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Bioengineering

वास्तविक समय अवलोकन के लिए एक Microfluidic विकास त्वरक पर कैंसर आबादी के पार Heterogeneous दवा gradients की पीढ़ी

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/60185
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1, 1
1Princeton University, 2Johns Hopkins Medical Institute

Summary

हम एक microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल, "विकास त्वरक" प्रौद्योगिकी है, जो एक सेल में अच्छी तरह से परिभाषित पर्यावरण की स्थिति के भीतर कैंसर गतिशीलता के दीर्घकालिक वास्तविक समय मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक नियंत्रणीय मंच प्रदान करता है प्रस्तुत स्तर. इस प्रौद्योगिकी के लिए मौलिक अनुसंधान या पूर्व नैदानिक दवा विकास के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करने की उम्मीद है.

Abstract

पारंपरिक सेल संस्कृति सबसे अक्सर इस्तेमाल किया पूर्व नैदानिक मॉडल रहता है, इसके सिद्ध सीमित करने के लिए कैंसर में नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी करने की क्षमता के बावजूद. Microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल oversimplified पारंपरिक 2 डी संस्कृतियों और अधिक जटिल पशु मॉडल है, जो विश्वसनीय और reproduible मात्रात्मक परिणाम का उत्पादन करने की क्षमता सीमित है के बीच अंतर को पाटने का प्रस्ताव किया गया है. यहाँ, हम एक microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल है कि एक व्यापक तरीके से एक जटिल ट्यूमर microenvironment के प्रमुख घटकों को पुन: पेश प्रस्तुत है, अभी तक काफी सरल कैंसर गतिशीलता के मजबूत मात्रात्मक विवरण प्रदान करने के लिए है. इस microfluidic कैंसर पर चिप मॉडल, "विकास त्वरक," ट्यूमर microenvironments के एक परस्पर सरणी में कैंसर की कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी टूट जाता है, जबकि एक विषम chemotherapetic तनाव परिदृश्य पैदा. दवा ढाल के जवाब में प्रगति और कैंसर के विकासवादी गतिशीलता वास्तविक समय में सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती है, और कई downstream प्रयोगों के दौरान लिया समय चूक छवियों के लिए पूरक प्रदर्शन किया जा सकता है.

Introduction

कैंसर तेजी से एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है कि न केवल उत्परिवर्तित सेल आबादी के निरंतर dysgation पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी कैंसर कोशिकाओं और मेजबान microenvironment के बीच महत्वपूर्ण बातचीत पर निर्भर करता है के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया है. इस अर्थ में, कैंसर एक अनुकूली परिदृश्य पर विकसित कारकों का एक संयोजन द्वारा प्रकट, मेजबान कोशिकाओं की एक किस्म के साथ एक विषम ट्यूमर microenvironment और crosstalk सहित, जिनमें से सभी आगे आनुवंशिक या के लिए चयनात्मक दबाव योगदान एपिजेनेटिक परिवर्तन1,2,3. ठोस ट्यूमर के संदर्भ में, कीमोथेरपी और अन्य संसाधन ग्रेडिएंटका असमान वितरण उनकी आणविक विषमता में योगदान देता है और दवा प्रतिरोध के विकास में एक भूमिका निभा सकता है, विशेष ट्यूमर के लिए एंजियोजेनेसिस में वृद्धि हुई है उपजनसंख्या, और यहां तक कि मेटास्टेसिस4,5,6. पारंपरिक इन विट्रो 2 डी सेल संस्कृति अध्ययन, जबकि बड़े पैमाने पर, सुविधाजनक प्रयोगात्मक क्षमता रखने, मतलब क्षेत्र, वर्दी, और निश्चित शर्तों प्रदान करता है, अक्सर सटीक स्थानिक और लौकिक पर्यावरण नियंत्रण वास्तव में करने के लिए आवश्यक कमी विवो ट्यूमर गतिशीलता में अनुकरण। इस प्रकार, वहाँ और अधिक प्रतिनिधि पूर्व vivo मॉडल के लिए एक की जरूरत है ट्यूमर microenvironment दवा विकास पाइप लाइन में पशु मॉडल से पहले पुन: पेश करने के लिए आदेश में कैंसर प्रगति का एक बेहतर भविष्यवाणी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गतिशील तनाव के भीतर दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए परिदृश्य. माइक्रोफ्लूइडिक्स को 2 डी सेल कल्चर स्टडीज और विवो जानवरों के अध्ययनों में अधिक जटिल के बीच के अंतर को पाटने का प्रस्ताव किया गया है जो नियंत्रणीय मात्रात्मक अध्ययन7,8,9का समर्थन करने में सक्षम नहीं हो सकता है .

कैंसर सेल गतिशीलता की विशेषता के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक आदर्श अनुकूली सेलुलर प्रतिक्रियाओं है कि एक ट्यूमर में जगह ले सकता है नकल करने के लिए एक विषम microenvironment उत्पन्न करने की क्षमता के अधिकारी होना चाहिए, साथ ही एक पर इन गतिशीलता के अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं एकल सेल संकल्प. इस अनुच्छेद में, हम एक microfluidic सेल संस्कृति मंच का वर्णन, एक PDMS आधारित डिवाइस बुलाया "विकास त्वरक" (EA), कि पर वास्तविक समय डेटा अधिग्रहण के साथ सेलुलर संकल्प पर कैंसर सेल गतिशीलता के समानांतर इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देता है सप्ताह के दौरान, जबकि संस्कृति परिदृश्य भर में तनाव की ढाल को बनाए रखने stably. इस मंच का डिजाइन हमारे पिछले काम पर आधारित है , जिसमें एक मेटापॉपुलेशन में जीवों की विकासवादी गतिशीलता को10,11में त्वरित किया जा सकता है . विशेष रूप से, स्थानिक रूप से अलग आबादी के एक समूह में है कि कुछ स्तर पर बातचीत, जब एक विषम तनाव परिदृश्य के संपर्क में, सबसे फिट प्रजातियों एक स्थानीय आबादी में तेजी से एक बड़ी वर्दी आबादी की तुलना में हावी कर सकते हैं. लाभप्रद प्रजातियों तो संसाधनों और अंतरिक्ष की तलाश में पड़ोसी microhabitats के लिए पलायन, और अंत में पूरी आबादी पर हावी है. जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है , माइक्रोफ्लूइडिक ईए चिप का पैटर्न (i) सर्पाकार चैनलों की एक जोड़ी से बना है जो नए सिरे से मीडिया परिसंचरण प्रदान करता है और रासायनिक प्रसार के लिए निश्चित सीमा शर्तों का निर्माण करता है, और (पप) हेक्सागोनल कोशिका संस्कृति क्षेत्र जिसमें मध्य में 109 परस्पर हेक्सागोनल और 24 अर्ध-हेक्सागोनल कक्ष होते हैं, जो एक मधुकोश संरचना के समान होते हैं। चिप की गहराई 100 डिग्री है। मीडिया चैनलों और सेल संस्कृति क्षेत्र छोटे slits के साथ जुड़े हुए हैं (के बारे में 15 डिग्री मीटर चौड़ा), जो प्रत्यक्ष मीडिया प्रवाह और सेल संस्कृति क्षेत्र भर में जिसके परिणामस्वरूप कतरनी तनाव को रोकने, अभी तक अभी भी रसायनों छोटे slits और विनिमय पोषक तत्वों के माध्यम से फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं, चयापचय अपशिष्ट, आदि चित्र 1खमें रासायनिक प्रवणता का प्रदर्शन किया गया है, जहाँ एक मीडिया चैनल में 0ण्1 उ फ्लोरेसीन होता है जबकि दूसरा चैनल फ्लोरेसीन से मुक्त होता है। कोशिकाओं को एक गैस पारगम्य झिल्ली पर सुसंस्कृत कर रहे हैं, चिप के खिलाफ झिल्ली पर सकारात्मक पीठ दबाव के माध्यम से microstructures द्वारा encapsulate. युक्ति धारक के घटकोंको चित्र 2 में सचित्र में दिखाया गया है और प्रायोगिक सेटअप चित्र 3में सचित्र है , जहाँ संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिलोमित सूक्ष्मदर्शी पर रखा जाता है, जिसकी सापेक्ष आर्द्रता 85% सापेक्ष आर्द्रता से ऊपर होती है और इसके नीचे सशर्त ाअसा जाता है. नॉर्मक्सिया गैस संरचना.

इस प्रणाली के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट चैनलों के माध्यम से स्थानीयकृत सेलुलर बातचीत की विस्तृत अवलोकन प्रदान करता है और इस तरह के इम्यूनोफ्लोरेसींस, पश्चिमी धब्बा, या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में स्थानिक रूप से हल बहाव परख के लिए अनुमति देता है। हम पहले इस microfluidic कैंसर के एक सबूत के सिद्धांत के रूप में प्रदर्शन किया है पर चिप मॉडल लंबी अवधि के उप-संस्कृति उपकला और mesenchymal PC3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं12 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दवा प्रतिरोध बहुगुणित giantloid के उद्भव पर कैंसर कोशिकाओं उपकला पीसी 3 सेल लाइन13का उपयोग कर . जबकि हम इस मंच के आवेदन प्रस्तुत उपकला PC3 और mesenchymal प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के spatiotemporal गतिशीलता docetaxel के एक तनाव ढाल के तहत समझने के लिए, microfluidic प्रणाली आसानी से सेल लाइनों के किसी भी संयोजन के लिए लागू किया जा सकता है और संसाधन (यानी, दवा, पोषक तत्व, ऑक्सीजन) ग्रेडिएंट।

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Protocol

1. microfluidic डिवाइस का निर्माण

  1. एक लेआउट डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वांछित microfluidic पैटर्न उत्पन्न (पूरक सामग्रीदेखें).
  2. फोटोमास्क तैयार करें। अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. एक लेजर लेखक का उपयोग, एक सोडा-लीम ग्लास प्लेट पर पैटर्न लिखने के साथ लेपित 100 एनएम करोड़ और photoresist के 500 एनएम A$1518.
    2. 60 s के लिए डेवलपर A$300MIF के साथ photoresist का विकास करना।
    3. Cr-7 क्रोमियम एथेंट का उपयोग कर के फोटोप्रतिरोध से सुरक्षा के बिना क्रोमियम दूर करें।
    4. 45 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक photoresist खाल उधेड़नेवाला का उपयोग कर अवशिष्ट photoresist बंद पट्टी।
  3. photoresist पैटर्न. अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. 40 एस के लिए 4000 आरपीएम पर सिलिकॉन वेफर पर स्पिन कोट HMDS।
    2. 40 एस के लिए 4000 आरपीएम पर सिलिकॉन वेफर पर स्पिन कोट photoresist A$ 4330।
    3. नरम 60 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन वेफर सेंकना.
    4. सिलिकॉन वेफर के लिए यूवी का पर्दाफाश करने के लिए मुखौटा aligner का उपयोग करें।
    5. 4 मिनट के लिए डेवलपर A$300MIF के साथ photoresist का विकास करना।
  4. DRIE etching प्रदर्शन. अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. 100 डिग्री गहराई के लिए एक सिलिकॉन डीप रिएक्टिव आयन एचिंग (DRIE) प्रणाली का उपयोग करके फोटोरेसिस्ट के साथ पैटर्न वाले वेफर को ड्राई-एच करें।
    2. एसीटोन और प्लाज्मा आदि के साथ फोटोप्रतिरोध को एक प्लाज्मा आदि के साथ बंद करें।
  5. वेफर ऑक्सीकरण और silanization. अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. 1 ज के लिए 1100 डिग्री सेल्सियस पर एक भट्ठी में etched सिलिकॉन वेफर पर थर्मल ऑक्सीकरण प्रदर्शन करते हैं।
    2. सिलिकॉन वेफर के लिए प्रतीक्षा करें ठंडा करने के लिए, और फिर trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) की कुछ बूंदों के साथ एक desiccator में वेफर जगह वेफर के पास एक छोटे से कंटेनर में डूब गया.
    3. 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.5 atm करने के लिए desicator के दबाव पंप. सिलिकॉन वेफर मोल्ड उचित silanization, जो वेफर पर पानी की कई बूंदों को जोड़कर परीक्षण किया जा सकता है के बाद हाइड्रोफोबिक बन जाना चाहिए।
  6. शीतल लिथोग्राफी. अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. वजन अनुपात द्वारा एक 10:1 पर पूर्व बहुलक और पार-लिंकर (पॉलीमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) किट से मिलाएं।
    2. silanized सिलिकॉन वेफर मोल्ड पर ऊंचाई में एक 10 मिमी फिल्म बनाने के लिए मिश्रित PDMS डालो.
    3. Degas परिणामी PDMS-सिलिकॉन वेफर प्रणाली 30 मिनट से 1 एच के लिए एक desicator में.
    4. PDMS का इलाज करने के लिए रात भर में एक 70 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में PDMS-सिलिकॉन वेफर को इनक्यूबेट करें।
    5. एक बार PDMS ठीक हो जाता है, सिलिकॉन वेफर ध्यान से बंद PDMS फिल्म छील.
    6. बायोप्सी सुइयों का उपयोग करना, PDMS पर पैटर्न के स्थान के आधार पर प्रवेश बंदरगाहों पर छेद के माध्यम से पंच और व्यास में चिप्स 27 मिमी में कटौती करने के लिए एक परिपत्र पंच को रोजगार.
  7. PDMS परत संबंध.
    1. गर्मी 27 मिमी PDMS सिलेंडरों के दो ढेर इलाज (पैटर्निंग के बिना), जो जलाशय परत और डिवाइस के कैपिंग परत बन जाएगा.
    2. जलाशय परत पर इनलेट के आसपास दो 7 मिमी हलकों कट, और कैपिंग परत पर इनलेट बंदरगाहों पर छेद के माध्यम से पंच करने के लिए एक बायोप्सी सुई का उपयोग।
    3. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के साथ पीडीएमएस (पैटर्नेड स्टैक, जलाशय परत, कैपिंग परत) के तीन ढेर बांड।
    4. बायोप्सी सुई के साथ, दुकानों और डिवाइस के केंद्र बंदरगाह पर छेद के माध्यम से पंच.

2. मीडिया और सेल लाइन की तैयारी

  1. PC3-EMT और PC3-EPI सहित PC3-EMT और PC3-EPI सहित PC3-EMT: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x एंटीबायोटिक-antimycotic के साथ मध्यम मिश्रण पीसी 3 सेल लाइनों के लिए मीडिया तैयार करें। पहले वर्णित14के रूप में कक्ष रेखाएँ जनरेट करें.
    नोट: पीसी 3 सेल लाइनों 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में ऊपर मीडिया में बनाए रखा जाता है। विभाजन कोशिकाओं और subculture हर 3 दिन, इससे पहले कि वे 100% संगम तक पहुँचने.
  2. बेहतर दृश्य के लिए साइटोप्लाज्मिक लेबल फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ ट्रांसफेक्ट सेल लाइनों, जैसा कि पहले वर्णित12,इस तरह कि पीसी 3-ईएमटी साइटोप्लाज्मिक GFP और PC3-EPI व्यक्त साइटोप्लाज्मिक मची व्यक्त करता है। ध्यान दें कि प्रौद्योगिकी भी किसी भी फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं के साथ ही unlabeled कोशिकाओं के ब्राइटफील्ड इमेजिंग के साथ संगत है.

3. प्रायोगिक सेटअप

  1. धातु प्लेट धारक का निर्माण
    1. एक प्लेट धारक है कि मशीनिंग या 3 डी मुद्रण द्वारा समानांतर प्रयोगों के लिए एक साथ गैस पारगम्य संस्कृति व्यंजन पकड़ करने के लिए पर्याप्त है बनाना. 3 डी सीएडी फ़ाइल ("3 अच्छी तरह से प्लेट. FCStd") GitHub पर एक संदर्भ के रूप में पाया जा सकता है (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
    2. धारक के घटकों को एक पेचकश के साथ खोलना (चित्र 2) . कम से कम 1 एच के लिए यूवी जोखिम के माध्यम से घटकों को संक्रमित और एक बाँझ वातावरण में छोड़ दें।
      नोट: धारक थर्मल संतुलन और आदर्श गैस रचनाओं के लिए पर्याप्त शर्तों प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, गैस चैनल inlets कि airflow के लिए अनुमति के साथ. अधिक जानकारी हमारे पिछले काम12में पाया जा सकता है.
    3. तीन गैस पारगम्य संस्कृति व्यंजन, जिनमें से कोशिका संस्कृति झिल्ली अपेक्षाकृत लचीला है तैयार करें.
  2. सेल लाइन सीडिंग
    1. प्रयोग के शुरू होने से 24 घंटे पहले, 5 मिनट के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा पीसी 3-ईपीआई और पीसी 3-ईएमटी कोशिकाओं को फसल भर दें। प्रीवार्म्ड कल्चर मीडिया जोड़ें, फिर 3 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
    2. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर प्रत्येक PC3-EPI और PC3-EMT की कोशिकाओं की गणना और प्रत्येक गैस पारगम्य संस्कृति पकवान के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के 2.5 x 104 की कुल अलग.
    3. मिश्रण और संस्कृति मीडिया के 2 एमएल में दो सेल प्रकार resuspend और गैस पारगम्य संस्कृति पकवान में से प्रत्येक में कोशिकाओं बीज.
    4. कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए रात भर इनक्यूबेटर में पूरे प्लेट होल्डर को छोड़ दें।
    5. कम से कम 1 एच के लिए यूवी जोखिम के माध्यम से PDMS उपकरणों को संक्रमित और एक बाँझ वातावरण में छोड़ दें।
  3. थर्मल नियंत्रण इकाई और गैस आपूर्ति प्रणाली की स्थापना
    1. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, एक गैस आपूर्ति प्रणाली है कि दोनों सीओ2 और ओ2 नियंत्रण इकाइयों, एक गैस पंप, एक गैस मिश्रण कक्ष, एक humidifier या bubbler, और गैस वाल्व और दबाव गेज के तीन अलग सेट के होते हैं की स्थापना की. अधिक जानकारी हमारे पिछले काम12में पाया जा सकता है.
    2. सीओ 2 और ओ2 नियंत्रण इकाइयों को इस प्रकार स्थापित करें कि वे सीओ2 और छ2 टैंक और ओ2 स्रोत से गैस के मिश्रण दर को समायोजित करें। वैकल्पिक रूप से, किसी भी गैस की आपूर्ति प्रणाली है कि normoxia हालत के तहत गैस प्रदान करता है काम करेगा.
    3. सुनिश्चित करें कि गैस है कि मिश्रण कक्ष में संयुक्त है और एक bubbler द्वारा humidified इस तरह है कि सापेक्ष आर्द्रता 85% तक बढ़ जाती है (के रूप में एक रिश्तेदार आर्द्रता की निगरानी से बाहर पढ़ें) और यह कि गैस के लिए दबाव गेज के साथ तीन स्वतंत्र गैस वाल्व की ओर जाता है सुनिश्चित करें नियंत्रण और प्लेट धारक में गैस प्रवाह दर की निगरानी.
    4. ढक्कन और नीचे की प्लेट के लिए अलग हीटिंग subunits के साथ एक मंच पर ऊष्मायन थर्मल नियंत्रण इकाई में पूरे प्लेट धारक प्लेस, सभी इकाइयों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट. अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
  4. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस की स्थापना। अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    1. पहचानिए कि 3-वेल प्लेट धारक के विस्तृत घटक क्रम में हैं, जैसा कि चित्र 2में किया गया है। तीन कुओं में से प्रत्येक समान और स्वतंत्र हैं, प्रत्येक अच्छी तरह से गैस चैनलों की एक जोड़ी के साथ. हर अच्छी तरह से एक गैस पारगम्य संस्कृति पकवान धारक, एक PDMS चिप धारक, एक गिलास खिड़की धारक, और 35 मिमी कांच खिड़कियों की एक जोड़ी के पास. इन घटकों फिट शिकंजा का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता है.
      नोट: कांच की खिड़कियां यह सुनिश्चित करती हैं कि गैस-पारगम्य संस्कृति झिल्ली और अच्छी तरह से इस प्रकार के बीच एक तापीय-अलग स्थान है कि इंटरफ़ेस पर तापमान अंतर के कारण कोई जल संघनन नहीं होता है। ध्यान दें कि 3 कुओं स्वतंत्र हैं, और 3 प्रयोगों अलग से किया जा सकता है.
    2. 20 मिनट के लिए एक निर्वात कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस और degas पर पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम।
    3. हाइड्रोफिलिटी बनाए रखने के लिए 30 s के लिए एक ऑक्सीजन प्लाज्मा प्रणाली का उपयोग कर PDMS चिप्स का इलाज.
    4. सिरिंज सिस्टम सेट करें. ब्याज की वांछित अभिकर्मक के साथ विकास मीडिया और अन्य दो सिरिंजों के साथ धीरे-धीरे दो सिरिंजों को लोड करें (मीडिया, दवा के साथ मीडिया, आदि)। एक खोखले स्टील पिन में एक 23 जी वितरण सुई द्वारा एक 50 सेमी टयूबिंग (0.020" x 0.060"OD) के लिए प्रत्येक व्यक्ति सिरिंज कनेक्ट करें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर में एक खोखले स्टील पिन डालें।
    5. ट्यूबिंग प्रधानमंत्री और कैपिंग परत के माध्यम से प्रत्येक PDMS चिप में स्टील पिन डालने. जलाशय परत भरें और मीडिया के साथ PDMS पैटर्न परत पैटर्न गीला. जलाशय परत microfluidic पैटर्न में हो रही से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए एक पर चिप बुलबुला जाल के रूप में काम करता है.
    6. संस्कृति मीडिया के साथ एक 1 एमएल सिरिंज लोड करें। एक खोखले स्टील पिन में एक 23 जी वितरण सुई द्वारा एक 5 सेमी टयूबिंग (0.020 " x 0.060"OD) के लिए सिरिंज कनेक्ट करें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर में एक खोखले स्टील पिन डालें और ट्यूबिंग प्रधानमंत्री.
    7. चिप के केंद्र छेद में खोखले स्टील पिन डालें, जहां चिप सीलिंग प्रक्रिया के दौरान अत्यधिक मीडिया को चिप से बाद में निकाला जा सकता है।
    8. प्रत्येक PDMS डिवाइस के रूप में चार 10 एमएल सिरिंज एक सिरिंज पंप पर भरी हुई की आवश्यकता है, आगे डेक में चिप प्रति दो 10 एमएल सिरिंज लोड. सिरिंज प्रणाली के वापस लेने डेक में दो अन्य सिरिंज रखें।
    9. सीधे गैस पारगम्य संस्कृति झिल्ली के शीर्ष पर चिप प्लेस (कोशिकाओं के साथ पहले से ही झिल्ली का पालन किया). आदेश में microfluidic पैटर्न में microbubbles entrapping से बचने के लिए, विधानसभा से पहले 35 मिमी गैस पारगम्य संस्कृति पकवान में prewarmed और degassed मीडिया के 1 एमएल वितरित, और फिर सुनिश्चित करें कि चिप एक 15 डिग्री झुकाव कोण के साथ तरल सतह दृष्टिकोण.
    10. प्रत्येक चिप के लिए गैस पारगम्य संस्कृति पकवान और अच्छी तरह से गैस पारगम्य संस्कृति पकवान धारक में दबाना, PDMS चिप धारक PDMS डिवाइस नीचे धक्का के साथ.
    11. PDMS डिवाइस के शीर्ष पर एक सील रच के एक पत्रक टेप और आदेश बाहर सुखाने से चिप को रोकने के लिए PDMS चिप धारक के साथ दबाना.
    12. 20 $L/h होने के लिए सरणी के आस-पास मीडिया प्रवाह दर सेट करें।
    13. एक उलटा माइक्रोस्कोप के motorized चरण पर मंच पर इनक्यूबेटर में पूरी थाली सेट करें। गैस चैनलों के लिए गैस की आपूर्ति प्रणाली से कनेक्ट और डिवाइस की सील सुनिश्चित करने के लिए स्थापित PDMS चिप के खिलाफ गैस पारगम्य संस्कृति झिल्ली दबाव. 0.2 साई (1.4 x 104 पा) पर गेज दबाव बनाए रखें।
    14. धीरे धीरे केंद्र छेद से 1-एमएल सिरिंज का उपयोग कर चिप में अत्यधिक मीडिया निकालें. मीडिया निकालने के दौरान माइक्रोस्कोप के नीचे चिप का निरीक्षण करें और फिर चिप को सील करते समय निकालना बंद करें। चिप सीलिंग स्पष्ट होनी चाहिए क्योंकि कोशिकाओं का एक हिस्सा सूक्ष्म संरचनाओं द्वारा कुचल दिया जाएगा।
    15. ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर की तापमान संवेदन इकाई को 3-वेल प्लेट से कनेक्ट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।

4. एकल सेल समय चूक इमेजिंग

  1. समय चूक छवि अधिग्रहण करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग इमेजिंग सॉफ्टवेयर की स्थापना की। ध्यान दें कि पूरी तरह से motorized एक्स-वाई चरण के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, फोकस घुंडी, शटर, और फिल्टर क्यूब्स एक ईए प्रयोग के लिए आवश्यक है।
  2. स्वत: छवि सिलाई autofocus के एक दौर के बाद प्रत्येक चिप के लिए 10x आवर्धन पर दो चैनलों भर में छवियों को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर विन्यस्त करें। ध्यान रखें कि बिल्कुल सही फोकस की तरह स्वत: सुधार प्रणाली संतोषजनक छवि गुणवत्ता की गारंटी नहीं है. यह अधिक चिप भर में autofocus या मैनुअल ध्यान केंद्रित या तो autofocus के आधार पर लंबी अवधि के छवि अधिग्रहण के लिए एक अनुकूलित ध्यान सतह उत्पन्न करने के लिए सिफारिश की है.
  3. हर घंटे छवियों को ले लो और सप्ताह के समय पैमाने पर चल रहे प्रयोग छोड़ दें। एक दैनिक आधार पर छवि की गुणवत्ता की निगरानी और यदि आवश्यक हो तो फोकस सतह अद्यतन करें।
  4. बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंट विश्लेषण के लिए PDMS चिप और गैस पारगम्य संस्कृति पकवान तैयार करें, जैसा कि पहले13में वर्णित है।

5. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. पोस्ट-प्रयोगात्मक प्रसंस्करण
    1. छवि प्रसंस्करण और फिजी का उपयोग माप के लिए TIFF स्वरूप में छवियों को कनवर्ट करें /
    2. आगे छवि संसाधन की आसानी के लिए TIFF फ़ाइलों को संपीड़ित करें।
  2. फिजी/ImageJ विश्लेषण
    1. कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, सेल स्थान का पता लगाने और स्वत: सेल गिनती के लिए फ्लोरोसेंट उज्ज्वल स्पॉट की पहचान करने के लिए पृष्ठभूमि घटाव और कण विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
    2. सेल गतिशीलता और प्रवास का विश्लेषण करने के लिए plugins (मैन्युअल ट्रैकिंग, Chemotaxis, प्रवास उपकरण, Trackmate) का उपयोग करें।

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Representative Results

चिप पर इष्टतम सेल विकास का सत्यापन
प्रयोग मंच का एक प्रमुख लक्ष्य एक व्यापक तरीके से एक जटिल ट्यूमर microenvironment में प्रमुख घटकों और बातचीत को पुन: पेश करने के लिए है, अभी तक काफी सरल मात्रात्मक, विश्वसनीय और reproduible डेटा प्रदान करने के लिए. यह लक्ष्य तभी प्राप्त किया जा सकता है जब हमारे पास भौतिक और जैव रासायनिक पर्यावरणीय कारकों का पूरा नियंत्रण हो। हम या तो अवांछित कारकों को बाहर करना चाहिए या सही ढंग से जनसंख्या व्यवहार की व्याख्या करने के लिए मात्रात्मक मॉडल में बेकाबू कारकों को शामिल करने के लिए एक तरीका पता लगाना चाहिए.

