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Biology

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Abstract

Le proteine J-domain (JDP) formano la famiglia di co-chaperone più grande e diversificata nelle cellule eucariotiche. Recenti scoperte mostrano che specifici membri della famiglia JDP potrebbero formare eterocomplessi transitori negli eucarioti per perfezionare la selezione del substrato per la proteina da shock termico da 70 kDa (Hsp70) a base di proteine a base di chaperone. I complessi JDP si rivolgono a proteine aggregate indotte da stress acuto/cronico e presumibilmente aiutano ad assemblare i disaggregas reclutando più Hsp70 sulla superficie degli aggregati proteici. L'estensione della rete di controllo della qualità delle proteine (PQC) formata da questi JDP fisicamente interagenti rimane in gran parte non caratterizzata in vivo. Qui, descriviamo un saggio di interazione delle proteine in situ basato sulla microscopia chiamato il saggio di legatura di prossimità (PLA), che è in grado di catturare in modo robusto questi complessi chaperone formati in modo transitorio in compartimenti cellulari distinti di cellule eucariotiche. Il nostro lavoro amplia l'impiego di PLA dalle cellule umane al lievito (Saccharomyces cerevisiae) e ai batteri (Escherichia coli), rendendo così uno strumento importante per monitorare la dinamica degli assiemi proteici formati transitori in entrambi i cellule procariotiche ed eucariotiche.

Introduction

Una grande quantità di informazioni genomiche rimane incomprensibile a causa della nostra comprensione incompleta degli interactomi cellulari. Le tradizionali metodologie di rilevamento dell'interazione proteina-proteina, come la co-immunoprecipitazioni proteica con/senza il collegamento incrociato chimico e la co-localizzazione delle proteine, sebbene ampiamente utilizzate, rappresentano una serie di svantaggi. Alcuni dei principali svantaggi includono una scarsa quantificazione delle interazioni e la potenziale introduzione di eventi vincolanti non nativi. In confronto, le tecniche emergenti basate sulla prossimità forniscono un approccio alternativo e potente per catturare le interazioni proteiche nelle cellule. Il saggio di legatura di prossimità (PLA)1, ora disponibile come kit proprietario, impiega anticorpi per indirizzare specificamente i complessi proteici in base alla vicinanza delle sottounità interagenti.

Il PLA viene avviato dalla formazione di uno scaffold costituito da anticorpi primari e secondari con piccoli tag di DNA (sonde PLA) sulla superficie del complesso proteico mirato (Figura1, passaggi 1-3). Successivamente, determinata dalla vicinanza dei tag del DNA, una molecola circolare del DNA viene generata tramite ibridazione con oligonucleotidi del connettore (Figura 1, passo 4). La formazione del DNA circolare è completata da una fase di legatura del DNA. Il nuovo pezzo circolare di DNA serve come modello per la successiva reazione a catena di polimerasi (PCR) basata su cerchio rotante (RCA) innescata da uno dei tag oligonucleotidi coniugati. Questo genera una molecola di DNA concatemerica a filamento collegata al complesso proteico tramite lo scaffold degli anticorpi (Figura 1, passo 6). La molecola di DNA concatemerico viene visualizzata utilizzando oligonucleotidi etichettati fluorescentmente che si ibridano a più sequenze uniche sparse nel DNA amplificato (Figura 1, passo 7)2. Il segnale PLA generato, che appare come un punto fluorescente (Figura 1, passaggio 7), corrisponde alla posizione del complesso proteico mirato nella cellula. Di conseguenza, il saggio è stato in grado di rilevare complessi proteici con elevata precisione spaziale. La tecnica non si limita a catturare semplicemente le interazioni proteiche, ma potrebbe anche essere utilizzata per rilevare singole molecole o modifiche proteiche sulle proteine con alta sensibilità1,2.

Hsp70 forma un sistema chaperone altamente versatile fondamentalmente importante per mantenere l'omeostasi cellulare delle proteine partecipando a una serie di puli' e funzioni associate allo stress. Le attività di pulizia del sistema chaperone Hsp70 includono il ripiegamento delle proteine de novo, la traslocazione delle proteine tra le membrane cellulari, l'assemblaggio e lo smontaggio dei complessi proteici, la regolazione dell'attività proteica e il collegamento di diverse proteine che ripiegano/ macchine di controllo qualità3. Lo stesso sistema chaperone ripiega anche proteine misfolded /unfolded, previene l'aggregazione delle proteine, favorisce la disaggregazione delle proteine e collabora con le proteasi cellulari per degradare le proteine piegate in modo errato/danneggiato terminale per facilitare la riparazione cellulare dopo stress proteotossici4,5. Per ottenere questa diversità funzionale, lo chaperone Hsp70 si basa sulla collaborazione con co-chaperones della famiglia JDP e dei fattori di scambio nucleotide (NEF) che perfezionano il controllo allostrico dipendente dall'ATP dell'Hsp70 dell'associazione altrice e del rilascio3, 6. Inoltre, i co-chaperones JDP svolgono un ruolo fondamentale nella selezione di substrati per questo versatile sistema chaperone. I membri di questa famiglia sono suddivisi in tre classi (A, B e C) in base alla loro omologia strutturale al prototipo JDP, l'E. coli DnaJ. I JDP di classe A contengono un N-terminal J-domain, che interagisce con Hsp70, una regione ricca di glicine-fenilalana, una regione di legame del substrato costituito da una regione simile a un dito di zinco (FLR) e due domini a botte z, e un dominio di dimerazione C-terminale. JDP con un N-terminal J-dominio e una regione ricca di glicine-fenilalana, ma mancando la .FLR, rientrano nella classe B. In generale, i membri di queste due classi sono coinvolti nelle funzioni di chaperoning. I membri che rientrano nella classe catchall C, che contiene JDP che condividono solo il dominio J4, reclutare Hsp70 per eseguire una varietà di funzioni non accompagnate. L'importante ruolo dei JDP come "adattatori" di riconoscimento substrato intercambiabile del sistema Hsp70 è riflesso da un'espansione dei membri della famiglia durante l'evoluzione. Ad esempio, gli esseri umani hanno oltre 42 membri JDP distinti4. Questi JDP funzionano come monomeri, omodimeri e/o oligomeri omo/etero4,5. Recentemente, una cooperazione funzionale attraverso la formazione complessa transitoria tra la classe A (ad esempio, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) e la classe B (ad esempio, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDP eucarioti è stato segnalato per promuovere il riconoscimento efficiente degli aggregati di proteine amorfe in vitro7,8. Questi complessi misti di JDP di classe mista si assemblano presumibilmente sulla superficie delle proteine aggregate per facilitare la formazione di proteinea base di Hsp70 e Hsp70-Hsp100 10. Le prove critiche a sostegno dell'esistenza di questi complessi misti jDP di classe transitoria sono state fornite con PLA8.

