Summary
Den nuvarande artikeln beskriver ett detaljerat protokoll för isocaloric 2:1 intermittent fasta för att skydda och behandla mot fetma och nedsatt glukosmetabolism i vildtyp och ob/ob möss.
Abstract
Intermittent fasta (om), en Dietary intervention med periodisk energi begränsning, har ansetts ge många fördelar och motverka metabola avvikelser. Hittills har olika typer av om modeller med varierande varaktighet av fasta och utfodring perioder har dokumenterats. Att tolka resultaten är dock utmanande, eftersom många av dessa modeller involverar multifaktoriella bidrag från både tids-och kaloribegränsnings strategier. Till exempel, den alternativa dagen fastan modell, som ofta används som en gnagare om regim, kan resultera i underfeeding, vilket tyder på att hälsofördelar från denna intervention sannolikt förmedlas via både kalori begränsning och fasta-Refeeding cykler. Nyligen har det framgångsrikt visat att 2:1 om, bestående av 1 dag av fasta följt av 2 dagars utfodring, kan ge skydd mot kost-inducerad fetma och metabola förbättringar utan en minskning av totala kaloriintaget. Presenteras här är ett protokoll av denna isocaloric 2:1 om intervention i möss. Dessutom beskrivs ett par matning (PF) protokoll som krävs för att undersöka en musmodell med förändrade äta beteenden, såsom hyperfagi. Med hjälp av 2:1 om regimen, det visas att isocaloric om leder till minskad viktökning, förbättrad glukos homeostas, och förhöjd energiförbrukning. Sålunda, denna regim kan vara användbart för att undersöka hälsoeffekterna av om på olika sjukdomstillstånd.
Introduction
Modern livsstil är förknippad med längre dagliga födointag tid och kortare faste perioder1. Detta bidrar till den nuvarande globala fetmaepidemin, med metabola nackdelar ses hos människor. Fastan har praktiserats i hela mänsklighetens historia, och dess olika hälsofördelar inkluderar långvarig livslängd, minskad oxidativ skada, och optimerad energi homeostas2,3. Bland flera sätt att öva fasta, periodisk energibrist, kallas intermittent fasta (om), är en populär diet metod som är allmänt praktiseras av den allmänna befolkningen på grund av dess enkla och enkla regim. Nyligen genomförda studier i prekliniska och kliniska modeller har visat att om kan ge hälsofördelar jämförbara med långvarig fasta och kalori begränsning, vilket tyder på att om kan vara en potentiell terapeutisk strategi för fetma och metabola sjukdomar2,3,4,5.
OM behandlingsregimer varierar i termer av fasta varaktighet och frekvens. Alternerande dag fasta (dvs 1 dag utfodring/1 dag fasta; 1:1 om) har varit den mest använda om regimen hos gnagare för att studera dess positiva hälsoeffekter på fetma, hjärt-kärlsjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar, etc.2,3. Men, som visas i tidigare studier6,7, och ytterligare mekanistiskt bekräftas i vår energiintag analys8, 1:1 om resultat i matning (~ 80%) på grund av bristen på tillräcklig matningstid för att kompensera för energiförluster. Detta gör det oklart om de hälsofördelar som 1:1 om förmedlas genom kalorirestriktion eller modifiering av mat mönster. Därför, en ny om regim har utvecklats och visas här, bestående av en 2 dag utfodring/1 dag fasta (2:1 IF) mönster, som ger möss med tillräckligt med tid för att kompensera för födointag (~ 99%) och kroppsvikt. Dessa möss jämförs sedan med en AD libitum (Al)-grupp. Denna regim möjliggör undersökning av effekterna av isocaloric om i avsaknad av kalori minskning av vildtyp möss.
