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Biochemistry

कोशिकाओं और ऊतकों में कोएंजाइम ए का परिमाण

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60182
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

इस विधि से सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु ऊतकों से नमूना तैयारी का वर्णन करता है, नमूनों में कोएंजाइम ए की निकासी और व्युत्पन्नीकरण, इसके बाद उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के बाद derivatized कोएंजाइम ए के शुद्धिकरण और परिमाणीकरण के लिए अवशोषण या फ्लोरोसेंट का पता लगाने.

Abstract

उभरते अनुसंधान से पता चला है कि सेलुलर कोएंजाइम ए (सीओए) की आपूर्ति विकास, चयापचय और अस्तित्व पर एक हानिकारक प्रभाव के साथ सीमित हो सकता है। सेलुलर CoA के मापन अपनी अपेक्षाकृत कम बहुतायत और CoA thioesters के लिए मुक्त CoA के गतिशील रूपांतरण के कारण एक चुनौती है कि, बारी में, कई चयापचय प्रतिक्रियाओं में भाग लेते हैं. एक विधि है कि नमूना तैयारी के दौरान संभावित नुकसान के माध्यम से नेविगेट पता लगाने की एक व्यापक रैखिक रेंज है कि कई जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त है के साथ एक परख उपज वर्णन किया है.

Introduction

कोएंजाइम ए (सीओए) सभी जीवित जीवों में एक आवश्यक सहकारक है और पैन्टोथेनिक एसिड से संश्लेषित होता है, जिसे पैन्टोथेनेट (पैन्टोथेनिक एसिड का नमक) या विटामिन बी 5 भी कहा जाता है। CoA कार्बनिक एसिड के प्रमुख intracellular वाहक है, इस तरह के रूप में ऐसी एसीटेट और succinate के रूप में लघु श्रृंखला एसिड, शाखा श्रृंखला एसिड जैसे प्रोपिओनेट और मिथाइलमालोनेट, लंबे समय से चेन फैटी एसिड जैसे पामिटेट और oleate, बहुत लंबी श्रृंखला फैटी एसिड जैसे पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड, और वैल्प्रोइक एसिड जैसे विदेशी जीव. ऑर्गेनिक एसिड एक थायोस्टर लिंकेज का रूप ले सकता है जो कोए के साथ है ताकि इसके उपयोग को मध्यवर्ती चयापचय1में 100 से अधिक प्रतिक्रियाओं में एक सब्सट्रेट के रूप में सक्षम बनाया जा सके . कोए थायोएस्टर्स भी एलोस्टेरिक नियामकों और ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक हैं। अब यह2 की सराहना की है कि सेलुलर कुल सीओए आपूर्ति विनियमित है3,4; इस प्रकार, CoA उपलब्धता सीमित किया जा सकता है, और है कि CoA की कमी भयावह हो सकता है, के रूप में विरासत में मिला आनुवंशिक विकारों है कि CoA biosynthesisप्रभाव सेउदाहरण 5 . Pantothenate kinase कोए बायोसिंथेसिस में पहला कदम उत्प्रेरित करता है (चित्र 1) और पैन्टोथेनेट किनेस एसोसिएटेड न्यूरोडिजेनरेशन, जिसे PKAN कहा जाता है, PANK2 जीन6में उत्परिवर्तन के कारण होता है । COA synthase, COASYN जीन द्वारा इनकोडिंग, CoAbiosynthesis में अंतिम दो चरणों को उत्प्रेरित करता है (चित्र 1) और COASY प्रोटीन-एसोसिएटेड न्यूरोडेजेनरेशन, CoPAN कहा जाता है, COASYN जीन में एक उत्परिवर्तन के कारण होता है7. दोनों PKAN और CoPAN मस्तिष्क में लोहे के संचय के साथ जुड़े neurodegenerative रोगों विरासत में मिला है और CoA कम से कम रोग रोगों की कमी.

कुल CoA के सेलुलर स्तर ऊतकों के बीच भिन्न8 और कुल CoA वृद्धि या शारीरिक, रोग और औषधीय राज्यों की एक किस्म के तहत कम कर सकते हैं. लिवर CoA तेजी से राज्य9के लिए खिलाया से ईंधन स्विचन के दौरान बढ़ जाती है , और जिगर CoA स्तर असामान्य रूप से लेप्टिन की कमी मोटापे से ग्रस्त चूहों10में उच्च रहे हैं . जिगर CoA पुरानी इथेनॉल घूस11के जवाब में कम हो जाती है. Pank2 नॉकआउट माउस मॉडल में मस्तिष्क CoA स्तर प्रसव अवधि के दौरान उदास कर रहे हैं, लेकिन बाद में वयस्क चरण मस्तिष्क CoA सामग्री में जंगली प्रकार के स्तर के बराबर है, विकास के दौरान एक अनुकूली CoA प्रतिक्रिया का संकेत12. ट्रांसजेनेसिस या जीन वितरण विधियों द्वारा ऊतक कोए सामग्री का हेरफेर चयापचय और तंत्रिका कार्यों को प्रभावित करता है13,14,15. PKAN या CoPAN के लिए संभावित चिकित्सा के पूर्व नैदानिक विकास सेल या ऊतक CoA माप प्रभावकारिता के संकेतक के रूप में शामिल16,17,18,19,20 . इन शर्तों और उनके चयापचय या कार्यात्मक परिणामों के सभी का मूल्यांकन कुल CoA की माप के लिए एक मात्रात्मक विधि की आवश्यकता है.