Il PLA è sempre più impiegato nella valutazione delle interazioni proteiche nei metazoi, principalmente nelle cellule dei mammiferi. Qui, segnaliamo la riuscita espansione di questa tecnica per monitorare i complessi chaperone formati transitori in organismi unicellulari eucarioti e procariotici come il lievito in erba S. cerevisiae e il batterio E. coli. È importante sottolineare che questa espansione evidenzia il potenziale utilizzo di PLA per rilevare e analizzare i microbi che infettano le cellule umane e animali.

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Protocol

1. Preparazione della cella HeLa

  1. Preparare i seguenti materiali: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, integrato con 10% FCS e 1% Pen-Strep; 4% paraformaldeide in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% sterile soluzione poli-L-Lysina; 10 vetrini diagnostici; una camera umida; carta velina; e Coplin striature di diapositive.
    NOT: Per garantire un'efficienza ottimale della fissazione, le soluzioni di paraformaldeia devono essere preparate fresche prima di ogni esperimento.
  2. Preparare una camera umida coprendo il fondo di una scatola chiusa con tessuti umidi. Posizionare la camera umida a 37 gradi centigradi prima di iniziare l'esperimento, per garantire che la temperatura della camera sia a 37 gradi centigradi durante l'incubazione delle reazioni enzimatiche.
  3. Coltura cellule HeLa in flaconi T25, in 5 mL di DMEM (Alto glucosio, glutammato e sodio Pyruvate integrato) integrato con 10% FCS e 1% Pen-Strep, in un 37 C CO2 incubatore contenente 5% CO2. Dissociare le cellule aderenti utilizzando 0.05% Trypsin-EDTA. Dopo l'aggiunta di DMEM fresco alle cellule dissociate, contare le cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare e crescere su diapositive diagnostiche all'interno di una camera umida.
  4. Sterilizzare i vetrini diagnostici per irradiazione UV in una cappa di coltura cellulare sterile per 30 min.
  5. Aggiungere 100 L di sterile filtrato 0,0001% poli-L-lysine ad ogni ben richiesto per l'esperimento. Incubare per 30 min. Lavare via l'eccesso di poli-L-lisina lavando ogni pozzo 3x con 50 acqua ultrapura.
  6. Prova a fare in modo che le cellule HeLa e aggiulsi circa 15.000 cellule a ogni pozzo. Se necessario, diluire le cellule ad almeno 30-50 luna di DMEM per pozzo.
  7. Coltivare le cellule in una camera umida all'interno di un'incubatrice di CO2 37 c 5% per circa 24 h. Le cellule devono essere 60%-80% confluente prima di iniziare il PLA.
    NOT: Una confluenza troppo alta riduce l'assorbimento dei reagenti, diminuendo il segnale ottenuto alla fine del protocollo.
  8. Rimuovere il mezzo posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Lavare i pozzi 3x con 50 gradi l di PBS.
    NOT: Le cellule sono soggette a stacco quando i liquidi vengono aggiunti duramente. Questo può essere evitato non lasciando asciugare completamente i pozzi prima di aggiungere nuovo liquido e aggiungendo il nuovo liquido delicatamente al bordo del pozzo.
  9. Fissare le cellule aggiungendo 50 -L di paraformaldeide appena preparata 4% in PBS ad ogni pozzo. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
  10. Lavare le vetrine 3x in PBS. Eseguire i fusti in un barattolo di macchie di diapositive Coplin contenente 100 mL di PBS. Per ogni lavaggio, incubare per 5 min a temperatura ambiente senza agitare.
  11. Permeabilizzare la membrana cellulare sommergendo i vetrini in 100 mL di 0,5% Triton-X100 in PBS in un barattolo di stridore Coplin. Incubare per 10 min a temperatura ambiente senza agitare.
  12. Lavare i vetrini 3x in TBS-T. Eseguire i fusti in un barattolo di macchie di diapositive Coplin contenente 100 mL di TBS-T. Per ogni lavaggio, incubare per 5 min a temperatura ambiente senza agitare.
  13. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il buffer in eccesso con una carta velina. A questo punto le celle sono pronte per il protocollo di analisi della ligazione di prossimità che verrà discusso nella sezione 4.