I motsats, i en musmodell som uppvisar förändrade utfodring beteende, AL utfodring maj inte bli en ordentlig kontrollvillkor till jämföra och undersöka den verkningen av 2:1 om. Till exempel, eftersom ob/ob möss (en vanligt förekommande genetisk modell för fetma) uppvisar hyperfagi på grund av avsaknaden av leptin reglerande aptit och mättnad, de med 2:1 om Exhibit ~ 20% minskad kaloriintag jämfört med ob/ob möss med Al utfodring. För att på ett korrekt sätt undersöka och jämföra effekterna av om det i ob/ob -möss, en par-utfodring grupp som en lämplig kontroll måste användas.
Sammantaget är ett omfattande protokoll som tillhandahålls för att utföra isocaloric 2:1 om, inklusive användning av en par-utfodring kontroll. Det är vidare visat att isocaloric 2:1 om skyddar möss från fettrik diet-inducerad fetma och/eller metabolisk dysfunktion i både vildtyp och ob/ob möss. Detta protokoll kan användas för att undersöka de positiva hälsoeffekterna av 2:1 om på olika sjukdomstillstånd inklusive neurologiska sjukdomar, hjärt-kärlsjukdomar, och cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder och protokoll här har godkänts av djuromsorg kommittéer inom djuromsorg och veterinärtjänst (ACVS) vid University of Ottawa och centrum för Fenogenomik (TCP) och överensstämmer med normerna i det kanadensiska rådet om djuromsorg. Det bör noteras att alla förfaranden som beskrivs här bör utföras under institutionellt och myndighetsgodkännande samt av personal som är tekniskt kunnig. Alla möss var inhysta i standardventilerade burar i temperatur-och fuktighets-kontrollerade rum med 12 h/12 h ljusa/mörka cykler (21 – 22 ° c, 30% – 60% luftfuktighet för normala bostäder) och fri tillgång till vatten. Manliga C57BL/6J och ob/ob möss erhölls från Jackson Laboratory.
1.2:1 isokalori om regim
- För Lean och diet-inducerad fetma musmodeller, förbereda antingen en normal diet (17% fett, ND) eller fettrik diet (45% fett, HFD).
Anmärkning: 60% HFD kan användas för att inducera svår diet-inducerad fetma; ändå, på grund av mjukhet i matpelleten, det är relativt svårt att exakt mäta dagligt födointag. Ett automatiserat kontinuerligt mätsystem kan förbättra mångsidigheten för flera typer av Dieter. - Mät baseline kroppsvikt och kroppssammansättning av varje mus vid 7 veckors ålder med hjälp av en skala och EchoMRI, respektive.
Anmärkning: Se avsnitt 3 för mätning av kroppssammansättning. - Baserat på kroppsvikt och kroppssammansättning resultat, slumpmässigt och jämnt dela 7 vecka gamla manliga C57BL/6J möss i två grupper: AD libitum (AL) och intermittent fasta (om) grupper.
- Placera två till tre möss per bur och säkerställ fri tillgång till dricksvatten.
Anmärkning: Antalet möss per bur kan påverka födointag beteende. Det rekommenderas att bibehålla lika många möss per bur i alla grupper under studien. - Ge 1 vecka av acklimatisering till den nya buren miljö och diet innan om regimen.
- Fastande period: flytta möss till en ren bur med fräscha sängkläder på 12:00 PM. Lägg inte till mat för IF-gruppen, samtidigt som en vägd mängd mat till AL-gruppen.
Anmärkning: För varje fastande cykel är det viktigt att byta burar för både AL-och IF-grupper för att säkerställa att båda grupperna utsätts för samma mängd hanteringstid. - Efter 24 h, mäta vikten av möss i båda grupperna och överblivna mat i AL burar.
Anmärkning: Se till att inkludera vikten av mat smulor på maten Hopper och botten av buren, särskilt när du använder HFD, som möss ofta bort små pellets eller fragment av mat från behållaren och hålla dem nära boet platser. Den genomsnittliga energiintaget per mus i slutet av varje 2:1 cykel (3 dagar) är cirka 35 kcal, motsvarande ~ 10 g för en normal diet (3,3 kcal/g) och ~ 7 g för HFD (4,73 kcal/g). - Utfodringsperiod: ge en vägd mängd mat på 12:00 PM för både AL och om grupper.
