соответствующих вторичных зондов НОАК. Шкала баров 10 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В качестве давних методов для характеристики белковых сборок использовались подходы, основанные на социопротеии и локализации. Обнаружение переходно сформированных конкретных комплексов сопровождающего является серьезной проблемой при таких традиционных методах, и в результате предыдущие выводы в значительной степени ограничиваются качественными интерпретациями. Методы совместного иммунопрецитирования на основе лизиса на основе клеток часто требуют перекрестного соединения для стабилизации белково-белковых взаимодействий. Лизис клетки увеличивает риск нарушать преходяще сформированные комплексы сопровождающего, пока перекрестно-связывающе смогло ввести non-родные взаимодействия, определенно управляемое присущей «липкой» большинств chaperones. При анализе системы hsp70 chaperone с использованием со-иммунопрецициции, потенциальные артефакты могут возникнуть из а) высоких уровней экспрессии сопровождающего и b) проблем растворимости, относящегося к мембране или белковому агрегату связанных сопровождающих машин. Кроме того, методы, основанные на со-иммунопрецицициях, не дают никакой информации о клеточной локализации захваченных белковых сборок, что может быть важно для разграничения связанных с ними функций. Недостатки использования методов совместного иммунопрецит несколько уменьшаются в подходах, основанных на совместной локализации, которые сохраняют информацию о локализации белка. Однако, совместное локализация двух или более белков может указывать либо на прямую белково-белковую ассоциацию, либо на раздел белков в один и тот же микродомен в клетках. Таким образом, анализ совместной локализации является, в лучшем случае, спекулятивным в прогнозировании белковых взаимодействий и не имеет никакого значения близости. Из-за массового и неизбирательного обнаружения целевых белков, методика весьма ограничена в изучении конкретных белковых сборок в клетках. Это особенно проблематично, когда целевой белок (ы) может, параллельно, образуют широкий спектр различных сборок белка, как в случае с системой Hsp70 сопровождающего. По сравнению с этими обычными методологиями, PLA является более изысканным в situ метод разработан для надежного обнаружения и количественной оценки местных белковых ассоциаций в клетках с сохраненной информацией о локализации белка. Взаимодействие протеина показано этим анализом основанным на близости (приблизительно 10-30 nm) между пристрелными протеинами. PLA является "tunable" в том, что диапазон расстояния близости может быть уменьшена для получения более строгих считывания а) уменьшение длины олигонуклеотидов теги прилагается к зондов НОАК и / или (b) спряжения метки непосредственно к первичным антителам. Следует принимать меры при интерпретации положительного сигнала НОАК. В идеале, взаимодействие белка должно быть подтверждено двумя или более независимыми методологиями. Интенсивность флуоресцентного сигнала в НОАК не так детерминирована с размером белкового кластера или расстоянием разделения взаимодействующих белков, как в случае с FRET. Тем не менее, PLA имеет высокую степень специфичности и чувствительности, и даже может быть использован для анализа очень низкообильных белков, таких как факторы роста или цитокинов и их взаимодействия в редких типах клеток или клинических образцов13.

Сопровождающий Hsp70 сотрудничает с несколькими кожаперонами (например, JDPs и NEFs) в течение его клеточной жизни14 для управления различными биологическими функциями. Огромное количество вероятных конфигураций машин Hsp70-JDP-NEF и их динамичное поведение в клетках в значительной степени препятствовали детальному пониманию конкретных ролей этих машин сопровождающего. Поэтому биологические инструменты, позволяющие селективно отслеживать различные сборки Hsp70, необходимы для вскрытия общей проводки этой сети сопровождающих в клетках. Переходно сформированные JDP-JDP и JDP-Hsp70 chaperone комплексы7 были эффективно захвачены в клетках с НОАК, что указывает на то, что этот метод подходит для изучения молекулярных взаимодействий с высокими константами диссоциации (например, ). Хотя, в текущей работе, анализ в первую очередь используется в качестве "да" или "нет" типа бинарный индикатор для взаимодействия сопровождающего, пользователи могут использовать этот метод для получения полуколичественных считывателей степени взаимодействия путем цифрового подсчета флуоресценции интенсивность сигнала15. Однако, в связи с нелинейным усилением сигнала НОАК, следует проявлять осторожность при интерпретации данных НОАК в количественном порядке16. Несмотря на вышеупомянутые преимущества, этот метод имеет определенные ограничения. Одним из основных недостатков НОАК является то, что анализ требует клеточной фиксации, таким образом, в значительной степени ограничивая его способность решать височные динамики белкового комплекса в живых клетках. Для сравнения, in vivo FRET17 или Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)18 позволяют осуществлять мониторинг аналогичных белковых взаимодействий в пространственно-временном образе в живых клетках с относительно меньшими значениями близости (Злт;10 нм). В отличие от НОАК, сигнал FRET демонстрирует строгую линейную корреляцию с уровнями экспрессии белка16, что делает FRET золотым стандартом в количественном анализе белковых взаимодействий. Однако, в отличие от зависимости ФРЕТ от загадочного фактора ориентации No2,НОАК не зависит от ориентации зондов НОАК, что повышает вероятность захвата белкового комплекса19. С точки зрения дружелюбия пользователей, FRET и BRET требуют уникальных знаний, что в целом ограничивает доступность этих методологий для более широкого научно-исследовательского сообщества. Кроме того, оба эти метода требуют модификации взаимодействующих белков путем присоединения громоздких люминесцентных / флуоресцентных белковых тегов, которые потенциально могут помешать функции белка и комплексного образования.