2. S. cerevisiae Preparazione cellulare

  1. Preparare i seguenti materiali: 100 mM KPO4, pH 6.5, denominato Wash Buffer; 37% formaldeide; 4% paraformaldeide in 100 mM KPO4, pH 6.5; 1,2 M sorbitolo in 100 mM KPO4, pH 6,5; soluzione di liticasi (500 g/mL di litio, 20 mM MM di mercaptoetanolo, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0.0001% soluzione poli-L-Lysina; 1% Triton-X100 in 100 mM KPO4, pH 6,5; 10 vetrini diagnostici; una camera umida (preparata come nel passaggio 1.2); carta velina; e Coplin striature di diapositive.
    NOT: Per garantire un'efficienza ottimale della fissazione, le soluzioni di paraformaldeia devono essere preparate fresche prima di ogni esperimento.
  2. Coltivare una coltura durante la notte in lievito non selettivo, Peptone e Dextrose (YPD) medio a 30 s durante agitazione.
    NOT: A seconda dei requisiti sperimentali, le cellule S. cerevisiae possono invece essere coltivate nel mezzo Synthetic Complete (SC) medio o selettivo Synthetic Minimal (SM).
  3. Diluire la coltura stazionaria a un oD600 di 0,1 in mezzo a 20 mL. Far crescere le cellule a 30 gradi centigradi mentre si agita nokergo fino a raggiungere 0,5.
  4. Trasferire la coltura da 20 mL su un tubo di centrifuga di 50 mL. Pellet le cellule per centrifugazione a 665 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante. Risospendere le cellule in 5 mL di mezzo fresco.
  5. Fissare le cellule aggiungendo 550 : L del 37% di formaldeide alla coltura. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  6. Pellet le cellule per centrifugazione a 665 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante. Risospendere il pellet in 1 mL di paraformaldeide appena preparata 4% in Wash Buffer. Incubare per 45 min a temperatura ambiente.
  7. Durante l'incubazione, preparare i vetrini diagnostici aggiungendo a ciascun pozzo 100 xL di 0,01% a soluzione poli-l-lisina. Incubare gli scivoli per 30 min a temperatura ambiente.
  8. Dopo 30 minuti, lavare via l'eccesso di poli-L-lisina con acqua ultrapura e lasciare asciugare l'aria degli slittamenti. I vetrini asciutti sono pronti per l'uso.
  9. Lavare le cellule due volte con 1 mL di Wash Buffer. Eseguire lavaggi con centrifugazione delle cellule a 665 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in Wash Buffer.
  10. Pellet le cellule per centrifugazione a 665 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante. Risospendere le celle in 1 mL di 1,2 M sorbitolo in Wash Buffer.
  11. Pellet le cellule per centrifugazione a 665 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante. Risospendere il pellet a 250 - L di soluzione Lyticase appena preparata per digerire la parete cellulare. Incubare le cellule in soluzione Lyticase per 15 min a 30 gradi durante lo scuotimento.
  12. Dopo la digestione, lavare le cellule 3x per centrifugazione a 665 x g per 3 min e rimuovere il supernatante. Risospendere le celle in 250 gradi ll di 1,2 M di sorbitolo in Wash Buffer.
    NOT: Poiché le cellule sono fragili dopo la digestione della parete cellulare, risospenderle con molta attenzione per non danneggiarle.
  13. Aggiungere 20 celle risospese ai vetrini rivestiti in poli-L-lisina. Lasciare che si attacchino ai vetrini per 30 min. Lavare via le cellule non aderenti lavando i pozze 3x con 50 .L di Wash Buffer.
  14. Permeabilizzare la membrana cellulare lavando 3x con 50 s L dell'1% Triton-X in Wash Buffer.
    NOT: A questo punto le cellule sono pronte per il protocollo di analisi della legatura di prossimità che sarà discusso nella sezione 4.