- Efter 48 h att ge maten, mäta vikten av överblivna livsmedel och möss.
- Upprepa steg 1.6 – 1.10 under studiens varaktighet (t. ex. 16 veckor).
2. kontrollgrupp för par matning (PF)
Anmärkning: För ett IF-experiment där förändrat utfodringsbeteende observeras i en musmodell (t. ex. hyperfagi hos ob/ob -möss), är det nödvändigt att ha en par matnings grupp som en kontroll för korrekt kalorioberoende jämförelse med IF.
- För PF kontrollgruppen, vackla experiment schema så att samma mängd mat som förbrukas av om gruppen erbjuds till PF-gruppen (figur 2).
- Mät mängden mat som förbrukas av IF-gruppen under 2 dagar efter en återutfodringsperiod.
- Dela denna mängd konsumeras mat i IF-gruppen jämnt i tre proportioner och ge den dagligen till PF-gruppen på 12:00 PM.
Anmärkning: Att ge lika mycket mat dagligen är avgörande. När det gäller möss med hyperfagi, om parmatade möss förses med en mängd mat mindre än deras frivilliga konsumtion på en gång, kommer de sannolikt att konsumera all mat och bli effektivt fastande. Detta kan då förhindra en ordentlig jämförelse med om-behandlade möss och blanda ihop resultatet. - Upprepa steg 2.1 – 2.3 under studiens varaktighet.
3. analys av kroppssammansättning
Anmärkning: Eftersom långvarig om påverkar kroppsvikt hos möss, kroppssammansättning kan mätas vid lämpliga cykler (t. ex. varje 3 eller 4 cykler) med hjälp av en kropp sammansättning analysator för att kvantifiera fett och muskelmassa i levande, icke-sövda möss.
- Aktivera kropps kompositionanalysatorn.
Anmärkning: Innan du startar programmet, lämna maskinen på i minst 2 – 3 h för att värma upp. - Kör ett system test på kroppssammansättning analysatorn för att testa dess mätnoggrannhet. Vid behov, kalibrera systemet med rapsolja och vattenprover.
- Mät kroppsvikten för varje mus.
- Placera musen i en liten djur cylindrisk hållare.
- Infoga en avgränsare för att begränsa den fysiska förflyttningen av musen under mätningen och placera hållaren i kropps kompositionanalysatorn.
- Kör skanningsprogrammet.
Anmärkning: Det tar ungefär 90 – 120 s att analysera. - Efter mätningen, ta bort hållaren från utrustningen och föra musen tillbaka till buren.
Anmärkning: Ett mer detaljerat protokoll finns i en tidigare publikation9.
4. glukos-och insulin tolerans test
- För glukostoleranstest (GTT), mäta kroppsvikt och kroppssammansättning av varje mus innan de utsätts för fasta och markera svansen med en permanent markör för enkel och snabb indexering.
- Placera möss i nya burar utan mat på 7:00 PM för övernattning fasta.
Anmärkning: Fasta natten är standardprotokollet, men på grund av musfysiologi (t. ex. ökad glukos användning efter långvarig fasta10,11), kan kortare fasta (~ 6 h) användas som beskrivs för ITT. - Efter fastan 14 – 16 h (9:00 i följande morgon), mäta kroppsvikt och kroppssammansättning av varje mus och beräkna mängden glukos dosering baserat på kroppsvikt.
Anmärkning: För att undvika överskattning av glukosintolerans hos feta möss, muskelmassa erhålls från kroppen sammansättning analys kan användas för att beräkna glukos dosering12,13. - För varje mus, skär spetsen på svansen (0.5-1.0 mm) med ren kirurgisk sax. Efter avtorkning av den första bloddroppen, dra en ny droppe blod från svansen och mäta baslinjen fastande blodglukosnivå med Glukometer.
Anmärkning: Ytterligare svans skärning krävs inte för varje blodsockermätning under GTT eller ITT. Såret kan fräschas upp genom att slipa den med gasväv för att dra en droppe blod. - Ämne möss till en intraperitoneal (i.p.) injektion av glukos (1 mg/g kroppsvikt).
Anmärkning: Baserat på syftet med ett experiment (t. ex. undersöka inkretinsystemet-effekter) kan oral administrering av glukos utföras av oral sonder. Protokollet för oral GTT (OGTT) finns i en annan studie14. - Mät blodsockret från svansen vid 0, 5, 15, 30, 60 och 120 min efter glukos injektion.
- Efter avslutad GTT, ge en tillräcklig mängd mat.
- För insulin tolerans test (ITT), ta bort mat på 9:00 AM.
Anmärkning: Eftersom både GTT och ITT är stressinducerande upplevelser för möss som kan höja blodsockernivåerna och ändra fysiologi, rekommenderas det att utföra ITT efter att ha tillhandahållit minst 2 – 3 dagars återhämtning efter GTT-experimentet. - Efter fasta i 6 h (3:00 PM), Mät baslinje blodglukos från svansen som beskrivs i steg 4,4.
- Ämne möss till i.p. injektion av insulin (0,65 me/g kroppsvikt).
- Mät blodglukos från svansen vid 0, 15, 30, 60, 90, och 120 min efter insulin injektion.
- Efter avslutad ITT, ge en tillräcklig mängd mat.
5. indirekt kalorimetri
Anmärkning: Energimetabolism av om-behandlade möss kan utvärderas ytterligare genom indirekt calorimetri över en enda cykel av IF. Detta kommer att mäta syreförbrukning (VO2), koldioxidproduktion (VCO2), ANDNINGS bytesförhållandet (RER), och värme (kcal/h).
- Slå på strömmen till det indirekta konkalorimetern systemet minst 2 h innan du kör experimentet.
Anmärkning: Detta system Warm-Up är viktigt för noggrann mätning. - Förbered burar med rena sängkläder, Fyll vattenflaskor, och tillsätt den förvägda mängden Chow till maten trattar.
- Kontrollera skick Drierite och lime soda. Om en färgindikator på Drieriten verkar rosa, vilket indikerar att Drieriten har absorberat en hög mängd fukt, är det nödvändigt att ersätta eller topp med färsk Drierite.
- Kalibrera systemet med en gas med den specifika sammansättningen (0,5% CO2, 20,5% O2).
- Mät kroppsvikt och kroppssammansättning för varje mus, som kommer att användas för att normalisera VO2 -och VCO2 -data.
- Placera försiktigt en mus per bur.
- Montera metaboliska burar, placera dem i temperaturkontrollerad miljökammare och Anslut till gasledningar och aktivitets Givarkabel.
- När du har konfigurerat experiment profilen genom att lägga till lämpliga experimentella parametrar med hjälp av programvaran, kör du programmet för mätning. Syftet med den första dagens mätning är att ge en period av acklimatisering och mäta baseline energi metabolism.
- Vid 12:00 PM följande dag, ämne möss till 24 h av fasta genom att ta bort mat och smulor från behållaren och botten av buren. Byt vid behov med rena sängkläder.
- Efter 24 h, tillsätt den förvägda mängden Chow till mat Hopper för påfyllning perioden.
- Fortsätt att mäta för nästa 48 h. Kontrollera regelbundet om systemet körs utan avbrott i maskin-eller programvara.
- Efter avslutad mätning, avsluta programmet och föra möss tillbaka till sina ursprungliga burar. Mäta mängden överblivna livsmedel för att undersöka födointag.
- Det detaljerade protokollet för indirekt calorimetri finns i en tidigare studie9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar utfodringsanalyserna efter 24 h fasta och jämförelsen mellan 1:1 och 2:1 intermittent fasta. En 24 h faste period resulterade i en ~ 10% minskning av kroppsvikten, som återfanns helt efter 2 dagars påfyllning (figur 1a). En 24 h faste period inducerade hyperfagi under de efterföljande 2 dagarna av påfyllning (figur 1B). Ändå visade jämförelsen av energiintaget mellan 1:1 alternativ dag fasta och 2:1 intermittent fasta att 1 dag av återutfodringen perioden i 1:1 om inte var tillräcklig (~ 80%) för att kompensera för kalori förlusten genom fasta, jämfört med AL villkoret (figur 1C). Å andra sidan, 99% av energiintaget kompenserades fullt ut under 2 dagar av påfyllning i 2:1 om. Denna regim möjliggör undersökning av effekterna av isocaloric om det är oberoende av kaloriintaget skillnad.