जैविक नमूनों में CoA को मापने के लिए एक सटीक, विश्वसनीय परख कई प्रयोगशालाओं में एक तकनीकी चुनौती है. दुर्भाग्य से, वहाँ कोई जांच का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध हैं या बरकरार कोशिकाओं में CoA या CoA thioesters मात्रा, हालांकि प्राकृतिक CoA thioesters के एनालॉग व्यापक रूप से एंजाइमों का उपयोग करने के लिए CoA एस्टर के अध्ययन में मशीनी जांच के रूप में इस्तेमाल किया गया है21. CoA के रूपांतरण, एक मुक्त sulfhydryl के साथ (-SH) moiety, एक CoA thioester के लिए (या इसके विपरीत) कोशिकाओं या पशु ऊतकों में एक अलग वातावरण में स्थानांतरण के दौरान और सेल lysis के दौरान तेजी से है. कोशिकाओं में कई ऐसिल-कोए सिंथेटासेस और ऐसिल-कोए थायोएस्टेरेज़ को कोए पूल के भीतर अंतर-परिवर्तन ों को मध्यस्थता करते हैं, और अतिरिक्त एंजाइम जो कोए थायोएस्टर ्स्वेश के रूप में काउपयोग करते हैं, जैविक नमूनों में सक्रिय रहते हैं जब तक कि रासायनिक या भौतिक द्वारा मशांत न हो। मतलब. Acyl-transferases द्वारा carnitine करने के लिए CoA से acyl-समूहों की ऑफ लोडिंग प्रतिक्रियाओं के नेटवर्क के भीतर एक उदाहरण है कि CoA/CoA थायोएस्टर वितरण को बदल सकते हैं. रेडियोधर्मी अनुरेखक कोशिकाओं में CoA संश्लेषण की दरों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैविक नमूनों में CoA और CoA डेरिवेटिव को मापने के लिए वर्तमान तरीकों की समीक्षा की गई है22 और युग्मित enzymatic स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक assays, उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रक्रियाओं में शामिल हैं. हालांकि, इन तरीकों अक्सर विशेष CoA आणविक प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और कुल CoA पूल की भिन्नता के लिए अंधा कर रहे हैं. युग्मित एंजाइमी परख आम तौर पर कम पता लगाने संवेदनशीलता के कारण इनपुट सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है और रैखिकता की एक सीमित रेंज है.

हमारी प्रयोगशाला सुसंस्कृत कोशिकाओं और पशु ऊतकों में कुल सीओए के परिमाणीकरण के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया विकसित की है. रणनीति सभी CoA thioesters के hydrolysis नमूना तैयारी के दौरान केवल मुक्त CoA उपज शामिल है, बजाय बनाए रखने और CoA प्रजातियों के पूरे स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के प्रयास करने से. प्रक्रिया नमूना तैयारी के लिए व्यक्तिगत प्रकाशित तरीकों का एक संकलन है, CoA derivatization, शुद्धि और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के बाद पहचान (HPLC), और अवशोषण द्वारा derivatized CoA की मात्रा या प्रतिदीप् ति का पता लगाने23,24,25. CoA इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त दृढ़ संकल्प CoA विनियमन और CoA की कमी के उपचार के लिए एक चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास की हमारी समझ सक्षम है.

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Protocol

पशु प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल में करने के लिए भेजा प्रोटोकॉल 323 और 556 के अनुसार किया गया था और विशेष रूप से सेंट जूड बच्चों के अनुसंधान अस्पताल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित.

1. समाधान की तैयारी

नोट: सभी समाधान के लिए ultrapure पानी का प्रयोग करें और जब प्रक्रियाओं में कहा गया है।

  1. पानी में 1 एमएम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) तैयार करें।
  2. पानी में 0.25 M KOH तैयार करें।
  3. पानी में 1 एम Trizma-HCl तैयार है और पीएच 8.0 को समायोजित.
  4. एसीटोनिट्रिल (ऑप्टिमा ग्रेड) में 100 एमएम मोनोब्रोमोबिमन (एमबीबीआर) तैयार करें। एमबीबीआर के स्टॉक समाधान कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं बशर्ते कि उन्हें अंधेरे में रखा जाए क्योंकि प्रकाश के संपर्क में मोनोब्रोमोबिमन को26के लिए फोटोलीज़ कर सकते हैं .
  5. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कॉलम के लिए धो बफर तैयार करें: 50% मेथनॉल (ऑप्टिमा ग्रेड) + 2% एसिटिक एसिड।
  6. SPE कॉलम के लिए Elution बफर तैयार करें: 95% इथेनॉल (HPLC ग्रेड) जिसमें 50 एमएम अमोनियम formate.

2. CoA-bimane मानक की तैयारी

  1. एक सम्मानित स्रोत से एक उच्च गुणवत्ता वाले सीओए मानक खरीद (जैसे, अवंती ध्रुवीय लिपिड, इंक).
  2. 20 एमएम ट्रिस, पीएच 8 में सीओए का एक उच्च एकाग्रता स्टॉक समाधान तैयार करें। उच्च सांद्रता स्टॉक में सीओए की मात्रा को स्पेक्ट्रोफोटोमिट्रिक अवशोषण द्वारा 260 दउ ($ 16,800 उ-1डिग्री1डिग्री 1 ) पर निर्धारित या कन्फर्म किया जाता है। एमबीबीआर की 4 गुना मोलर अतिरिक्त जोड़ें; 10 s के लिए उच्च पर भंवर. उदाहरण के लिए, 10 m CoA के लिए बफ़र में, 40 MM mBBr जोड़ें। एमबीबीआर को यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त मात्रा में जोड़ा जाता है कि सभी सीओए को derivatized किया जाता है।
  3. कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट 4 एच अंधेरे में के लिए mBBr के साथ सीओए derivatize करने के लिए मिलाते हुए बिना। एमबीबीआर सीओए के थायोल समूह के साथ प्रतिक्रिया करता है, और यह पीएच और तापमान पर निर्भर27है। एमबीबीआर के अलावा CoA एक पानी में घुलनशील फ्लोरोसेंट (या पराबैंगनी अवशोषक) CoA-bimane (CoA-bimane; चित्र 2)
  4. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 10 s के लिए उच्च पर 100 $L एसिटिक एसिड और भंवर जोड़ें.
  5. किसी भी precipitant को दूर करने के लिए 15 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. गैर-प्रतिक्रिया व्यक्त किए गए एमबीबीआर (नीचे वर्णित) को निकालने के लिए एक SPE-स्तंभ का उपयोग करके supernatant को क्लीन-अप करें। एसपीई कॉलम क्लीन-अप (धारा 5-8) के बाद निस्पंदन और अपकेंद्रण की आवश्यकता नहीं है।
  7. एक पूर्व वजनी ट्यूब में CoA-bimane युक्त SPE कॉलम से eluate ले लीजिए, नाइट्रोजन गैस के तहत सूखी, वजन और CoA-bimane की ज्ञात मात्रा के साथ एक मानक अंशांकन वक्र का निर्माण.
    1. HPLC द्वारा शुद्धता के लिए CoA-bimane मानक की जाँच करें (नीचे देखें) दोनों पर अवशोषण का पता लगाने के साथ $260 (adenine moiety) और $393 (bimane moiety) और क्रोमैटोग्राम में दोनों चोटियों के संयोग.
    2. $ 260 एनएम ($ 16,800 M-1] सेमी-1) का उपयोग करके उच्च सांद्रता स्टॉक में CoA-bimane मानक की मात्रा की पुष्टि करें।
  8. CoA-bimane मानक का उपयोग कर प्रयोगात्मक नमूनों में CoA-bimane की पहचान के लिए HPLC प्रतिधारण समय रजिस्टर.
  9. प्रकाश से सुरक्षित और 2 साल तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत CoA-bimane मानक के उच्च एकाग्रता स्टॉक के alicots स्टोर। बार-बार थिंग और री-फ्रीजिंग से बचें।

3. निष्कर्षण और सुसंस्कृत कोशिकाओं में सीओए के derivatization

  1. संस्कृति में फसल अनुयायी कोशिकाओं जब देर से subconfluent घनत्व आ रहा है. उदाहरण के लिए, मानव हेपG2/C3A कोशिकाओं को 6-8 x 106,या HEK 293T कोशिकाओं के घनत्व के लिए बड़े हो रहे हैं $1.3 x 107 प्रति 100 मिमी पकवान.
    1. CoA दृढ़ संकल्प के लिए नियमित रूप से डुप्लिकेट या त्रिफला संस्कृतियों का उपयोग करें. व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करने के लिए नमूना सेल संस्कृतियों के साथ समानांतर में अलग संस्कृति व्यंजन इनक्यूबेट करें। HPLC शुद्धि के बाद प्रति 106-107 कोशिकाओं पर सीओए की राशि की गणना करें।
  2. Aspirate संस्कृति पकवान बंद मध्यम. किसी भी अवशिष्ट माध्यम को हटाने और डिश से पीबीएस को जल्दी से हटाने के लिए बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ डिश पर कोशिकाओं को धो एंडिएट करें। निशा: पीबीएस को जल्दी से बर्फ के ठंडे पानी से धो लें और जल्दी से पानी को निकाल लें। पीबीएस या पानी जोड़ते समय अनुयायी कोशिकाओं को परेशान करने से बचें।
  3. संस्कृति पकवान करने के लिए बर्फ ठंडा पानी की 1 एमएल जोड़ें. पकवान में ठंडे पानी में कोशिकाओं को स्क्रैप करें और सेल निलंबन को 0.25 एम KOH और 1.5 एमएल पानी के 400 डिग्री एल वाले कांच परपरीक्षण ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. 10 s के लिए उच्च पर भंवर द्वारा जोरदार निलंबन मिक्स. फिर पानी के स्नान में मिलाते हुए बिना 1 एच के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन फिल्म और इनक्यूबेट के साथ कसकर कवर करें। नमूने का पीएच $ 12 होना चाहिए। उच्च पीएच CoA thioesters hydrolyze करने के लिए महत्वपूर्ण है और यदि आवश्यक हो तो KOH के अतिरिक्त aliquots के साथ समायोजित किया जा सकता है।
  4. फसल सुसंस्कृत कोशिकाओं को कम गति पर centrifugation द्वारा निलंबन में बढ़ रही है: 136 x g के लिए 6 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस. बर्फ ठंडा पीबीएस के साथ एक बार धो लें, तो संक्षेप में ठंडे पानी के साथ फिर से धो लें, और अंत में ठंडे पानी के 2.5 एमएल में फिर से निलंबित प्लस 400 $L 0.25 एम KOH. ऊपर वर्णित 55 डिग्री सेल्सियस पर जोरदार मिश्रण और इनक्यूबेट करें।
  5. 1 एम ट्रिजमा-एचसीएल के 160 डिग्री सेल्सियस और 100 एमएम एमबीबीआर के 10 डिग्री एल जोड़ें और 10 s के लिए उच्च पर भंवर द्वारा मिश्रण करें। यह लगभग 8 करने के लिए पीएच लाता है मुक्त CoA के साथ mBBr प्रतिक्रिया का समर्थन. कवर और कमरे के तापमान पर नमूनों को कवर 2 एच के लिए अंधेरे में mBBr CoA के thiol के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए.
  6. एसिटिक एसिड के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 10 s के लिए उच्च पर भंवर द्वारा मिश्रण
  7. 15 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज को वेधित सेल मलबे को हटाने के लिए।
  8. निकालें और नीचे वर्णित है कि एसपीई कॉलम साफ अप के लिए एक गिलास परीक्षण ट्यूब में supernatant बचाने के लिए।

4. ऊतकों में सीओए का निष्कर्षण और व्युत्पत्ति

  1. पशु ऊतक टुकड़े विच्छेदन, के बारे में 0.5 सेमी व्यास या छोटे, और शोषक कागज पर संक्षेप में (1-2 s) दाग और फिर प्रसंस्करण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज। ऊतकों में सीओए हाइड्रोलिज़्ड होता है या एक थायोस्टर में परिवर्तित हो जाता है यदि फ्लैश जमे हुए नहीं होता है। यह चरण ऊतकों में CoA की अधिकतम उपज प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. वजन जमे हुए ऊतक टुकड़े (5 - 60 mg) जल्दी से विश्लेषण शुरू करने से पहले, और प्रत्येक नमूने के लिए वजन रिकॉर्ड. इस गीला वजन निर्धारण HPLC शुद्धि के बाद सीओए सामग्री की गणना के लिए प्रयोग किया जाता है। ऊतक के टुकड़ों की पूरी आंधी से बचें।
  3. एक ग्लास टेस्ट ट्यूब (उदाहरण के लिए, 13 मिमी x 100 मिमी डिस्पोजेबल) एक जांच और एक रोटर-स्टेटर homogenizer के साथ ऊतक विघटन की प्रविष्टि के लिए किस्मत में 1 मिमी KOH के 2 एमएल जोड़ें। उपयोग होने तक ट्यूब को बर्फ पर रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि नमूनों को ठंडे तापमान पर homogenized कर रहे हैं और सीओए homogenization के दौरान उत्पन्न गर्मी के कारण नष्ट नहीं है.
  4. 30 एस के लिए कांच की परख नली (ठंड 1 एमएम KOH युक्त) में स्थानांतरण और homogenize ऊतक (30 - 40 मिलीग्राम) ऊतक की पूरी thawing से बचें।
  5. 0.25 एम KOH के 500 $L जोड़ें; 10 s के लिए उच्च पर भंवर और बर्फ पर रखने के लिए जब तक सभी नमूने homogenized हैं. यह 12 से ऊपर के नमूने के पीएच लाने के लिए सीओए थायोएस्टर्स कुल सीओए (मुक्त सीओए + hydrolyzed CoA थायोएस्टर) उपज के लिए hydrolyze होगा।
  6. जल अपघटन का समर्थन करने के लिए मिलाते हुए बिना पानी के स्नान में 2 एच के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के नमूने।
  7. 1 एम ट्रिजमा-एचसीएल के 150 डिग्री एल और 100 एमएम एमबीबीआर के 10 डिग्री एल जोड़ें; 10 सेकंड के लिए उच्च पर भंवर. यह मुक्त CoA के साथ एमबीबीआर प्रतिक्रिया का समर्थन करने के बारे में 8 के लिए पीएच लाता है।
  8. सभी सीओए एमबीआर के साथ derivatized है यह सुनिश्चित करने के लिए अंधेरे में 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट नमूने।
  9. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 10 s के लिए उच्च पर एसिटिक एसिड और भंवर के 100 डिग्री एल जोड़ें।
  10. 15 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज को गोली से उकेर दिया सेल मलबे.
  11. निकालें और SPE स्तंभ साफ अप के लिए एक गिलास परीक्षण ट्यूब में supernatant बचाने के लिए (नीचे वर्णित).

5. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) स्तंभ के साथ नमूना साफ-अप

  1. कमरे के तापमान पर, प्रत्येक डिस्पोजेबल 2-(2-pyridyl)-एथिल सिलिका जेल कॉलम (1 एमएल आकार) के साथ 1 एमएल वॉश बफर के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए कि पाइरिडिल कार्यात्मक समूह प्रोटॉनेट है और एक एनिऑन-एक्सचेंजर के रूप में कार्य करेगा। 2-(2-pyridyl)-एथिल सिलिका जेल एक कमजोर एनिऑन एक्सचेंजर है जो एक बुनियादी पीएच पर CoA-bimane के लिए आदर्श है। 2-(2-pyridyl)-एथिल सिलिका जेल में 6 का pKa होता है और एल्यूशन पीएच - 7 किया जाता है।
  2. स्तंभ के लिए नमूना supernatant जोड़ें (चरण 4.11) और eluate इकट्ठा.
  3. किसी भी असंरक्षित प्रजाति को हटाने के लिए 1 एमएल वॉश बफर के साथ दो बार कॉलम धोएं।
  4. 1 एमएल पानी से एक बार कॉलम को धो लें।
  5. CoA-bimane इकट्ठा करने के लिए एक अलग ग्लास टेस्ट ट्यूब (12 मिमी x 75 मिमी) में 1 एमएल एल एल्यूशन बफर के साथ दो बार कॉलम धोएं।
  6. सूखापन के लिए नाइट्रोजन गैस के तहत ट्यूब में सूखी CoA-bimane नमूना. सूखे नमूना आगे का उपयोग जब तक कमरे के तापमान पर स्थिर है. सील और पूरी तरह से ट्यूब और दुकान को कवर.
  7. जब HPLC विश्लेषण के लिए तैयार है, पानी के 300 डिग्री एल में नमूना resuspend और 10 s के लिए उच्च पर भंवर द्वारा तेजी से मिश्रण.
  8. स्थानांतरण एक centrifuge ट्यूब फिल्टर करने के लिए नमूना (0.22 मीटर सेलूलोज़ एसीटेट, 2 एमएल आकार) और 10 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर centrifuge किसी भी precipitant को दूर करने के लिए.
  9. HPLC इंजेक्शन के लिए उपयुक्त एक गिलास शीशी के लिए फ़िल्टर ्ड नमूना स्थानांतरण।

6. HPLC शुद्धि और CoA-bimane की माप

  1. बफ़र तैयार करें. बफर ए: 50 एमएम KH2पीओ4, पीएच 4.6; बफर बी: एसीटोनिट्रिल (ऑप्टिमा ग्रेड)।
  2. HPLC प्रणाली को पावर.
    नोट: हमारी प्रयोगशाला में HPLC प्रणाली एक पानी e2695 पृथक्करण एक 2489 पराबैंगनी-दृश्य (यूवी-Vis) अवशोषण डिटेक्टर और एक 2475 फ्लोरोसेंट डिटेक्टर अधिकार 3 सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित के साथ सुसज्जित मॉड्यूल है. सिस्टम भी एक स्वचालित नमूना इंजेक्टर है.
  3. मिथुन C18 पर पृथक्करण के लिए प्रत्येक नमूने (उदा., 20 $L), 3 [m 100 ], 4.6 मिमी x 150 मिमी कॉलम में 0ण्5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ सारणी 1 में प्रोग्राम का उपयोग करते हुए। स्तंभ का तापमान 25 डिग्री सेल्सियस है। $ 393 एनएम पर यूवी/दृश्य डिटेक्टर अवशोषण को मापने, और $ex पर फ्लोरोसेंट का पता लगाने ] 393 एनएम, $em ] 470 एनएम। अवधारण समय नमूनों के प्रत्येक सेट से पहले CoA-bimane मानक वक्र चलाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए CoA-bimane चोटी के तहत क्षेत्र रिकॉर्ड और HPLC स्तंभ पर इंजेक्शन CoA-bimane के pmol की गणना करने के लिए मानक वक्र के साथ तुलना करें। CoA-bimane अवशोषण मानक वक्र ऊतक नमूनों के लिए प्रयोग किया जाता है, और CoA-bimane फ्लोरोसेंट मानक वक्र ऊतक संस्कृति के नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. के रूप में CoA-bimane मूल्यों प्रत्येक नमूने के लिए कुल CoA प्रतिनिधित्व करते हैं, संस्कृति के नमूने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को सामान्यीकृत, या ऊतक के नमूने के लिए एमजी गीला वजन (चित्र 6). वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक नमूने के लिए डीएनए या प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकरण के बाद कुल CoA मूल्यों की गणना. डीएनए या प्रोटीन सामग्री अलग से निर्धारित किया जा सकता है नमूना aliquots कि नमूना तैयारी के दौरान KOH इसके अलावा से पहले हटा रहे हैं का उपयोग कर.

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Representative Results

सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों में कुल सीओए का पता लगाने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और विश्वसनीय विधि एक फ्लोरोसेंट एजेंट को सीओए के thiol derivatizing द्वारा विकसित किया गया है mBBr का उपयोग कर, और फिर रिवर्स चरण HPLC का उपयोग कर derivatized CoA-bimane शुद्ध. एक मानक वक्र पहले उत्पन्न होता है, जहां ज्ञात और CoA-bimane मानक की बढ़ती मात्रा व्यक्तिगत रूप से इंजेक्शन हैं और CoA-bimane क्रोमैटोग्राम में चोटियों के तहत क्षेत्रों इनपुट CoA-bimane के एक समारोह के रूप में प्लॉट कर रहे हैं (चित्र 4). CoA-bimane पर एक अवशोषण अधिकतम है $ 393 nM और एक प्रतिनिधि HPLC प्रोफ़ाइल एक C18 HPLC स्तंभ पर CoA-bimane मानक के प्रतिधारण समय से पता चलता है (चित्र 3) तालिका 1में elution कार्यक्रम का उपयोग कर. अवशोषण या फ्लोरोसेंट इकाइयों को मापने के द्वारा पता लगाए गए CoA-bimane के प्रतिनिधि मानक वक्र क्रमशः चित्र 4ए और चित्र 4ठमें दिखाए जाते हैं। चित्र 4 क में मानक वक्र को 393 दउ पर CoA-bimane के अवशोषण के परिमाण को परावर्तित करता है और चित्र 4ठ CoA-bimane के फ्लोरोसेंट का प्रतिनिधित्व करता है ([ex ] 393 एनएम और $em ] 470 nm) प्लॉट किया गया बनाम इनपुट राशि CoA-bimane. CoA-bimane मानक 0.01 से 12,000 pmol का पता लगाया जा सकता है और एक 106गुना रेंज को शामिल किया गया जब दोनों अवशोषण और फ्लोरोसेंट का उपयोग कर का पता लगाने संयुक्त है. जबकि मानक का पता लगाने की कम सीमा 0.01 pmol है, प्रयोगात्मक नमूनों में CoA-bimane परिमाणकीकरण की कम सीमा 0.2 pmol है जो के बारे में है 5 गुना आधार रेखा या पृष्ठभूमि में फ्लोरोसेंट से अधिक वर्णग्राम में. कोए-बिमेन के अवशोषण या फ्लोरोसेंट द्वारा पता लगाने का विकल्प बड़े या छोटे नमूना आकार के साथ काम करने की व्यावहारिकता के साथ, सामान्य रूप से ऊतकों या कोशिकाओं में मौजूद CoA की मात्रा पर निर्भर करता है। अवशोषण आम तौर पर ऊतक के नमूनों के लिए उपयोगी है क्योंकि 40-50 से निपटने सामग्री पैदावार बेहतर वसूली की तुलना में 5 मिलीग्राम ऊतक के नमूने, जबकि फ्लोरोसेंट सुसंस्कृत सेल नमूने जो आकार में छोटे हैं और वहाँ अधिक से अधिक है के लिए उपयोगी है फ्लोरोसेंट मानक वक्र के निचले अंत में मूल्यों के अंतर्वेशन में विश्वास. केवल अवशोषण का पता लगाने के साथ प्रयोगशालाओं बढ़ाने या प्रारंभिक नमूना आकार को कम करने पर विचार कर सकते हैं, HPLC इंजेक्शन मात्रा में वृद्धि या नमूना resuspension के लिए मात्रा को कम (ऊपर धारा 5.9) सुसंस्कृत कोशिकाओं में माप के लिए.

ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं से hydrolyzing acyl-CoAs के लिए शर्तों KOH एकाग्रता का समायोजन करके अनुकूलित किया गया था, और समय और बाद में ऊष्मायन के तापमान (डेटा नहीं दिखाया). इष्टतम स्थिति 2 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 0.25 एम होना पाया गया। मुक्त सीओए के थायोल समूह प्लस थायोएस्टर्स से मुक्त किसी भी सीओए को पीएच के समायोजन के बाद एमबीबीआर के साथ प्रतिक्रिया द्वारा derivatized किया गया था। इसके बाद HPLC जुदाई और माउस जिगर या मानव सुसंस्कृत C3A कोशिकाओं के लिए विशिष्ट पता लगाने प्रोफाइल चित्रा 5 में लाल चोटियों के रूप में संकेत दिया जाता है, के बीच एक प्रतिधारण समय के साथ 11 और 12 मिनट के बीच एक अवधारण कार्यक्रम तालिका 1में वर्णित का उपयोग कर . जैविक प्रारंभिक सामग्री की विशिष्ट मात्रा में 30-40 murine जिगर की मिलीग्राम (गीला वजन), 6-8 x 10 मानव के लिए6 कोशिकाओं "जिगर की तरह" C3A कोशिकाओं, या मानव HEK293T कोशिकाओं के लिए $ 1.3 x 107 कोशिकाओं. C3A कोशिकाओं को 10 uM जो CoA17 तरक्की (चित्र 6) में एक PanK प्रयोगात्मक दवा P$-2891 के साथ इलाज किया गया . HEK293T कोशिकाओं में CoA माप जब PanK isoforms overexpressed शो CoA माप एक विस्तृत श्रृंखला पर (431-6925 pmoles/ इस पद्धति के लिए आवश्यक नमूना आकार कई प्रयोगात्मक संदर्भों के लिए आवेदन के लिए व्यावहारिक हैं.

CoA-bimane चोटी के तहत क्षेत्र HPLC के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना की गई थी. चोटी सीमा आधारभूत सुधार और शिखर परिभाषा के लिए इनपुट मूल्यों के उचित समायोजन लंबित HPLC सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन हमारी प्रयोगशाला मैन्युअल रूप से प्रत्येक chromatogram में CoA-bimane चोटी नामित करने के लिए पसंद करते हैं, विशेष रूप से अपरिचित जैविक नमूनों के लिए.

समय (न्यूनतम) फ्लो रेट (एमएल/ % A % B वक्र
0 0.5 90 10 0
2 0.5 90 10 6
6 0.5 85 15 6
18 0.5 60 40 6
23 0.5 60 40 6
25 0.5 90 10 6
30 0.5 90 10 66

तालिका 1: CoA-bimane पृथक्करण के लिए HPLC कार्यक्रम. बफर ए: 50 एमएम KH2पीओ4, पीएच 4.6; बफर बी: एसीटोनिट्रिल। बफर ए और बफर बी का मिश्रण वक्र 6 का अनुसरण करता है जो एक मध्यवर्ती वक्र 8 के साथ एक रेखीय प्रवणता है जो एक मध्यम अवतल प्रवणता है।

Figure 1
चित्र 1. कोएंजाइम एक जैव संश्लेषण मार्ग. पैन्टोथेनेट किनेस (PanK) कोए बायोसिंथेसिस के पहले चरण में सर्वोथेनेट (विटामिन बी5) से 4 डिग्री फॉस्फोपेन्टोथेनेट के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करता है। फॉस्फोप्टोथेनेट का निर्माण 4"-फॉस्फोप्टोथेनोइलोसिस्टीन साइंथेल सिनथलीन सिंथेज द्वारा उत्प्रेरक के साथ संघनन द्वारा किया जाता है और फिर 4"-फॉस्फोपोएन्टेथीन द्वारा 4"-फॉस्फोपोन्थेइन के रूप में डेकार्बोक्सीन का निर्माण होता है। 4]-Phosphopantetheine को एंजाइम ए (सीओए) को कोएंजाइम ए (सीओए) में कोए सिंथास द्वारा उत्प्रेरित दो-चरणीय प्रक्रिया में परिवर्तित कर दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र ााााे 2. कोए के साथ बीबीबीआर रिएक्शन। Monobromobimane (mBBr) CoA-SH (मुक्त CoA) के साथ मिलाया जाता है और अंधेरे में 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated. गैर-फ्लोरोसेंट एमबीबीआर जब CoA-bimane बनाने के लिए सीओए के लिए बाध्य फ्लोरोसेंट हो जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: अवशोषण HPLC CoA-bimane मानक के ट्रेस. CoA-bimane तालिका 1में HPLC कार्यक्रम का उपयोग कर एक मिथुन C18 स्तंभ पर अलग किया गया था। विशिष्ट प्रतिधारण समय (मिनट) aborbance इकाइयों (AU) द्वारा इंगित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: CoA-bimane मानक घटता अवशोषण या फ्लोरोसेंट द्वारा पता लगाया. (क)कोए-बिमन के लिए अवशोषण संसूपता इकाइयों का उपयोग करके मापा गया मानक वक्र को 393 दउ मापी गई थी। ऊतक नमूने आमतौर पर अवशोषण मानक वक्र का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं. (ख)जो मानक वक्र कोए-बिमेन के लिए प्रतिस्रोध का पता लगाने वाली इकाइयों का उपयोग करके मापा जाता है, वह ख्33 दउ, जेएम - 470 दउ। संस्कृति कोशिकाओं आमतौर पर fluorscence मानक वक्र का उपयोग CoA सामग्री के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. डुप्लिकेट मानकों (और नमूने) नियमित रूप से मूल्यांकन कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: HPLC ठेठ जिगर या सुसंस्कृत सेल नमूने के निशान. (ए)CoA-bimane पहचान और माउस जिगर निकालने में सामग्री की परिमाणीकरण. अवशोषण इकाइयों (AU) संकेत दिया जाता है. (बी) CoA-bimane पहचान और HepG2/C3A सुसंस्कृत कोशिकाओं में सामग्री का परिमाणीकरण. फ्लुओरेसेंट उत्सर्जन इकाइयां (ईयू) इंगित की जाती हैं। CoA-bimane चोटियों लाल रंग में दिखाए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. माउस जिगर में सीओए स्तर, सुसंस्कृत C3A और HEK293T कोशिकाओं. (A) मूषक यकृत में सर्वभूतेश किनेस नॉकआउट(Pank1-/-) और मिलान जंगली प्रकार (WT) पशुओं से CoA माप. Pank1/- जानवरों Pank1 अभिव्यक्ति9के अभाव के कारण WT जानवरों की तुलना में जिगर में कम CoA है. डेटा प्रति जीनोटाइप 5 पुरुष चूहों का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे और मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं - SEM. (बी) HepG2/C3A कोशिकाओं में CoA स्तर या तो dimethylsulfoxide (वाहन नियंत्रण) या P$-2891, एक प्रयोगात्मक दवा है कि 10 uM पर PanK गतिविधि modulates 17. सेलुलर सीओए स्तर को पीजेड-2891 के साथ 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद ऊंचा किया गया है। (C) HEK293T कोशिकाओं में CoA स्तर या तो खाली वेक्टर pcDNA3.1, या CDNAs एन्कोडिंग मानव PANK isoforms के साथ transfected: PANK1], PANK2m जो मानव PANK2, या PANK3 के परिपक्व, संसाधित समरूप है. CoA स्तर सभी सक्रिय PANK isoforms के overexpression द्वारा ऊंचा कर रहे हैं. (ठ) और (ब्) के आंकड़े स्वतंत्र त्रिफला नमूनों से हैं और इन्हें माध्य सेम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण unpaired टी परीक्षण का उपयोग किया गया था और महत्व के मूल्यों लाल रंग में दिखाए जाते हैं. पैनल (बी) और (सी) के आंकड़े शर्मा एट अलसे अनुकूलित होते हैं . 12कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ हम रैखिक का पता लगाने की एक विस्तृत श्रृंखला है कि या तो एक अवशोषण या फ्लोरोसेंट उत्पादन डिटेक्टर के साथ एक HPLC है में पहुँचा जा सकता है की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ कोशिकाओं और पशु ऊतकों में कुल CoA मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय, कदम दर कदम प्रक्रिया का प्रदर्शन. वैकल्पिक रूप से, मास स्पेक्ट्रोमेट्री CoA और CoA thioesters के मूल्यांकन के लिए एक आम तकनीक है, लेकिन इंस्ट्रूमेंटेशन की लागत और विशेष ज्ञान पद्धति और डेटा की व्याख्या के विकास के लिए आवश्यक की वजह से व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है. Isotopically लेबल CoA कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री में मुक्त CoA के परिमाणीकरण के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, और मुक्त CoA ऐसे acetyl-CoA के रूप में CoA thioesters के रूप में एक ही संवेदनशीलता के साथ साधन द्वारा पता नहीं है. इस प्रकार, मुक्त CoA स्तर अक्सर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सकल कम करके आंका जाता है जब तक कि उत्पादन डेटा एक CoA मानक अंशांकन वक्र के साथ तुलना कर रहे हैं.