3. E. coli Preparazione cellulare

  1. Preparare i seguenti materiali: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0.05% Tween-20), pH 7.4; soluzione lysozyme (2 mg/mL lysozyme, 25 mM MM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM Glucose, 10 mM EDTA); 0.0001% soluzione poli-L-Lysina; 99% di metanolo ghiacciato; 99% di metanolo a temperatura ambiente; 99% di acetone; 10 vetrini diagnostici; una camera umida (preparata come nel punto 1.1.1); carta velina; e Coplin striature di diapositive.
  2. Coltiva una cultura notturna a Luria-Bertani (LB) media a 30 gradi durante lo scuotimento.
  3. Diluire la coltura stazionaria a un OD600 di 0,02 in mezzo LB fresco. Far crescere le cellule a 30 gradi centigradi mentre si agita nokergo fino a quando l'OD600 raggiunge 0,4 per le cellule di fase di log.
  4. Circa 15 min prima che le cellule raggiungano un OD600 di 0,4, preparare i vetrini rivestiti poli-L-lisina aggiungendo 100 luna di 0,0001% poli-L-lisina a ciascuno beni. Incubare gli scivoli per 30 min a temperatura ambiente.
  5. Dopo 30 minuti lavare via in eccesso poli-L-lysina con acqua ultrapura e lasciare scindere gli scivoli. I vetrini asciutti sono pronti per l'uso.
  6. Quando le cellule raggiungono un OD600 di 0,4, trasferire 1 mL della coltura in un tubo di microcentrifuga sterile e cellule pellet a 2.650 x g per 2 min.
  7. Risospendere le celle in 50 - L di lB medio.
  8. Correggere le cellule aggiungendo 1 mL di metanolo freddo al ghiaccio. Mescolare molto delicatamente a mano. Incubano cellule per 30 min a -20 gradi centigradi.
  9. Dopo la fissazione aggiungere 20 l di cellule ai vetrini rivestiti poli-L-lisina. Lasciare asciugare all'aria i vetrini per 30 min.
  10. Aggiungete 50 ldi di soluzione lisozima appena preparata ad ogni pozzo per digerire la parete cellulare. Incubare in una camera umida per 30 min a 25 gradi centigradi.
  11. Rimuovere la soluzione lysozyme dai pozze aggiungendo una carta velina al bordo del pozzo. Lavare i vetrini 3x in 100 mL di PBS-T. Eseguire ogni lavaggio in un barattolo di scivolo Coplin per 30 s, senza agitare.
  12. Rimuovere il buffer di lavaggio dalle diapositive toccando le diapositive su una carta velina.
  13. Permeabilizzare le membrane cellulari aggiungendo 50 - L di 99% di metanolo a ogni pozzo. Incubare per 1 min a temperatura ambiente.
  14. Rimuovere il metanolo posizionando una carta velina sul bordo del pozzo.
  15. Aggiungere 50 l di 99% di acetone ad ogni bene. Incubare per 1 min.
  16. Rimuovere l'acetone in eccesso posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Lasciare asciugare all'aria i vetrini. A questo punto le cellule sono pronte per il protocollo di analisi della legatura di prossimità che sarà discusso nella sezione 4.

4. Saggio di ligazione di prossimità

  1. Preparare i seguenti materiali: Blocco buffer; Buffer di diluizione anticorpo; Buffer di lavaggio 'A' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Buffer di lavaggio 'B' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anticorpo secondario anti-rabbit PLUS; Anticorpo secondario anti-mouse MINUS; Buffer di ligazione 5x; ligae; 5x Buffer di Amplificazione (Arancione:s. 554 nm; 576 nm); polimerasi; acqua ultrapura; e supporto di montaggio contenente DAPI.
    NOTA: I reagenti di rilevamento PLA sono disponibili anche nelle varianti Verde (sezioneverde 495 nm; s em 527 nm), Rosso (zex 594 nm; coniugato).
  2. Bloccare le celle aggiungendo un calo di buffer di blocco a ogni pozzo. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi in una camera umida.
  3. Preparare le soluzioni anticorpali diluendo gli anticorpi di riserva in Antibody Dilution Buffer. Per ogni pozzo sono necessari 40 l di soluzione anticorpale.
  4. Rimuovere il buffer di blocco posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Aggiungete 40 l di anticorpo diluito in Antibody Dilution Buffer in ogni pozzo. Incubare per 60 min in una camera umida a 37 gradi centigradi o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi.
  5. Rimuovere la soluzione anticorpale dai pozze posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Lavare le vetrine 2x in 100 mL di Wash Buffer 'A' in un barattolo di coloramento scorrevole Coplin per 5 min, senza agitare.
  6. Durante le fasi di lavaggio, diluire sonde anticorpali secondarie 5x, anti-coniglio PLUS e anti-topo MINUS (la specificità della specie delle sonde dipende dagli anticorpi primari utilizzati), in Antibody Dilution Buffer. Preparare 40 l di soluzione anticorpale per bene.
  7. Aggiungere 40 - L di soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo. Incubare per 60 min a 37 gradi centigradi in una camera umida.
  8. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria dai pozze posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Lavare le vetrine 2x in 100 mL di Wash Buffer 'A' in un barattolo di coloramento scorrevole Coplin per 5 min, senza agitare.
  9. Durante i lavamenti preparate 40 gradi di miscela di ligazione per pozzo, mescolando 8 luna di 5x Ligation Buffer, 31 litri di acqua ultrapura e 1 luna di ligase.
  10. Aggiungere 40 l di miscela di ligazione in ogni pozzo. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi in una camera umida.
  11. Rimuovere la miscela di ligazione dai pozze posizionando una carta velina sul bordo del pozzo. Lavare le vetrine 2x in 100 mL di Wash Buffer 'A' in un barattolo di coloramento scorrevole Coplin per 2 min, senza agitare.
  12. Durante i lavamenti preparate 40 gradi di miscela di amplificazione per pozzo, mescolando 8 luna di 5 x soluzione di amplificazione, 31,5 litri di acqua ultrapura e 0,5 litri di polimerasi.
    NOT: L'amplificazione 5x contiene sonde fluorescenti. Proteggere questa miscela dalla luce. Inoltre, proteggere le diapositive dalla luce durante ciascuno dei seguenti passaggi. Se si utilizzano vasetti traslucidi Coplin e camere umide, avvolgerle in un foglio di alluminio.
  13. Aggiungere 40 l di miscela di amplificazione per pozzo. Incubare per 100 min a 37 gradi centigradi in una camera umida.
  14. Rimuovere la miscela di amplificazione dai pozzi. Lavare le vetrine 2x in 100 mL di Wash Buffer 'B' in un barattolo di coloramento scorrevole Coplin per 10 min senza agitare.
  15. Lavare i vetrini in 100 mL di Wash Buffer 'B' diluito 1:100 in acqua ultrapura in un barattolo di colorazione di scivolo Coplin per 30 s.
  16. Aggiungere ai vetrini 20 - L di DAPI contenente il supporto di montaggio. Chiudere i vetrini con una coverslip e sigillare i vetrini con smalto.
  17. In caso di imaging, incubare immediatamente DAPI contenente un supporto di montaggio per 10-15 min, mentre è protetto dalla luce. In caso contrario, conservare i vetrini a -20 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana, protetti dalla luce.