Следующие шаги (1-4) требуют тщательного рассмотрения для успешного внедрения НОАК в ячейках. (1) Выбор антител: Коммерчески доступный комплект PLA совместим с первичными антителами, поднятыми только против мыши, кролика и козла. PLA требует весьма специфических первичных антител, которые не связываются с целями. Кроме того, важно выбрать первичные антитела, совместимые с такими приложениями, как иммуногистохимия (IHC), фермент-связанный иммуносорбент (ELISA), и/или иммунопреципция (ИС), чтобы убедиться, что антитела могут распознавать антигенные аминокислотные последовательности, выставленные на поверхности сложенных белков. Перед использованием настоятельно рекомендуется тестирование всех первичных антител на их специфичность. Это может быть выполнено с помощью западного анализа поблудки целых клеточных лисатов. В тех случаях, когда целевые белки имеют омологи с небольшими вариациями в размерах и сходстве последовательности (например, паралоги Hsp70 и JDP), специфичность антител может быть проверена с помощью подходов к нокдауну/нокауту или путем зондирования от очищенных homologs, чтобы исключить любые потенциальные перекрестного признания. Если подходящие антитела отсутствуют, целевые белки могут быть помечены эпитопами, которые имеют антитела приемлемого качества (Рисунок 2F). (2) Фиксация и пермяки клеток: Лечение 4% параформальдегида и 0,1-0,5% Тритон-X100 может быть использован для фиксации и промежности клеток, соответственно. Использование 4% параформальдегида является лучшим методом лечения для сохранения белково-белковых взаимодействий и клеточной ультраструктуры по сравнению с фиксаторными условиями, использующими 99% метанола20,21,22. Фиксация клеток с 99% метанола, однако, дает меньше цитоплазматического фонового окрашивания, и, возможно, больше подходит для конкретных случаев, таких как обнаружение цитоскелет связанных сборок белка21,22. Эффективная пермяки как плазменной мембраны, так и органеллы мембран для повышения доступности антител может быть достигнута с неионическим сурфактантом Triton-X100. Triton-X100 может, однако, не специфически удалить белки из плазменной мембраны23,24. Поэтому для анализа белковых сборок, связанных с клеточными мембранами, могут применяться альтернативные моющие средства, такие как сапонин или дигетонин, нацеленные на стерины для пермяков21,22,25. (3) Нарушение клеточной стенки: До мембраны permeabilization, дополнительный шаг с участием конкретных литических ферментов необходимо увеличить проницаемость антител в клетках типов с клеточными стенками (например, грибки, растительные и бактериальные клетки). Например, мы использовали литикейс, который деградирует глюкан, чтобы нарушить клеточной стенкиS. cerevisiae26. Аналогичным образом,E. coliклеточная стенка была нарушена с помощью lysozyme, фермент, который нацелен на пептидогликанов27,28. Состав стенки клетки и чувствительность литической фермента изменяют с по-разному условиями роста26и слияние культуры29,30. Таким образом, концентрация литические ферменты и время пищеварения может варьироваться и следует принимать меры по предотвращению чрезмерного или недосварения клеток. После переваривания клеточной стенки, клетки являются относительно хрупкими и требуют скученности агентов, таких как сорбитол для них, чтобы остаться нетронутыми во время стирки шагов. (4) Усиление ДНК: перевязка ДНК и шаги реакции клизне рястя клягу чувствительны к колебаниям температуры и влажности. Для обеспечения надежного усиления ДНК и воспроизводимости анализа, эти реакции должны быть выполнены при 37 градусах Цельсия в камере влажности. Важно отметить, что прокессированные клетки должны быть предотвращены от высыхания при выполнении анализа, чтобы избежать каких-либо неспецифических связывания антител и событий усиления ДНК, которые могут привести к увеличению фонового сигнала.

Все продуманное, реализация этого проса не требует уникального опыта и сложной аппаратуры. Успешный мониторинг комплексов JDP-JDP и JDP-Hsp70 иллюстрирует потенциальное применение этого метода для отслеживания переходно сформированных белковых сборок во всех типах клеток. Наша реализация метода в дрожжах и бактериях значительно повышает применимость PLA для изучения различных биологических процессов, опосредованные различными белковыми сборками в широком диапазоне организмов. Кроме того, наша работа подчеркивает НОАК в качестве перспективного нового инструмента взаимодействия белка для изучения эволюционных изменений, происходящих на молекулярном уровне между видами8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

NBN поддерживается специальным грантом на набор персонала из Университета Монаш факультета медицины медсестер и медицинских наук при финансировании со стороны правительства штата Виктория и австралийского правительства. Мы благодарим Бернда Букау (МБХ, Гейдельбергский университет, Германия) и Харм Х. Кампинга (Департамент биомедицинских наук клеток и систем, Университет Гронингена, Нидерланды) за их неоценимую поддержку и обмен реагентами, Хольгер Лоренц (КмБХ) Imaging Facility, Гейдельбергский университет, Германия) за поддержку с конфокальной микроскопии и обработки изображений, и Клэр Херст (ARMI, Университет Монаша, Австралия) для критического чтения рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Tags

В этом месяце в JoVE Выпуск 151 Близость Ligation Анализ Chaperone J-домен белка Hsp70 человека бактерий дрожжей e. coli S. cerevisiae белковое взаимодействие протеостаз
В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alberts, N., Mathangasinghe, Y.,… More

Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter