Summary
マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。
Abstract
従来の細胞培養は、がんの臨床結果を予測する能力が限られているにもかかわらず、最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。マイクロ流体がんオンチップモデルは、過度に単純化された従来の2D培養と、信頼性が高く再現可能な定量的結果を生み出す能力が限られている、より複雑な動物モデルとの間のギャップを埋めるために提案されている。ここでは、複雑な腫瘍微小環境の主要成分を包括的に再現するマイクロ流体がんオンチップモデルを紹介しますが、がんダイナミクスの堅牢な定量的記述を提供するのに十分簡単です。このマイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」は、がん細胞の大量を相互接続された腫瘍微小環境に分解し、異種化学療法ストレスランドスケープを生成します。薬物勾配に応答する癌の進行と進化的ダイナミクスは、リアルタイムで数週間監視することができ、多数の下流実験は、実験の過程で撮影されたタイムラプス画像を補完して行うことができます。
Introduction
がんは、変異細胞集団の継続的な調節不全だけでなく、癌細胞と宿主の微小環境との間の重要な相互作用にも依存する複雑な生態系としてますます認識されています。この意味で、癌は、異種腫瘍微小環境および様々な宿主細胞とのクロストークを含む要因の組み合わせによって現れる適応的な風景に進化し、そのすべてがさらなる遺伝的またはエピジェネティックな変化1,2,3.固形腫瘍の文脈では、化学療法および他の資源勾配の不均一な分布は、その分子不均一性に寄与し、薬剤耐性の開発に役割を果たし、特定の腫瘍に対する血管新生の増加を果たすかもしれない亜集団、さらには転移4、5、6.従来のインビトロ2D細胞培養研究は、大規模で便利な実験能力を有する一方で、平均分野、均一、固定条件を提供し、多くの場合、真に必要な正確な空間的および時間的な環境制御を欠いている。生体内腫瘍ダイナミクスをエミュレートします。したがって、がんの進行をより良く予測し、動的ストレス内の薬物に対する応答を改善するために、薬剤開発パイプラインにおける動物モデルの前に腫瘍微小環境を再現するために、より代表的なex vivoモデルが必要とされています。風景。マイクロ流体学は、制御可能な定量的研究7、8、9をサポートすることができないかもしれない生体内動物研究における2D細胞培養研究とより複雑な間のギャップを埋めるために提案されている。
がん細胞のダイナミクスを特徴付ける理想的なインビトロシステムは、腫瘍で起こり得る適応細胞応答を模倣する不均一な微小環境を生成する能力を有し、また、単一セル解像度。本稿では、細胞分解能におけるがん細胞ダイナミクスのインビトロ研究を可能にするPDMSベースのデバイスであるマイクロ流体細胞培養プラットフォームについて、リアルタイムのデータ取得を用いて細胞分解能を用いて説明する。文化景観全体のストレスの勾配を安定的に維持しながら、数週間のコース。このプラットフォームの設計は、メタ集団における生物の進化的ダイナミクスを加速することができる我々の前の研究に基づいています10,11.具体的には、あるレベルで相互作用する空間的に分離された集団のグループでは、異種ストレス景観にさらされると、最も適合する種は、大規模な均一集団のそれと比較して、より速く地元の集団で支配することができます。有利な種は、資源と空間を求めて近隣の微生物生息地に移動し、最終的には全人口を支配する。図1に示すように、マイクロ流体EAチップのパターンは、(i)新鮮な媒体循環を提供し、化学拡散のための固定境界条件を構築する一対の蛇行チャネル、および(ii)六角形細胞培養領域で構成される。これは、ハニカム構造に似て、中央に109の相互接続された六角形と24の半六角形の部屋で構成されています。チップの深さは100μmです。培地チャネルと細胞培養領域は、小さなスリット(幅約15μm)と接続されており、直接の培地の流れを防ぎ、細胞培養領域全体で生じるせん断応力を防ぎますが、それでも化学物質が小さなスリットを通して拡散し、栄養素を交換することができます。代謝廃棄物等化学勾配の生成は図1Bで示され、一方のメディアチャネルには0.1 mMのフルオレセインが含まれ、もう一方のチャネルにはフルオレセインが含まれな場合があります。細胞はガス透過性膜上で培養され、チップに対する膜上の正の背圧を介して微細構造によって封入される。デバイスホルダーの構成要素を図2に示し、実験セットアップを図3に示し、培養は37°Cの反転顕微鏡で維持され、85%以上の相対湿度で、条件付けされています。ノルモキシアガス組成物。
このシステムは、ブライトフィールドおよび蛍光チャネルを介して局所的な細胞相互作用の詳細な観察を提供し、免疫蛍光、ウェスタンブロット、質量分析などの空間的に分解された下流アッセイを可能にします。我々は、上皮および間葉系PC3前立腺癌細胞12の長期共培養および薬剤耐性ポリプロイド巨人の出現に関するこのマイクロ流体癌オンチップモデルの原理の証明として以前に実証した。上皮PC3細胞株13を用いて癌細胞。このプラットフォームの応用は、上皮PC3とドセタキセルのストレス勾配下での間葉前立腺癌細胞の時空間的ダイナミクスを理解するために提示するが、マイクロ流体系は細胞株の任意の組み合わせに容易に適用することができる。およびリソース(すなわち、薬物、栄養素、酸素)勾配。
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Protocol
1. マイクロ流体装置の製造
- レイアウト設計ソフトウェアを使用して、目的のマイクロ流体パターンを生成します (補足資料を参照)。
- フォトマスクを製作します。詳細については、材料の表を参照してください。
- レーザーライターを利用して、100nmのCrと500nmのフォトレジストAZ1518でコーティングされたソーダライムガラスプレートにパターンを書きます。
- 60 s の開発者 AZ300MIF とフォトレジストを開発します。
- Cr-7クロムエッチングを使用してフォトレジストから保護することなくクロムを離します。
- 70°Cでフォトレジストストリッパーを使用して残留フォトレジストを45分間取り除きます。
- フォトレジストをパターンにします。詳細については、材料の表を参照してください。
- シリコンウェーハ上のスピンコートHMDSは40sの4000 rpmで。
- シリコンウエハ上のスピンコートフォトレジストAZ4330は40sの4000 rpmで。
- シリコンウェーハを95°Cで60sで柔らかく焼きます。
- マスクアライナーを使用して、シリコンウェーハにUVを露出します。
- 4分間、開発者AZ300MIFとフォトレジストを開発します。
- DRIE エッチングを実行します。詳細については、材料の表を参照してください。
- 100 μmの深さのシリコン深反応性イオンエッチング(DRIE)システムを使用してフォトレジストでパターン化されたウエハをドライエッチングします。
- プラズマエッチャーでアセトンとプラズマエッチングでフォトレジストを取り除きます。
- ウエハ酸化とサイレン化。詳細については、材料の表を参照してください。
- 1100°Cの炉内のエッチングシリコンウエハに熱酸化を1時間行います。
- シリコンウェーハが冷却するのを待ってから、ウェーハの近くの小さな容器に滴下されたトリクロロ-1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルシラン(PFOTS)の数滴でデシケータにウエハを入れます。
- 60分間室温で0.5気圧にデシケータの圧力をポンプ。シリコンウエハ型は、適切なサイレン化後に疎水性になる必要があり、これはウエハに水のいくつかの液滴を加えることによってテストすることができる。
- 柔らかいリソグラフィー。詳細については、材料の表を参照してください。
- プレポリマーとクロスリンカー(ポリメチルシロキサン(PDMS)キットから)を10:1の重量比で混合します。
- 混合PDMSを注ぎ、高さ10mmのフィルムをシラン化されたシリコンウエハ型に作成します。
- 得られたPDMS-シリコンウエハシステムをデシケータで30分~1時間退出させる。
- PDMS-シリコンウエハを一晩70°Cインキュベーターでインキュベートし、PDMSを硬化させる。
- PDMSが硬化したら、慎重にシリコンウエハからPDMSフィルムを剥がします。
- 生検針を使用して、PDMS上のパターンの位置に基づいて入口ポートでスルーホールをパンチし、直径27mmのチップを切断するために円形のパンチを使用します。
- PDMS 層の接着。
- 熱は、デバイスの貯水池層とキャッピング層になる27ミリメートルPDMSシリンダー(パターニングなし)の2つのスタックを治します。
- 貯水池層の入口の周りに2つの7mmの円を切り取り、生検針を利用してキャッピング層の入口ポートでスルーホールをパンチします。
- 酸素プラズマ処理とPDMS(パターンスタック、貯水池層、キャッピング層)の3つのスタックを結合します。
- 生検針を使用して、コンセントとデバイスの中央ポートにスルーホールをパンチします。
2. 媒体および細胞株の準備
- PC3-EMTおよびPC3-EPIを含むPC3細胞株を培養するための培養培養培養剤を調製する:10%の胎児ウシ血清(FBS)および1x抗生物質抗菌薬と1倍の抗生物質抗菌薬とRPMI 1640培地を混合する。前述の14.
注:PC3細胞株は、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターで上記の培地で維持される。細胞とサブ培養を3日ごとに分割し、100%合流に達する。 - 細胞質標識蛍光マーカーを用いたトランスフェクト細胞株は、前述の12のように、PC3-EMTが細胞質GFPおよびPC3-EPIを発現するように、細胞質性標識蛍光マーカーを用いて細胞質を発現させる。この技術は、任意の蛍光標識細胞だけでなく、標識されていない細胞の明視野イメージングと互換性があることに注意してください。
3. 実験的なセットアップ
- 金属板ホルダーの製作
- 機械加工や3Dプリンティングによる並列実験用のガス透過性培養皿を同時に保持するのに十分なプレートホルダーを製造します。3D CADファイル(「3ウェルプレート。FCStd")は、参照としてGitHubで見つけることができます(https://github.com/kechihl/3-well-plate)。
- ホルダー(図2)のコンポーネントをドライバーで外します。少なくとも1時間の紫外線暴露を介して成分を消毒し、無菌環境に残します。
注:ホルダーは、熱平衡と理想的なガス組成物に実質的な条件を提供するように設計されており、気流を可能にするガスチャネル入り江を備えています。詳細については、前作12. - 細胞培養膜が比較的柔軟である3つまでのガス透過性培養皿を準備する。
- 細胞株の播種
- 実験開始の24時間前に、PC3-EPIおよびPC3-EMT細胞を5分間トリプシン化して収穫し、予備培養培地を追加し、次いで150xgで3分間遠心分離機を行い、上清を廃棄する。
- 各PC3-EPIおよびPC3-EMTの細胞をヘモサイトメーターを用いてカウントし、各ガス透過性培養皿に対して各細胞タイプの合計2.5 x 104を単離する。
- 2つの細胞タイプを培養培養培養液の2mLに混合し再中断し、各ガス透過性培養皿に細胞を播種する。
- 細胞が付着するために、プレートホルダー全体をインキュベーターに一晩残します。
- 少なくとも1時間の紫外線暴露を介してPDMSデバイスを消毒し、無菌環境に残します。
- 熱制御ユニットとガス供給システムの設定
- 図3に示すように、CO2とO2制御ユニット、ガスポンプ、ガス混合室、加湿器またはバブラー、およびガスバルブと圧力計の3つの別々のセットで構成されるガス供給システムをセットアップします。詳細については、前作12.
- CO 2 および O2制御ユニットをセットアップし、CO2および N2タンクと O2ソースからのガスの混合速度を調整します。あるいは、ノルモキシア条件下でガスを供給するガス供給システムは機能します。
- 混合室に組み合わされ、バブラーによって加湿されたガスは、相対湿度が最大85%増加し(相対湿度モニターから読み取られるように)、ガスが圧力計を持つ3つの独立したガスバルブにつながることを確認してください。 板のホールダーのガス流量を制御し、監視する。
- プレートホルダー全体を、蓋と底板用に別々の加熱サブユニットを備えたステージインキュベーション熱制御ユニットに入れ、すべてのユニットを37°Cに設定します。詳細については、材料の表を参照してください。
- マイクロ流体装置のインストール。詳細については、材料の表を参照してください。
- 図 2のように、3 ウェル プレート ホルダーの詳細なコンポーネントが順番に並んでいることを確認します。3つの井戸のそれぞれは、各井戸のためのガスチャネルのペアで、同一で独立しています。すべての井戸はガス透過性の培養皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、および35mmガラス窓のペアを所有しています。これらの部品は合ったねじを使用して組み立てることができる。
注:ガラス窓は、ガス透過性培養膜と井戸の間に熱的に隔離された空間があることを保証し、界面の温度差により水の凝縮が起こらないようにします。なお、3つの井戸は独立しており、3つの実験は別々に行うことができる。 - 37°Cで温める前培地と20分間真空室での脱気を行う。
- 親水性を維持するために、30秒の酸素プラズマシステムを使用してPDMSチップを処理します。
- シリンジシステムをセットアップします。成長培地と他の2つの注射器(メディア、薬物を含むメディアなど)で2つの注射器をゆっくりとロードします。個々のシリンジを50cmチューブ(0.020インチx0.060インチOD)に23Gの分配針で1本の中空鋼ピンに接続します。中空のスチールピンをチューブのもう一方の端に挿入します。
- チューブをプライムし、キャッピング層を通して各PDMSチップにスチールピンを挿入します。貯水池の層を埋め、メディアでPDMSパターン層パターンを濡らします。リザーバ層は、気泡がマイクロ流体パターンに入るのを防ぐために、オンチップバブルトラップとして機能します。
- 培養媒体で1mLの注射器をロードします。注射器を5cmチューブ(0.020インチx0.060インチOD)に23Gの分配針で1本の中空鋼ピンに接続します。チューブのもう一方の端に中空のスチールピンを挿入し、チューブをプライムします。
- 中空鋼ピンをチップの中央穴に挿入し、チップシールプロセス中に後で過剰なメディアをチップから抽出できます。
- 各PDMSデバイスは、シリンジポンプにロードされた4つの10 mLシリンジを必要とするように、フォワードデッキのチップごとに2つの10 mLシリンジをロードします。他の2つの注射器を注射器システムの引き出しデッキに置きます。
- ガス透過性培養膜の上にチップを直接置きます(細胞が膜に既に付着しています)。マイクロ流体パターンにマイクロバブルを巻き込むのを避けるために、組み立て前に35mmのガス透過性培養皿に1mLの予備温めおよび脱気媒体を分配し、チップが15度の傾斜角で液体表面に近づくことを確認します。
- PDMSチップホルダーがPDMSデバイスを押し下げ、各チップのガス透過性培養皿ホルダーにガス透過性培養皿と井戸をクランプします。
- PDMSデバイスの上にシーラーのシートをテープで留め、チップが乾燥するのを防ぐためにPDMSチップホルダーでクランプします。
- アレイ周辺のメディア流量を20 μL/hに設定します。
- 反転顕微鏡の電動ステージ上のステージインキュベーターにプレート全体をセットします。ガス供給システムをガスチャネルに接続し、取り付けられたPDMSチップに対してガス透過性培養膜を加圧して、デバイスのシールを確保します。ゲージ圧力を 0.2 psi (1.4 x 104 Pa) に維持します。
- センターホールから1mLシリンジを使用して、チップ内の過剰な培地をゆっくりと抽出します。培法中に顕微鏡下でチップを観察し、チップが密閉されたときに抽出を停止します。細胞の一部が微小構造によって押しつぶされるので、チップシールは明らかであるべきです。
- ステージインキュベーターの温度検出ユニットを3ウェルプレートに接続し、37°Cに設定します。
- 図 2のように、3 ウェル プレート ホルダーの詳細なコンポーネントが順番に並んでいることを確認します。3つの井戸のそれぞれは、各井戸のためのガスチャネルのペアで、同一で独立しています。すべての井戸はガス透過性の培養皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、および35mmガラス窓のペアを所有しています。これらの部品は合ったねじを使用して組み立てることができる。
4. 単一細胞のタイムラプスイメージング
- 反転顕微鏡を利用したイメージングソフトウェアをタイムラプス画像集録に設定する。EA実験には、完全に電動化されたx-yステージ、フォーカスノブ、シャッター、フィルターキューブを備えた反転蛍光顕微鏡が必要です。
- オートフォーカスの1ラウンド後に自動画像ステッチを使用して、各チップの2つのチャンネルで10倍の倍率で画像を取得するようにソフトウェアを設定します。パーフェクトフォーカスのような自動補正システムは、満足のいく画質を保証しないことに注意してください。チップ全体のオートフォーカスまたは手動フォーカスに基づいて、長期的な画像集録用にカスタマイズされたフォーカスサーフェスを生成することをお勧めします。
- 1 時間ごとに画像を撮影し、数週間の時間スケールで実験を実行したままにします。日常的に画質を監視し、必要に応じてフォーカスサーフェイスを更新します。
- 前述の13に記載されているように、その後の免疫蛍光分析のためにPDMSチップおよびガス透過性培養皿を調製する。
5. 画像処理・解析
- 実験後の処理
- フィジー/ImageJを利用した画像処理と測定のためのTIFF形式に画像を変換します。
- TIFF ファイルを圧縮して、さらに画像処理を容易にします。
- フィジー/イメージJ分析
- 細胞を識別するには、バックグラウンド減算と粒子解析を実行して、細胞位置検出および自動細胞カウントのための蛍光明るいスポットを識別します。
- プラグイン(手動トラッキング、ケモタキシス、マイグレーションツール、トラックメイト)を使用して、細胞の運動性と移行を分析します。
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Representative Results
チップ上の最適な細胞増殖の検証
実験プラットフォームの主な目標は、複雑な腫瘍微小環境における主要なコンポーネントと相互作用を包括的な方法で再現することですが、定量的で信頼性が高く再現可能なデータを提供するのに十分なシンプルな方法です。この目標は、物理的および生化学的な環境要因を完全に制御できる場合にのみ達成できます。望ましくない要因を除外するか、制御不能な因子を定量モデルに組み込み、母集団の行動を正しく解釈する方法を考え出す必要があります。
最初のテストは、デバイス上で最適な細胞増殖を確保することです。デバイス上の細胞増殖速度は、従来の細胞培養における増殖プロファイルと同一または同等である必要があります。原理の証明として、ヒト前立腺癌細胞株PC3細胞を、外部ストレスの存在なしにPDMSチップで培養した。これらの細胞は細胞質中に蛍光標識を用いられたため、反転蛍光顕微鏡を用いて細胞の集団を観察し定量することができました。細胞合流は、細胞で覆われた領域として定義され、フィジー15を用いて蛍光画像に対して選択された強度閾値を与えられた異なる時間枠で各マイクロハビタットで測定した。選択した各位置の細胞の成長曲線を図 4にプロットします。選択した位置は、メディア流入の頂点付近の領域から、メディア・アウトレットに近い頂点まで、チップ全体に散在します。
図4Bの増殖曲線は整列性が高く、チップ全体の位置の関数としての細胞増殖プロファイルの同一性を示唆している。曲線の最初の傾きは、増殖速度を明らかにします。装置内の細胞の倍増時間は、図4Bに示すように時間0~24時間で約24時間であり、これは従来の培養器13における倍増時間と同じである。したがって、外部のストレス源がなければ、物理的および生化学的要因が均一に分布し、50時間から100時間の時間から100時間の均質で最適化された細胞増殖につながると結論付けます。
さらに、微小環境における亜集団間の細胞ダイナミクスを定量化する能力を検討した。GFP発現PC3-EMTおよびmCherry発現PC3-EPI細胞株は、図5に示すようにEAで共培養した。細胞合流は、細胞によってカバーされる領域のパーセンテージとして定義され、集団の大きさの指標として測定される。40%の合流から始まり、共培養は3日以内に完全に合流した。興味深いことに、微小環境における各表現型の進行を観察する場合があります。総合流の成長曲線はロジスティック成長モデルの形である一方で、PC3-EMTの人口は拡大を続け、PC3-EPIは無症状態期に抑制された。
混合集団における細胞運動性アッセイの実証
細胞運動性は重要な現象的な行動である。集団の運動分布は、細胞の物理的相互作用、局所微小環境の機械的特性に関する情報を提供することができ、時には細胞のエピジェネティックな変化の指標として分析することができる。当社の改良された細胞培養プラットフォームは、ほぼ連続的なイメージングを可能にすることを考えると、微細な時間分解能を有するという利点は、異種集団における単一細胞追跡の可能性を最大化します。
私たちは、カスタマイズされたマクロとフィジー(http://fiji.sc)のプラグインTrackMate16を使用して、追跡プロセスを実装し、自動化します。TrackMate を使用すると、ユーザーはフィジー スクリプト エディタのスクリプト言語を使用して追跡アルゴリズムを実装およびカスタマイズできます。トラッキング プロセスは、セグメンテーション、フィルタリング、およびパーティクル リンク プロセスという一連の手順で分割されます。
図6Bに示すように、細胞集合的移動と細胞相互作用を研究するデモンストレーションとして「創傷治癒アッセイ」を行った。PC3-EPIおよびPC3-EMT細胞は、デバイスの中心に密に播種され、空の領域に向かって自由に移動することができた。両方の現象型の速度の正規化されたヒストグラムは、図6Cにプロットされる。PC3-EMTの速度はPC3-EPIよりも有意に高く、間葉表現型が比較可能とは対照的に移行する例外的な能力を有する生体創傷治癒の構成要素として機能するという事実と一致している。静止上皮表現型。
また、ストレスのない環境下で細胞運動の進行を観察するために、PC3-EPIとPC3-EMTの長期共培養を統一初期播種密度で行い、時間とともに変化する細胞速度の分布を追跡した。図7A、Bに示すように、培養の6日後、細胞が高い合流点に達するにつれて、両方の表現型に対する細胞速度の分布が左尾に向かって傾いた。
各クラス間隔でPC3-EPIとPC3-EMTの数の比率を比較してもよい。図7Cに示すように、培養日数や細胞密度にかかわらず、PC3-EMTは高速領域を支配し、PC3-EPIは低速ゾーンを占有した。全体的な速度は両方の表現型で有意に減少したが、PC3-EMTは変性のままであり、図7Dに示すように微小環境の混雑の影響を受けなかった。PC3-EPIの平均速度は約40%低下し、PC3-EMTの平均速度は14%減少した。
母集団の混雑など、細胞速度と平均速度の分布に影響を与える要因はいくつかあります。すべての亜集団に対する連続的な細胞追跡とモニタリングは、現象行動の進行を理解するために不可欠です。たとえば、ラベルのない亜母集団の間葉系ステータスのレベルを定量化する場合、関心のあるサブ母集団の物理量(速度など)の分布を関数として取得する方が有益です。時間だけでなく、細胞の共存サブ集団の残りの部分のそれも。
図1:シリンジポンプ駆動のマイクロ流体EAチップ。(A)マイクロ流体装置は、2つの別々の媒体入口、2つの出口、および過剰培地の細胞播種または抽出のための1つの中央ポートを有する。なお、培地入液と細胞培養アレイとの間には、培地がガス透過膜の下を通過した雰囲気と平衡化することを可能にする一対の蛇行チャネルが挙がつくなる。(B)グラデーションの生成。注射器は、蛍水シンの〜0.1 mMと蛍水なしの培地をそれぞれ右側の2つの媒体入口を通してチップに送り込み、左側の2つの媒体出口でチップから抽出する。フルオレセインの濃度は、蛍光シグナルの強度に比例し、中入り入り/出口aの近くにプロファイリングされ、中心b.図はLin et al. 201712の許可を受けて再現される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カスタマイズされた3ウェルサンプルプレートの成分。(a)3ウェルプレートの本体。(b)条件付き雰囲気をポンピングし、ガスチャネルの入り口でセプタを通って排出することを可能にするガスチャネルのペア。(c)井戸板とガス透過性培養皿の間のスペースを密封するように設計されたOリング。(d)直径35mmのガス透過性培養皿。(e)皿ホルダー;(f) PDMS デバイス。(g) PDMS チップホルダー;(h)熱絶縁を維持し、水の結露を防ぐために設計された二重層35ミリメートルのガラス窓;(i) ガラス窓ホルダー;(j) 加熱パッド;(k) 温度センサー;(l)チップが乾燥するのを防ぐ接着剤シーラー。図はLin et al. 201712の許可を受けて再現。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 実験セットアップの概略図。実験のセットアップは、ガス供給システム、ガスチャネル接続、媒体供給接続およびイメージングシステムを含む。図はLin et al. 201712の許可を受けて再現。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ストレスのないEAにおけるPC3の成長曲線PC3は、外部ストレスの存在なしにEAで培養した。(A)位置ラベルを持つEAのパターン。(B)細胞合流の観点から選択した位置におけるPC3の成長曲線。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ストレスのないEAにおけるPC3-EPIとPC3-EMTの共培養PC3-EPI(赤色)とPC3-EMT(緑色)は、外部応力の存在なしにEAで共培養した。(A)t= 0 h.(B)t= 95 h.(C)細胞合流の観点から2つの蛍光チャネルのオーバーレイ。各細胞タイプの細胞合流をチップ全体で測定した。各データ ポイントは、15 分間隔で撮影された 3 つの連続した時点における平均セル合流を表します。誤差バーは、3回連続の時点におけるセル合流の標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:混合集団における細胞運動性アッセイ。混合母集団における単一細胞追跡性能のデモンストレーション。(A)ガウス(LoG)セグメンテーションのラプラキア語によって細胞が検出される方法のデモンストレーション。円は、LoG アルゴリズムによって検出されたセルの位置を示します。検出された細胞は、細胞の運動性を定量化するために線形割り当て問題に基づいてフレーム間でリンクされます。(B)PC3-EPIとPC3-EMT共培養実験の「創傷治癒アッセイ」。細胞は、中心に明確な境界を持つ100%合流まで局所的に播種された。EAチップの設置後、細胞は白い矢印で示すように微生物アレイを通って移動することが観察された。(C)細胞運動性のヒストグラムを正規化した。PC3-EMTはPC3-EPIよりも1.8倍高速です。誤差バーは、5つの実験サンプルの標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:PC3-EPIとPC3-EMTの長期共培養の運動性アッセイについて。均一な初期播種密度を持つPC3-EPIとPC3-EMTの長期共培養。細胞速度の分布は時間によって異なります。(A)2日目の細胞速度の正規化分布。(B)6日目の細胞速度の正規化分布。(C)各クラス間隔におけるPC3-EPIとPC3-EMTの数の比率。(D)時間の関数としてのPC3-EPIとPC3-EMTの平均速度。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
従来の細胞培養はほぼ1世紀前に開発され、がん17の臨床結果を予測する実証済みの限られた能力にもかかわらず、生物医学研究で最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。動物モデルは、ヒトに対して最も高い生理学的関連性と合理的な遺伝的類似性を提供するが、ヒトの結果を予測する上で重要な限界があることを長い間認められてきた18。すべての既存の前臨床モデルの中で、マイクロ流体癌オンチップモデルは、がん研究9、19、20の満たされていないニーズを満たすために最も有望な候補であるように見えます。しかし、現在のがんオンチップモデルは、腫瘍微小環境を包括的に模倣するための主要なコンポーネントと相互作用を再現できるプラットフォームを提供していませんが、信頼性が高く再現可能な定量データを提供するのに十分なシンプルさです。当社の代表的なデータは、当社のマイクロ流体細胞培養技術が、異種微小環境における長期細胞培養に安定した物理的および生化学的条件を提供することを示しています。この多機能プラットフォームは、時間依存性化学勾配と周囲ガス組成の高度な調整を可能にします。このプラットフォームは、細胞形態、集団動力、細胞を含む時間の関数として細胞の多次元情報を提供する高解像度リアルタイムイメージングのための蛍光反転顕微鏡のほとんどにポータブルで互換性があります。単一細胞レベルでの運動性と細胞移動。
前作11と比較して、当社のマイクロ流体デバイスのこの圧力シール包装および組み立て方法は、多数の下流実験能力(例えば、FACS、局所代謝産物抽出、サブクローン集団)を可能にすることに留意する。拡張、IF、DNA/RNAフィッシュなど)実験の過程で撮影されたタイムラプス画像を補完する。異種培養中の特定の位置から細胞を除去するこの機能は、以前のデバイスと比較して大きな進歩であり、チップへのシール表面を除去してから培養11にアクセスする必要がありました。さらに、その場合でも、カバーを取り外す行為は、単一から少数の生息地レベルでの細胞の局所的な試験が不可能になるように培養を著しく妨げました。このような局所的な抽出は、柔軟なガス透過膜の柔らかい「再密封可能」な性質のために、我々の場合に可能であった。
提示されたプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。まず、安定した流体力学を持つ長期実験を開始するには、マイクロバブルを可能な限り避ける必要があります。したがって、注射器にメディアをロードする前に、培養培地(ステップ3.4.2)を事前に温め、脱気することが重要です。メディアのローディングと分配の操作は、バブルの形成を防ぐためにゆっくりと穏やかに行われるべきです。PDMSパターンは、培養培養システムに接続する前に酸素プラズマ(ステップ3.4.3)で処理する必要があります。酸素プラズマ処理は、PDMS表面の親水性を確保し、マイクロバブルを捕捉する可能性を大幅に低減します。ステップ3.4.7.では、細胞培養膜の上にチップを置くとき、PDMSチップは、培養皿内の液体表面上の気泡(もしある場合)を取り除くために、15度の傾斜角で液体表面に近づく必要があります。第二に、圧力シール法は、細胞培養膜を加圧する安定したガス供給システムを必要とする。圧力は0.2から0.6 psiの間に設定する必要があります。0.2 psi未満の圧力は、チップシールには不十分です。1.2 psiを超えると、かなりの量のガスが膜を透過し、マイクロ流体パターン内に気泡が発生します。金属3ウェルプレートの部品が適切に組み立てられていない場合(プレート本体、ガス透過性培養用皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、Oリング、35mmガラス窓のペアを含む)、ガス漏れを識別します。圧力読み取りは、ガスの流れの増加に応答しません。漏洩の問題は、漏出テストを行い、コンポーネントを再組み立てするだけで解決できます。
EA技術を活用して取得したデータの主な形態は、イメージングです。前述のように、EA技術はあらゆる反転顕微鏡に取付けることができる。しかし、システムの利点を十分に活用するために、完全に電動x-yステージ、電動フォーカスノブ、電動シャッター、電動フィルターキューブを装備した反転蛍光顕微鏡にシステムを設置することを強くお勧めします。また、パーフェクトフォーカスは満足のいく画質を保証しない場合があることに注意してください。多次元画像取得とカスタマイズされたイメージングスクリプトを可能にするイメージングソフトウェアを使用することをお勧めします。画像に十分な焦点を合わせておくことは、画像取得サイクル中にカスタマイズされたフォーカスサーフェスを生成する定期的な(24時間または48時間ごとに)オートフォーカスコマンドなしで困難になる可能性があります。
提示されたマイクロ流体EA技術は、化学療法ストレス風景12の下で前立腺癌細胞メタ集団における適応および進化ダイナミクスを研究するために実施されている。我々はまた、この腫瘍のような不均一な微小生態学における薬剤耐性ポリプロイド巨乳巨乳細胞の出現を実証し、腫瘍集団内の細胞移動と組み合わせた環境不均一性が増幅を引き起こすことを示した。耐性の文型13の出現に.十分に制御されたストレス勾配の下で混合腫瘍細胞集団の挙動を制御および監視する能力を持つ当社のマイクロ流体EA技術は、規制メカニズムとそれに関連する表現型変換を研究するためのプラットフォームとしても役立つ可能性があります。がん治療戦略の文脈におけるEMT21.最後に、提示された圧力シール包装方法は、周囲ガス組成物の高度な調整と下流の実験能力を必要とする他のマイクロ流体システムにも実装できます。例えば、同じ包装方法を用いて、異なるマイクロ流体パターンを組み込んで、細菌集団波が物理的な障壁22を介してどのように伝播するかを調べた。
要約すると、集団集団力学は単一細胞の挙動とは質的に異なる。マイクロ流体EA技術は、進化のダイナミクスと表現力学的挙動の定量的研究を個別に、そして集合的に時間の関数として可能にする。この技術は、がん研究のためのインビトロモデルでより生理学的に関連し、前臨床薬の開発およびスクリーニングのために潜在的に提示する可能性があります。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この作業はNSF PHY-1659940によってサポートされました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
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