5. Rilevamento

  1. Utilizzare la microscopia confocale per acquisire immagini di cellule HeLa, S. cerevisiae ed E. coli con obiettivi 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA e 100x/1.4 NA Plan Apochromat, rispettivamente. Eccitate DAPI macchiato di DNA con un laser a diodo pulsato da 405 nm. Per il segnale PLA (per questo studio) eccitare con un laser a stato solido 561 nm.

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Representative Results

I nostri precedenti studi in vitro che utilizzano proteine purificate hanno rivelato che un sottoinsieme della classe umana A e dei JDP di classe B formano complessi JDP di classe mista transitori per indirizzare in modo efficiente un'ampia gamma di proteine aggregate e possibilmente facilitare l'assemblaggio di Hsp70-based proteine disaggregases7. Abbiamo impiegato il PLA per determinare se i complessi JDP di classe mista (A-B) si verificano nelle cellule tumorali cervicali umane (HeLa). I JDp umani DNAJA2 (classe A) e DNAJB1 (classe B) sono stati presi di mira con anticorpi primari altamente specifici e sonde PLA secondarie (Figura2A-C). La comparsa di punctae fluorescenti rosse ha indicato la presenza di complessi misti DNAJA2 e DNAJB1 nelle cellule HeLa (Figura 2C) confermando i nostri precedenti risultati biochimici7. Ogni punctum rappresenta un singolo evento di interazione proteica nel citosol/nucleo delle cellule HeLa.

Precedenti risultati biochimici ottenuti dal trasferimento di energia a risonanza fàrster (FRET), che rileva le interazioni proteiche come una lettura della quantità di energia trasferita da un fluoroforo donatore eccitato collegato a una proteina ad un accettatore adatto fluoroforo alla seconda proteina, ha indicato che complessi di classe mista simili potrebbero verificarsi anche tra JDP di lievito, in vitro8. Confermando i nostri risultati biochimici, abbiamo osservato la formazione di complessi di classe misti tra Ydj1 (classe A) e Sis1 (classe B) in cellule unicellulari di eucariote S. cerevisiae (lievito di panettiere) con PLA (Figura 2F). Nel lievito, a causa delle loro piccole dimensioni delle cellule e della coalescenza delle punctae multiple, i singoli punti fluorescenti generati dal PLA potrebbero spesso essere meno distinguibili. Una notevole diminuzione della formazione di punctae fluorescenti è stata osservata dopo l'knockout o l'abbattimento dei JDP interagenti nelle cellule umane e lieviti8, il che dimostra l'elevata specificità del PLA nel catturare questi complessi co-chaperone in diversi tipi di cellule. A differenza delle loro controparti eucariotiche, i JDP procariotici (E. coli) non avevano la capacità di formare complessi JDP di classe mista e di cooperare funzionalmente per aumentare la disaggregazione delle proteine, in vitro8. In accordo con l'analisi biochimica, non abbiamo osservato la formazione complessa JDP di classe mista tra il batterio DnaJ-YFP (classe A) e CbpA-mCherry (classe B), gli unici JDP in E. coli (Figura 2I). Tuttavia, la nostra configurazione PLA è stata in grado di catturare altri assembly chaperone che coinvolgono i due JDP. Ad esempio, abbiamo rilevato complessi chaperone tra DnaJ-YFP e DnaK (hsp70 batterico) (Figura 2L) e CbpA-mCherry e DnaK8 (dati non mostrati). Questi due complessi di chaperone batterico sono ampiamente caratterizzati sia in vitro che in vivo8,11,12 confermando così i nostri risultati PLA. Insieme, queste osservazioni dimostrano la capacità del PLA di catturare in modo robusto macchinari chaperone formati transitori in cellule eucariotiche e procariotiche unicellulari/multicellulari. I controlli tecnici privi di anticorpo primario contro uno dei JDP/chaperones interagenti, ma contenenti sia le sonde PLA secondarie derivate da topo che per coniglio, hanno mostrato poco o nessun segnale di fluorescenza di fondo (Figura 2A,B,D,E,G,H, J,K) indica una mancanza di amplificazione del segnale falso positivo nella nostra configurazione sperimentale.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica dei passi cronologici del test di legamento di prossimità. (1) Complesso tra la proteina A e la proteina B. (2) Legando gli anticorpi primari (1) (verde e marrone chiaro) alle proteine A e B. I due anticorpi primari devono essere allevati in diverse specie ospiti (ad es. topo, coniglio o capra). (3) Gli anticorpi primari sono riconosciuti da anticorpi secondari specifici della specie (2o) collegati covalentmente con tag oligo del DNA (sonde PLA). (4) Quando le proteine A e B sono in complesse, le sonde PLA rilegate sono vicine per facilitare l'ibridazione degli olighi del DNA con i filamenti di DNA del connettore, il che si traduce nella formazione di una molecola circolare di DNA. Successivamente, una legasi del DNA facilita l'unione di filamenti di DNA mediante la formazione di un legame di fosforo. (5) L'avvio dell'Amplificazione Rolling Circle (RCA) della molecola circolare del DNA da parte di una polimerasi batterica del DNA a 37o C. la reazione RCA è innescata da una delle etichette di oligo del DNA coniugate con anticorpi. (6) Generazione di una molecola di DNA concatemerico a singolo filamento attaccata a uno degli anticorpi secondari. (7) Ibridazione delle sonde oligonucleotidi complementari con etichettafluere a una sequenza ripetitiva unica nella molecola di DNA concatemerico. Dopo la fase di ibridazione, la molecola di DNA concatemerico potrebbe essere visualizzata come un punto fluorescente luminoso nella posizione del complesso proteico mirato nelle cellule fisse. In basso denotano i tipi di cellule procariotiche ed eucariotiche in cui è applicabile la tecnica PLA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Assemblaggi di accompagnatori molecolari catturati dal PLA in cellule procariotiche ed eucariotiche. (A-C) Rilevamento di complessi JDP di classe mista formati tra DNAJA2 (classe A) e DNAJB1 (classe B) nella linea cellulare del cancro cervicale umano HeLa. PLA eseguito con (A) anticorpo anti-DNAJA2 da solo (controllo tecnico negativo); (B) anticorpo anti-DNAJB1 da solo (controllo tecnico negativo); (C) anticorpi anti-DNAJB1 e anti-DNAJA2 insieme. La comparsa di più punti fluorescenti nel pannello C (segnale positivo) indica la presenza di complessi proteici formati tra DNAJA2 e DNAJB1. Ogni punto/punctum fluorescente rosso rappresenta una singola interazione. Nuclei (DNA) macchiati di DAPI (ciano). (D-F) Rilevamento di complessi JDP di classe mista formati tra Ydj1 (classe A) e Sis1 (classe B) nelle cellule di S. cerevisiae. (D) PLA eseguito con anticorpo anti-Ydj1 da solo (controllo tecnico negativo); (E) PLA eseguito con l'anticorpo antisisto (controllo tecnico negativo); (F) PLA eseguito con anticorpi anti-Ydj1 e anti-Sis1 insieme. Il segnale fluorescente positivo indica la presenza di complessi Ydj1 e Sis1 in S. cerevisiae. Nuclei di lievito macchiati di DAPI (ciano). (G-L) Rilevamento di complessi chaperone formati tra prokaryotic Hsp70 (DnaK) e JDP (DnaJ e CbpA) nelle cellule Di. coli. A causa della mancanza di anticorpi primari specifici contro i JDP procrociotici, gli E. coli DnaJ (classe A) e cbpA (classe B) sono stati etichettati rispettivamente con YFP e mCherry. (G, J) PLA eseguito con la sola anti-YFP (controllo tecnico negativo); (H) PLA eseguito con anti-mCherry da solo (controllo tecnico negativo). (I) PLA eseguito con anticorpi anti-YFP e anti-mCherry anti-YFP. La mancanza di formazione di punti fluorescenti non indica alcuna formazione complessa tra DnaJ e CbpA. (K) PLA eseguito con anticorpo anti-DnaK da solo (controllo tecnico negativo). (L) PLA eseguito con anticorpi anti-YFP e anti-DnaK insieme. Il segnale fluorescente positivo indica una formazione complessa tra DnaK e DnaJ. DNA batterico macchiato di DAPI (ciano). Oltre a contenere un singolo anticorpo primario, tutti i controlli tecnici negativi sono stati eseguiti in presenza delle rispettive sonde PLA secondarie. Barre della scala: 10 m.