हम पहले हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया एक अलग विधि के साथ यहाँ वर्णित विधि की तुलना में और माउस जिगर से अधिक से अधिक CoA वसूली पाया, 123.4 - 7.9 pmol/mg गीला वजन, इस वर्तमान विधि के साथ की तुलना में $80 pmol/mg गीला वजन एक एंजाइमी परख का उपयोग कर कि एक रेडियोधर्मी टैग28के साथ derivatized मुक्त CoA | यहाँ वर्णित कुल CoA को मापने के लिए विधि काफी कम बोझिल है, तेजी से और पहले से हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल विधि की तुलना में नियंत्रित करने के लिए आसान28. पूर्व में, सीओए सेल lysate के हेक्सान निष्कर्षण के बाद निर्धारित किया गया था और रेडियोधर्मी के लिए एंजाइमी रूपांतरण के अधीन [14C]lauryl-CoA Escherichia कोलाई acyl-CoA सिंथेटाज़ (FadD) द्वारा मध्यस्थता. एसिड घुलनशील लघु श्रृंखला acyl-CoAs और सेल lysate में एसिड अघुलनशील लंबी श्रृंखला acyl-CoAs मुक्त CoA उपज के लिए KOH के साथ hydrolyzed थे और फिर मुक्त CoA29करने के लिए एंजाइमी रूपांतरण से पहले हेक्सेन निष्कर्षण के अधीन . हालांकि इस पिछले प्रक्रिया अच्छा विशिष्टता और संवेदनशीलता था, व्यवहार में कार्य को पूरा करने के लिए 2 कार्य दिवसों की आवश्यकता है और पुनः संयोजक ई. कोलाई acyl-CoA सिंथेटाज़ के लिए तैयार किया जाना था, शुद्ध और एंजाइमी विशिष्ट गतिविधि के लिए मापा CoA विश्लेषण से पहले. यह भी पता लगाने और रेडियोधर्मी आइसोटोप जो अधिक हाल के इतिहास में जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में बहुत कम आम है परिमाणीकरण करने में सक्षम इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित के रूप में वर्तमान विधि pantothenate kinase (PanK) में हमारे अनुसंधान हित के लिए सबसे उपयुक्त है. PanK CoA जैव संश्लेषण मार्ग के माध्यम से प्रवाह को नियंत्रित करता है और इसलिए कुल CoA स्तर जैविक नमूनों में PanK गतिविधि के लिए readout है.

CoA की एक सही राशि बनाए रखने के लिए एक जैविक नमूने में चयापचय प्रतिक्रियाओं की Quenching देखभाल और तेजी की आवश्यकता है और इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है. एक एसिड या कार्बनिक विलायक के साथ तेजी से deप्रोटीनization, या नमूनों की फ्लैश फ्रीजिंग दो तरीके है कि पिछले30,31में इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान विधि में, बर्फ ठंडा ultrapure पानी जल्दी से संस्कृतियों से बर्फ ठंडा पीबीएस धोया कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, और अनुयायी कोशिकाओं प्लस पानी तो KOH को स्थानांतरित करने से पहले संस्कृति पकवान बंद स्क्रैप कर रहे हैं. नमूना तैयार करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए [KOH + पानी] में सुसंस्कृत सेल निलंबन की बर्फ़ीली करना एक स्वीकार्य रोक बिंदु है। हालांकि, जमे हुए सेल नमूनों से CoA मूल्यों सीओए संकेत का पर्याप्त नुकसान है, तो यह निर्धारित करने के लिए ताजा तैयार नमूनों से उन लोगों की तुलना की जानी चाहिए. $ 10% CoA की हानि सेल नमूना ठंड के बाद हमारे हाथों में हुई है और नियंत्रण की जरूरत है जो KOH में नमूना की विस्तारित समय से संबंधित हो सकता है. पशु ऊतक टुकड़े जल्दी से एक छोटे से पन्नी 'राफ्ट' LN2 पर चल तुरंत एक ethanized जानवर से ऊतक के उच्छेदन के बाद पर जमे हुए हैं. नमूना आकार से 5 मिलीग्राम करने के लिए 60 जमे हुए ऊतक की मिलीग्राम रैखिक CoA पैदावार के साथ इस विधि के लिए उपयुक्त हैं. एक बार जमे हुए, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ऊतक के नमूने कम से कम 3 महीने के लिए स्थिर हैं, जो कि आंतरायिक थाव नहीं होते हैं।

HPLC विश्लेषण से पहले नमूना तैयारी उच्च थ्रूपुट नहीं है और एक पूर्ण काम आधा दिन की आवश्यकता है. यह अनुशंसा की जाती है कि ऑपरेटर एक समय में अधिकतम 30 नमूनों को संभालता है, 15 नमूनों के एक सेट के एक सेट के homogenization के साथ शुरू करने के बाद पहले सेट के लिए KOH के साथ 2 एच ऊष्मायन के दौरान 15 नमूनों के दूसरे सेट के homogenization के बाद. KOH ऊष्मायन अवधि पहले 30 मिनट से 4 एच तक के ऊष्मायन समय के साथ खरीदा CoA थायोस्टर का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था, और फिर 2 एच ऊष्मायन ऊतक नमूनों की एक किस्म में पूरा CoA थायोस्टर हाइड्रोलिसिस के लिए समय को समायोजित करने के लिए चुना गया था, लेकर कंकाल की मांसपेशी से जिगर8के लिए | एमबीबीआर के साथ सीओए व्युत्पत्ति के लिए इनक्यूबेशन लगभग पीएच 8 पर 2 एच पर सेट किया गया है और एमबीबीआर की 20 गुना अधिक मात्रा को पूरी तरह से जैविक नमूनों में सीओए को परिवर्तित करने के लिए जोड़ा जाता है। नमूने में कोए के अलावा प्रोटीन और मेटाबोलियों के सुल्हाइड्रिल moieties CoA के अलावा कार्निटाइन या glutathione, और 20 गुना अतिरिक्त कुल सीओए जिगर की अपेक्षित राशि के आधार पर गणना की गई थी जो उच्चतम स्तर है ऊतकों के बीच. पीएच एमबीबीआर के साथ ऊष्मायन से पहले कम हो जाता है क्योंकि सामान्य रूप से ब्रोमीमैन अधिक तटस्थ जलीय समाधानों में ऐमीन और कार्बोक्सिलेट्स जैसे अन्य न्यूक्लिओफिल्स के प्रति कम प्रतिक्रियाशील होते हैं। व्युत्पत् ति का समय प्रोटीन थायोल्स26के साथ प्रतिक्रिया से बचने या कम करने के लिए 2 ज से अधिक नहीं होना चाहिए . एक nonnucleophilic बफ़र्स का उपयोग करने के लिए कम करने और पीएच बनाए रखने की जरूरत है क्योंकि उच्च सांद्रता पर बफर anions की उपस्थिति CoA के एमबीबी derivatization के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.