Figur 2 illustrerar en schematisk tidslinje för isocaloric 2:1 IF och PF regimer. För att minimera skillnaderna i kaloriintag, en observation som gjorts i varannan dag fasta6,7, detta protokoll etablerat en ny om regim bestående av 2 dagars utfodring och 1 dag fasta perioder (2:1 IF)8, vilket möjliggjorde undersökning av hälsoeffekterna av isocaloric om i vildtyp möss. Men i ob/ob möss, som uppvisade hyperphagic beteende, 2:1 om-behandlade ob/ob möss visade en 21% kaloriintag minskning, jämfört med ob/ob Al möss15. Eftersom detta förhindrar en ordentlig kalori-oberoende jämförelse, en PF kontrollgrupp som upprätthöll samma kaloriintag som om-behandlade ob/ob möss användes. Kortfattat, den totala mängden mat som konsumeras under 2 dagar av utfodring i 2:1 om möss delades lika i tre dagliga mängder, sedan lämnas till PF gruppen.
För en omfattande översikt över de metabola resultaten av 2:1 om, Vi jämförde effekterna av AL, om, och PF i kroppsvikt, födointag och kroppssammansättning i vildtyp och ob/ob möss under normal diet (nd) och HFD. Jämfört med AL, om behandling ledde till lägre kroppsvikt ökning av ND-Fed och HFD-Fed WT möss utan signifikanta skillnader i födointag (figur 3A, B). Kroppssammansättning analys visade att om specifikt reducerad fettmassa utan förändringar i muskelmassa i vildtyp möss (figur 3C). Det är möjligt att en något, om än inte signifikant, lägre ackumulerat energiintag under 16 veckor av IF-programmet kan resultera i minskad viktökning på djur. Emellertid, om experiment med parutfodringsregim bekräftade att den minskade kropps viktökning av om inte berodde på förändrat energiintag (figur 3D, E). Till skillnad från vilda djur, kroppsvikt för ob/ob -möss som UTSATTES för IF (ob-IF) var lägre än för ob-Al möss (figur 3G). Detta beror på hyperfagi (överdrivet ätande) av ob/ob- möss, vilket leder till milt högre (21%) födointag hos AL-möss, jämfört med om-behandlade djur (figur 3H). Därför, att specifikt undersöka den metaboliska effekten av om på ett kalori-oberoende sätt, en par-utfodring kontrollgrupp var anställd. Men till skillnad från vilda möss8var ob-PF-möss omöjliga att särskilja jämfört med ob-om möss i kroppsvikter och kroppssammansättning15 (figur 3i). Dessa resultat tyder på att leptin är sannolikt inblandad i isokalori om-medierad kroppsvikt minskning hos möss.
Den stora metaboliska förmånen av isocaloric om är den förbättrade glukos homeostas. Som visas i figur 4A, B, C, D, HFD-om möss uppvisade en signifikant förbättring i glukos homeostas. GTT visade att blodsockret snabbare elimineras hos om-behandlade möss, medan ITT visade högre insulinkänslighet hos HFD-om möss, jämfört med möss med HFD-AL eller HFD-PF. Oväntat, trots misslyckanden i om-medierad viktminskning, OB-om djuren uppvisade signifikant förbättrad glukos hantering med mindre glukos utflykter i GTT, jämfört med ob-PF möss (figur 4E), medan insulinkänsligheten var omöjlig att skilja mellan ob-IF och OB-PF möss (figur 4F). Detta förbättrade glukos homeostas i OB-om möss sannolikt medieras av ökningar i plasmanivån av glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) och glukossänkande insulinsekretion (data visas inte)15. Sammantaget, genom att använda denna 2:1 om protokoll och korrekt kalori-oberoende PF kontroll, vi visade de metabola fördelarna av isocaloric om i vildtyp och ob/ob möss.
En av de metabola effekterna av om i vildtyp möss är högre total O2 förbrukning, används för att uppskatta energiförbrukningen (figur 5A, B). Denna höjning i O2 -förbrukning konstaterades endast under utfodringsperioden om möss, men inte faste perioden, JÄMFÖRDES med Al-möss. Den ökade energiförbrukningen var till stor del medierad av fett thermogenesis, såsom Browning av vita fettvävnader och aktivering av Brun fettvävnad (data som inte visas)8,16. Om-medierad fett thermogenesis skulle förmodligen förklara hur vild-typ möss utsätts för om uppvisade minskad kroppsvikt vinst utan skillnad i födointag, jämfört med Al möss. Å andra sidan, om den inte ökar O2 -konsumtionen i ob/ob -möss (figur 5C-D), och till och med ledde till en minskning av energiförbrukningen under fastande period. Konsekvent, om-inducerad fett thermogenesis avskaffades helt i ob/ob möss (data visas inte). Dessa data tyder på en möjlig begränsning av om eftersom det kan fungera annorlunda för personer med olika genetiska och miljömässiga bakgrunder.
Figur 1: Utfodringsanalyser efter 24 h fasta och jämförelse mellan 1:1 och 2:1 om. A) dagliga kroppsvikt förändringar av möss före och efter 24 h fasta (n = 10). B) dagligt energiintag före och efter 24 h fasta (n = 5 burar, 2 möss per bur). (C) jämförelse av energiintaget mellan varannan dag fasta (dvs 1 dag utfodring/1 dag fasta, 1:1 om) och 2:1 intermittent fasta(dvs 2 dag utfodring/1 dag fasta). I 1:1 om regim, endast ~ 80% av födointag kompenserades under den efterföljande 1 dag av påfyllning jämfört med födointag över 2 dagar av utfodring. Å andra sidan, 99% av energiintaget uppnåddes när 2 dagar av påfyllning gavs, jämfört med det under 3 dagar av utfodring. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Denna siffra reproducerades med tillstånd från Kim et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av isocaloric 2:1 om regimen. För PF kontroll, mängden livsmedel som konsumeras under 2 dagar av utfodring av om-behandlade möss är uppdelad i tre lika delar, som sedan ges dagligen till PF möss under nästa cykel. AL = AD libitum; PF = par matning. En del av denna siffra reproducerades med tillstånd från Kim et al.8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: jämförelse av AL-, IF-och PF-effekter på kroppsvikt, födointag och kroppssammansättning mellan vildtyp och ob/ob- möss. (a, B, C) Kroppsvikt, födointag och kroppssammansättning i AL-eller IF-behandlade vildtyp möss under normal diet (ND) eller fettrik diet (HFD) under 16 veckors behandling. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. (ND-AL: n = 7; ND-om: n = 8; HFD-AL: n = 7; och HFD-IF: n = 8); en-eller tvåvägsanova med student-Newman-Keuls post-hoc analys; * * p < 0,01 vs. HFD-AL. (D, E, F) kroppsvikt, födointag, och kroppssammansättning i PF vs. om möss utfodras med FETTRIK diet (HFD) under 12 veckor om regimen. (PF: n = 6 och om: n = 6); tvåsidiga unparade Students t-test; * p < 0,05 vs. HFD-PF; NS = inte signifikant. (G, H, I) Kroppsvikt, födointag och kroppssammansättning i AL, PF, eller om-behandlade ob/ob -möss som utfodrats med normal Chow (ob-Al: n = 4; OB-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); OB-AL vs. OB-PF: *p < 0,05; OB-AL vs. OB-om: * p < 0,05; OB-PF vs. OB-IF. Panelerna A – F reproducerades med tillstånd från Kim et al.8. Paneler G-jag reproducerades med tillstånd från Kim et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förbättrad glukos homeostas av om det är i både vildtyp och ob/ob- möss. (a, B) Intraperitoneal GTT och ITT i HFD-AL och HFD-om möss med vildtyp efter 16 veckors om-regim. Insetet visar arean under kurva (AUC); * p < 0,05 mot HFD-Al. (C, D) GTT och ITT i HFD-PF jämfört med HFD-om möss med vildtyp efter 12 veckors om-regim. Den infälld visar AUC; * p < 0,05 vs HFD-PF. (E, F) GTT och ITT i OB-om jämfört med ob-PF möss efter 16 veckors om regim. Den infälld visar AUC (* p < 0,05 vs. OB-PF). Panelerna A – D återges med tillstånd från Kim et al.8. Panelerna E och F reproducerades med tillstånd från Kim et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: analys av energiförbrukning i om-behandlade vildtyp och ob/ob -möss. (A) spår av O2 -förbrukning under en cykel av 2:1 om de är i vildtyp möss (dvs. 1 dagars fasta följt av 2 dagars utfodring). (B) genomsnittet av O2 förbrukning per timme under fasta, utfodring, och en cykel av 2:1 om. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (HFD-AL: n = 6; och HFD-IF: n = 12). * p < 0,05 vs. HFD-AL. (C) O2 förbruknings spår av ob/ob -möss under en cykel av 2:1 om. D) genomsnittet av O2 förbrukning per timme under fasta, utfodring och en cykel av 2:1 om (ob-PF: n = 7; OB-IF: n = 6); * p < 0,05 vs. OB-PF. panel B reproducerades med tillstånd från Kim et al.8. Panelerna C och D återges med tillstånd från Kim et al.15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har varit väl dokumenterat att om ger positiva hälsoeffekter på olika sjukdomar hos både människor och djur8,15,16,17,18,19. Dess bakomliggande mekanismer, såsom autofagi och Gut microbiome, har nyligen klargjorts. Det presenterade protokollet beskriver en isocaloric 2:1 om regim hos möss för att undersöka kalori-oberoende metabola fördelar om mot diet-inducerad fetma och tillhörande metabolisk dysfunktion. Till skillnad från den alternativa dagen fasta (1:1 IF) protokoll som resulterar i en minskning av totala kaloriintaget6,7, ger 1 mer dag av påfyllning i 2:1 om regimen möjliggör underhåll av ett isokalori tillstånd i vildtyp möss.
Dessutom, jämfört med 1:1 om, den 2:1 om regimen kan minska eventuell fastande-medierad stress eller dvala i möss20 och är också jämförbar med en populär diet metod, den 5:2 diet2. Även om dess effekter inte har testats, kan regimen ändras genom att ge ytterligare dagar av påfyllning (t. ex., 3:1 eller 4:1 om). Dessutom kan detta protokoll som presenteras lätt justeras till en timme skala kallas tidsbegränsad utfodring (TRF), där tillgången till livsmedel är begränsad till 8 h per dag under den aktiva fas21, som är känd för att uppnå en isocaloric diet regim och ge metabola fördelar mot HFD-inducerad fetma och diabetes19,21,22.
Som framgår av utfodringen analys (figur 1B), hyperphagic beteende omedelbart efter 24 h av fasta minskar gradvis i vildtyp möss, vilket möjliggör isocaloric om. Emellertid, detta isocaloric tillstånd kan inte uppnås i ob/ob möss, eftersom de saknar leptin signalering-medierad mättnad och energimetabolism, vilket leder till en kontinuerlig hyperphagic fenotyp23,24. Innan du utför ett IF-experiment rekommenderas därför att undersöka matnings beteendet för musmodellen av intresse. För att undersöka effekterna av om du använder en hyperphagic Mouse-modell (t. ex. ob/ob, db/DB, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26, enligt beskrivningen i detta protokoll, är anställning av en par matnings grupp som en isokalori experimentell kontroll viktig för att göra riktiga jämförelser. Det kräver också noggrann planering när man testar en musmodell med en hypophagic fenotyp (t. ex., melanin-innehållande hormon KO möss)27.
En viktig faktor att överväga för om studier är bostäder temperatur, som påverkar olika fysiologiska och beteendemässiga parametrar hos möss. Särskilt kall exponering (4 – 6 ° c) ökar avsevärt energiintaget för att bibehålla kroppstemperaturen28. I de termiska förhållanden (30 ° c) under vilka värme förstärkningen balanseras genom värmeförluster minskar däremot minskningen av livsmedelskonsumtionen8. När det gäller metabola resultat inducerar kall exponering fett thermogenesis, som hämmas av thermoneutral skick. Därför är det förväntas att boende temperaturen påverkar metaboliska fenotyper av om och lämplig utfodring: fastande förhållande för att uppnå isokalori om.
Det har faktiskt tidigare visats att isocaloric 2:1 om kan uppnås i thermoneutral villkor, vilket leder till förbättrad metabolisk hälsa i diet-inducerad fetma och metabolisk dysfunktion utan skillnader i födointag mellan IF och AL grupper8. Emellertid, isocaloric om inte kan uppnås med 2:1 förhållandet vid låga temperaturer eftersom möss under kall exponering kommer att visa en hyperphagic fenotyp, vilket leder till matning i IF-gruppen. Eftersom kall exponering och om Visa jämförbara metabola resultat och mekanismer (dvs., fett thermogenesis och förbättrad glukos homeostas) som hjälper till att bekämpa fetma, det finns intresse av att kombinera dessa två insatser för att maximera metabolisk effekt. Därför, för att korrekt testa detta, utför utfodringsanalysen innan du kör ett IF-experiment och använda en par-utfodring kontrollgrupp under kall exponering rekommenderas.
Andra faktorer som potentiellt kan påverka resultaten av om studierna inkluderar boendetäthet. Liknande den tidigare studien, som visade minskad livsmedelskonsumtion i mer tätt inhysta möss29, möss från en bur av fem konsumeras betydligt mindre mat än de från en bur av två (opublicerade resultat). Dessutom har det visats att kapslings tätheten påtagligt påverkar omgivningstemperaturen, eftersom temperaturen i en bur som rymmer fem möss är 1 – 2 ° c högre än de som rymmer en till två möss30. Även om denna studie drog slutsatsen att bostadsdensiteten inte signifikant påverkade födointag (undersökt för 5 veckor), i en IF-studie som varar 12 – 16 veckor, temperaturen inuti buren påverkas av bostäder densitet kan fortfarande påverka födointag och energimetabolism. Tillsammans, det är viktigt att hålla samma antal möss inrymt i en bur och minimera ändra antalet per bur under loppet av en studie.
Sammanfattnings, denna rapport visar ett enkelt och reproducerbart protokoll för provning isocaloric 2:1 om i möss. Även om den aktuella studien är inriktad på metabola fördelar om i diet-inducerad fetma och metabolisk dysfunktion, det kan lätt anpassas för att undersöka de skyddande och terapeutiska effekterna av isocaloric om mot andra villkor, såsom kardiovaskulära och neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
K.-H. K stöddes av Heart and stroke Foundation i Kanada Grant-in-Aid (G-18-0022213), J. P. Bickell Foundation och University of Ottawa Heart Institute start fonden; H.-K.S. stöddes av bidrag från den kanadensiska institut för hälsoforskning (PJT-162083), Reuben och Helene Dennis Scholar och Sun Life Financial nya Investigator Award för diabetes forskning från Banting & bästa diabetes Centre (BBDC) och naturvetenskap och ingenjörs forskning (NSERC) i Kanada (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. stöddes av en gemenskap från University of Ottawa kardiologi Research donationsfond. J.H.L. stöddes av NSERC doktors stipendium och Ontario Graduate stipendium. Yo stöddes av UOHI begåvad Graduate Award och Queen Elizabeth II Graduate stipendium i vetenskap och teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
References
- Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
- Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
- Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
- Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
- Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
- Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
- Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
- Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
- Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
- Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
- Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
- Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
- Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
- Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
- Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
- Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
- Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
- Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
- Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).