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Discussion

Approcci basati sulla co-immunoprecipitazioni e la co-localizzazione sono stati utilizzati come metodi di lunga data per caratterizzare gli assemblamenti proteici. L'individuazione di complessi di chaperone specifici formati in modo transitorio è una grande sfida con tali metodi convenzionali e, di conseguenza, i risultati precedenti sono in gran parte limitati a interpretazioni qualitative. Le tecniche di co-immunoprecipitazionazione basate sulla lisi a base di lisi spesso richiedono il collegamento incrociato per stabilizzare le interazioni proteina-proteina. La lisi cellulare aumenta il rischio di interrompere i complessi chaperoni formati transitori, mentre il collegamento incrociato potrebbe introdurre interazioni non native, in particolare guidato dalla "appiccicosità" intrinseca della maggior parte degli chaperones. Quando si analizza il sistema chaperone Hsp70 utilizzando la co-immunoprecipitazioni, potenziali artefatti potrebbero derivare da (a) livelli di alta espressione dello chaperone e (b) problemi di solubilità relativi alle macchine chaperone legate alla membrana o all'aggregazione proteica. Inoltre, le tecniche basate sulla co-immunoprecipitazioni non forniscono informazioni sulla localizzazione cellulare degli assiemi proteici catturati, che potrebbe essere importante per delineare le funzioni associate. Gli inconvenienti dell'utilizzo di tecniche di co-immunoprecipitazionazione sono in qualche modo ridotti negli approcci basati sulla co-localizzazione che preservano le informazioni di localizzazione delle proteine. Tuttavia, la co-localizzazione di due o più proteine potrebbe indicare l'associazione diretta proteina-proteina o il partizionamento delle proteine nello stesso microdominio nelle cellule. Pertanto, l'analisi di co-localizzazione è, nella migliore delle ipotesi, speculativa nel prevedere le interazioni tra proteine e manca di alcun valore di prossimità. A causa del rilevamento sfuso e indiscriminato delle proteine mirate, la tecnica è molto limitata nello studio di specifici gruppi proteici nelle cellule. Ciò è particolarmente problematico quando le proteine mirate potrebbero, in parallelo, formare un'ampia gamma di assemblaggi proteici distinti come nel caso del sistema di chaperone Hsp70. Rispetto a queste metodologie convenzionali, il PLA è una tecnica in situ più raffinata sviluppata per rilevare e quantificare in modo robusto le associazioni proteiche native nelle cellule con informazioni di localizzazione delle proteine conservate. Un'interazione proteica è rivelata da questo saggio basato sulla vicinanza (circa 10-30 nm) tra le proteine mirate. Il PLA è "regolabile" in quanto l'intervallo della distanza di prossimità potrebbe essere ridotto per ottenere una lettura più rigorosa di (a) diminuendo la lunghezza dei tag oligonucleotide attaccati alle sonde PLA e/o (b) coniugando i tag direttamente agli anticorpi primari. Quando si interpreta un segnale PLA positivo, è necessario prestare attenzione. Idealmente, un'interazione proteica dovrebbe essere confermata con due o più metodologie indipendenti. L'intensità del segnale fluorescente nel PLA non è così deterministicamente correlata alla dimensione del cluster proteico o alla distanza di separazione tra le proteine interagenti come nel caso di FRET. Tuttavia, pLA ha un alto grado di specificità e sensibilità, e potrebbe anche essere utilizzato per l'analisi di proteine abbondanti molto basse come fattori di crescita o citochine e le loro interazioni in tipi di cellule rare o campioni clinici13.

L'Hsp70 chaperone collabora con più co-chaperones (ad esempio, JDP e NEF) durante la sua vita cellulare14 per guidare funzioni biologiche distinte. Il gran numero di probabili configurazioni di macchine Hsp70-JDP-NEF e il loro comportamento dinamico nelle cellule hanno in gran parte ostacolato una comprensione dettagliata dei ruoli specifici di queste macchine chaperone. Gli strumenti biologici che consentono la traccia selettiva di assiemi Hsp70 distinti sono pertanto necessari per sezionare il cablaggio complessivo di questa rete chaperone nelle cellule. I complessi chaperone JDP-JDP e JDP-Hsp70 a formazione transitoria7 sono stati efficacemente catturati in cellule con PLA, indicando che questa tecnica è adatta per studiare le interazioni molecolari con costanti di dissociazione elevate (ad es., >3 ). Anche se, nel lavoro attuale, il saggio viene utilizzato principalmente come un indicatore binario di tipo "sì" o "no" per l'interazione chaperone, gli utenti possono utilizzare questa tecnica per ottenere letture semi-quantitative del grado di interazione contando digitalmente la fluorescenza intensità del segnale15. Tuttavia, a causa dell'amplificazione non lineare del segnale PLA, è necessario prestare attenzione nell'interpretare i dati PLA in modo quantitativo16. Nonostante i vantaggi di cui sopra, questo metodo ha alcune limitazioni. Uno dei principali svantaggi del PLA è che l'analisi richiede la fissazione cellulare limitando così in gran parte la sua capacità di risolvere le dinamiche temporali della complessità delle proteine nelle cellule vive. In confronto, FRET17 o Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)18 consente il monitoraggio di interazioni proteiche simili in modo spatio-temporale in cellule viventi con valori di prossimità relativamente più piccoli (<10 nm). A differenza del PLA, un segnale FRET presenta una stretta correlazione lineare con i livelli di espressione delle proteine16 facendo di FRET il gold standard nell'analisi quantitativa delle interazioni proteiche. Tuttavia, a differenza della dipendenza di FRET dal fattore di orientamento enigmatico2, il PLA non è influenzato dall'orientamento delle sonde PLA, il che aumenta la probabilità di catturare un complesso proteico19. In termini di cordialità degli utenti, FRET e BRET richiedono competenze uniche limitando così generalmente l'accessibilità di queste metodologie alla comunità di ricerca più ampia. Inoltre, entrambe queste tecniche richiedono la modifica delle proteine interagenti attaccando tag ingombranti di proteine luminescenti/fluorescenti che potrebbero potenzialmente interferire con la funzione proteica e la formazione complessa.