एसपीई कॉलम पर नमूना सफाई मैन्युअल रूप से हमारी प्रयोगशाला में किया जाता है और इस चरण के लिए आवश्यक समय को छोटा करने के लिए वैक्यूम कई गुना की सहायता से किया जा सकता है। एसपीई कॉलम से व्युत्पत्ति CoA की अच्छी वसूली नियमित रूप से प्राप्य है और यह अलग से रेडियोधर्मी का उपयोग कर निर्धारित किया गया था [13C]CoA thioesters जो भी एसपीई कॉलम पर बनाए रखा जाता है. की वसूली [13C]acetyl-CoA 97.6% था और की वसूली [13C] palmitoyl-CoA 96.1% था. एसपीई-स्तंभ eluate के वाष्पीकरण आमतौर पर सुविधा के एक मामले के रूप में हमारी प्रयोगशाला में रात भर नाइट्रोजन गैस के तहत किया जाता है, लेकिन सुखाने नाइट्रोजन गैस के तहत 4 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है या एक speedvac concentrator का उपयोग कर. विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम पीएच समायोजन से संबंधित हैं और रास्ते में पीएच कागज स्ट्रिप्स के साथ जाँच की जा सकती है. KOH हाइड्रोलिसिस के लिए, पीएच को सीओए से थायोस्टर की पूरी रिहाई को प्राप्त करने के लिए $ 12 की आवश्यकता होती है। pH 7.8 - 8.5 करने के लिए mBBr-derivatization की प्रतिक्रिया का समर्थन करने की जरूरत है, और derivatization पूरा होने के बाद, पीएच बहुत अम्लीय बनने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, के बारे में पीएच 1-2, आदेश में CoA-bimane के लिए एसपीई कॉलम के लिए बाध्य करने के लिए. SPE स्तंभ अतिरिक्त unreacted mBBr और कुछ असंबंधित जैविक पदार्थों को खत्म करने के लिए नमूना साफ.

HPLC कार्यक्रम इतना है कि धोने और C18 स्तंभ के फिर से समानता पृष्ठभूमि और नमूनों के बीच ले जाने के संकेतों को खत्म करने के लिए पर्याप्त है बनाया गया है. सेट के बीच संभावित कैरीओवर की निगरानी करने और कॉलम की सफाई सुनिश्चित करने के लिए एहतियात के रूप में निर्धारित प्रयोगात्मक नमूने में प्रत्येक 5 नमूनों के बाद पानी के खाली नमूने डाले जाते हैं। अनुचित नमूना इंजेक्शन से कोई सामयिक त्रुटि HPLC के लिए एक स्वचालित नमूना इंजेक्टर का उपयोग करते समय हो सकता है, और यह आसानी से इंजेक्शन या गैर-CoA संबंधित चोटियों के निरीक्षण के बाद नमूना शीशियों में शेष मात्रा की तुलना द्वारा जाँच की जा सकती है आउटपुट क्रोमैटोग्राम. CoA मूल्यों फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अंशांकन वक्र के रैखिक रेंज से अधिक है, तो मूल्यों सबसे अधिक संभावना पराबैंगनी अवशोषण का पता लगाने के लिए रेंज में हो जाएगा। यदि नहीं, पानी की एक ज्ञात मात्रा के साथ नमूने के कमजोर पड़ने रैखिक रेंज में होने के लिए संकेत को कम कर सकते हैं और गणना खाते में किसी भी कमजोर पड़ने कारक लेना चाहिए.

सीओए का स्तर विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ inbred माउस उपभेदों के बीच अलग अलग होंगे, हालांकि जब जैविक नमूने एक ही परिस्थितियों में एक ही तनाव से प्राप्त कर रहे हैं मूल्यों reproduible हैं. हमनेविभिन्नअध्ययनों 10,12, 16,17में विभिन्न प्रकार के माउस लाइनों में सीओए का अनुमान लगाया है . CoA भी कई सुसंस्कृत सेल लाइनों में मापा गया था16,17 या तो प्राथमिक या अमर कोशिकाओं का उपयोग कर.

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Disclosures

MWF, सीएस और एसजे कागज लिखा था, MWF और सीएस डेटा और आंकड़े प्रदान की, COR प्रयोगों डिजाइन और गंभीर रूप से पांडुलिपि की समीक्षा की. एसजे और सीओआर एक लंबित पेटेंट आवेदन पर आविष्कारक हैं (PCT/US17/39037) "पैंटोथेनेट kinases के छोटे अणु न्यूनाधिक" सेंट जूड चिल्ड्रन रिसर्च अस्पताल द्वारा आयोजित है कि इस लेख में संदर्भित पीजेड-2891 यौगिक को शामिल किया गया.

Acknowledgments

लेखकों CoA चिकित्सा, इंक, BridgeBio LLC, स्वास्थ्य अनुदान GM34496 के राष्ट्रीय संस्थानों, और अमेरिकी लेबनान सीरियाई एसोसिएटेड दान की एक सहायक द्वारा प्रदान की प्रायोजित अनुसंधान के लिए धन स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column Millipore-Sigma 54127-U
coenzyme A Avanti Polar Lipids 870700
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column Phenomenex 00F-4439-E0
monobromobimane ThermoFisher Scientific M-1378
Omni-Tip probe tissue disrupter Omni International 32750H
Parafilm Fisher S37440
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer ThermoFisher Scientific NC0530997
Spin-X centrifuge tube filter CoStar 8161
Trizma-HCl Fisher T395-1
Waters 2475 fluorescence detector Waters 2475
Waters 2489 UV-Vis detector Waters 2489
Waters e2695 separations module Waters e2695

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जैव रसायन अंक 151 कोएंजाइम ए सुसंस्कृत कोशिकाओं पशु ऊतकों monobromobimane उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी ठोस चरण निष्कर्षण
कोशिकाओं और ऊतकों में कोएंजाइम ए का परिमाण
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Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, … More

Frank, M. W., Subramanian, C., Rock, C. O., Jackowski, S. Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (151), e60182, doi:10.3791/60182 (2019).

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