I passaggi seguenti (1-4) richiedono un'attenta considerazione per la corretta implementazione del PLA nelle celle. (1) Selezione degli anticorpi: Il kit PLA disponibile in commercio è compatibile solo con gli anticorpi primari sollevati contro topo, coniglio e capra. PLA richiede anticorpi primari altamente specifici che non si legano a bersagli fuori. Inoltre, è importante selezionare gli anticorpi primari compatibili con applicazioni quali immunostochimica (IHC), analisi immunosorbenaria legata agli enzimi (ELISA) e/o immunoprecipitazioni (IP) per garantire che gli anticorpi possano riconoscere sequenze di amminoacidi antigenici esposte sulla superficie delle proteine piegate. Prima dell'uso, si raccomanda noto il test di tutti gli anticorpi primari per la loro specificità. Questo può essere eseguito tramite l'analisi macchia occidentale di lisato intero. Nei casi in cui le proteine mirate presentano omologhi con piccole variazioni di dimensioni e somiglianza di sequenza (ad esempio, paraloghi Hsp70 e JDP), la specificità degli anticorpi potrebbe essere testata con approcci di abbattimento/knockout genico o sondando contro i paralosi purificati omologhi per escludere qualsiasi potenziale riconoscimento incrociato. Se non sono disponibili anticorpi idonei, le proteine mirate potrebbero essere etichettate con epitopi con anticorpi di qualità accettabile (Figura 2F). (2) Fissazione e permeabilizzazione delle cellule: Un trattamento di 4% paraformaldeide e 0.1-0.5% Triton-X100 potrebbe essere utilizzato per fissare e permeabilizzare le cellule, rispettivamente. L'uso della paraformaldeide del 4% è un trattamento migliore per preservare le interazioni proteina-proteina e l'ultrastruttura cellulare rispetto alle condizioni fissative che impiegano il 99% di metanolo20,21,22. Fissare le cellule con 99% di metanolo, tuttavia, produce meno colorazione del fondo citoplasmico, e forse è più adatto per casi specifici come il rilevamento di gruppi proteici associati al citoscheletro21,22. Una permeabilizzazione efficiente sia della membrana plasmatica che delle membrane di orgelli per aumentare l'accessibilità degli anticorpi potrebbe essere ottenuta con Triton-X100, surfactant non ionico. Triton-X100 può, tuttavia, rimuovere in modo non specifico le proteine dalla membrana plasmatica23,24. Pertanto, per l'analisi degli assiemi proteici associati alle membrane cellulari, potrebbero essere applicati detergenti alternativi come la saponina o la digitalizzatore che si rivolge asteroli a membrane permeabilizzanti21,22,25. (3) Interruzione della parete cellulare: Prima della permeabilizzazione della membrana, è necessario un ulteriore passo che coinvolge specifici enzimi litici per aumentare la penetrabilità degli anticorpi nei tipi di cellule con le pareti cellulari (ad esempio funghi, piante e cellule batteriche). Per esempio, abbiamo impiegato il lyticasi, che degrada il glucano z-glucano per rompere la parete cellulareS. cerevisiae26. Analogamente, ilE. coliparete cellulare è stato interrotto utilizzando lysozyme, un enzima che si rivolge peptidoglycans27,28. La composizione della parete cellulare e la sensibilità degli enzimi littici variano a seconda delle diverse condizioni di crescita26e confluenza culturale29,30. Pertanto, la concentrazione degli enzimi littici e dei tempi di digestione può variare e occorre prestare attenzione per prevenire l'eccessiva o sottodigestione delle cellule. Dopo la digestione della parete cellulare, le cellule sono relativamente fragili e richiedono agenti di affollamento come il sorbitolo per rimanere intatte durante le fasi di lavaggio. (4) Amplificazione del DNA: la legatura del DNA e le fasi di reazione PCR circolorio sono sensibili alle fluttuazioni di temperatura e umidità. Per garantire una robusta amplificazione del DNA e riproducibilità del saggio, queste reazioni devono essere eseguite a 37 gradi centigradi in una camera di umidità. È importante sottolineare che alle cellule proccesse dovrebbe essere impedito di asciugarsi durante l'esecuzione del saggio per evitare eventuali eventi di legame anticorpale non specifico e di amplificazione del DNA che potrebbero portare ad un aumento del segnale di fondo.

Tutto sommato, l'implementazione di questo saggio non richiede competenze uniche e strumentazione sofisticata. Il monitoraggio riuscito dei complessi chaperone JDP-JDP e JDP-Hsp70 illustra la potenziale applicazione di questa tecnica per tracciare gli assiemi proteici formati transitori in tutti i tipi di cellule. La nostra implementazione della tecnica nel lievito e nei batteri aumenta significativamente l'applicabilità del PLA per studiare vari processi biologici mediati da distinti gruppi proteici in un'ampia gamma di organismi. Inoltre, il nostro lavoro mette in evidenza il PLA come un nuovo promettente strumento di interazione proteica per studiare i cambiamenti evolutivi che si verificano a livello molecolare tra le specie8.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

NBN è supportato da uno speciale sussidio di reclutamento della Facoltà di Medicina della Monash University infermieristica e scienze della salute con il finanziamento del governo statale di Victoria e del governo australiano. Ringraziamo Bernd Bukau (Università di Heidelberg, Germania) e Harm H. Kampinga (Dipartimento di Scienze Biomediche delle Cellule & Sistemi, Università di Groningen, Paesi Bassi) per il loro inestimabile sostegno e condivisione di reagenti, Holger Lorenz Imaging Facility, Università di Heidelberg, Germania) per il suo sostegno con microscopia confocale ed elaborazione delle immagini, e Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australia) per la lettura critica del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

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References

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Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

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