पहला परीक्षण डिवाइस पर इष्टतम सेल विकास सुनिश्चित करने के लिए है। डिवाइस पर सेल प्रसार दर समान या पारंपरिक सेल संस्कृति में उनके विकास प्रोफ़ाइल के लिए तुलनीय होने की जरूरत है. सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, मानव प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइन PC3 कोशिकाओं बाहरी तनाव की उपस्थिति के बिना PDMS चिप में सुसंस्कृत थे. इन कोशिकाओं को कोशिका द्रव्य में फ्लोरोसेंट-लेबल किया गया था ताकि हम उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिकाओं की जनसंख्या का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित कर सकें। कोशिकाओं का संगम, जो कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया था, को फिजी15का उपयोग करके फ्लोरोसेंट छवियों पर चयनित तीव्रता सीमा को देखते हुए अलग-अलग समय-सीमाओं पर प्रत्येक माइक्रोबथायटी पर मापा गया था। प्रत्येक चुने हुए स्थान पर कोशिकाओं के विकास वक्रोंको चित्र 4 में प्लॉट किया गया है। चुना पदों चिप भर में बिखरे हुए हैं, मीडिया के प्रवाह के शीर्ष के पास क्षेत्र से मीडिया के आउटलेट के करीब शीर्ष करने के लिए.

चित्र ााल्य ः च्में वृद्धि वक्रसुमेलितहैं, जो कोशिका प्रसार प्रोफाइल की समानता को चिप में स्थिति के एक प्रकार्य के रूप में सुझाते हैं। वक्रों की प्रारंभिक ढलान प्रसार दर का पता चलता है. डिवाइस में कोशिकाओं के लिए दोहरीकरण समय लगभग 24 घंटे है जैसा कि चित्र 4बी में समय 0 से 24 घंटे तक दिखाया गया है, जो पारंपरिक संस्कृति के बर्तन13में दोहरीकरण के समय के समान है। इसलिए, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि तनाव के किसी बाह्य स्रोत की उपस्थिति के बिना, भौतिक और जैव रासायनिक कारक समान रूप से वितरित किए जाते हैं, जिससे समय 50 से 100 घंटे तक सजातीय और अनुकूलित कोशिका वृद्धि होती है।

हम आगे एक microenvironment में subpopulations के बीच सेल गतिशीलता परिमाणित करने की क्षमता पर विचार किया. GFP-expressing PC3-EMT और mCherry-expressing PC3-EPI सेल लाइनों को ईए में सह-संस्कृत किया गया जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है। कोशिका संगम, कोशिकाओं द्वारा कवर क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में परिभाषित, जनसंख्या के आकार के संकेत के रूप में मापा जाता है. 40% संगम से शुरू, सह संस्कृति 3 दिनों के भीतर पूरी तरह से confluent हो गया. दिलचस्प बात यह है कि हम सूक्ष्म पर्यावरण में प्रत्येक फीनोटाइप की प्रगति का निरीक्षण कर सकते हैं। जबकि कुल संगम की वृद्धि वक्र रसद विकास मॉडल के रूप में है, PC3-EMT की आबादी का विस्तार जारी रखा और PC3-EPI asmptotic चरण में दबा दिया गया था.

मिश्रित जनसंख्या में सेल गतिशीलता परख का प्रदर्शन
कोशिका गतिशीलता एक महत्वपूर्ण लक्षणीय व्यवहार है. एक जनसंख्या की गतिशीलता वितरण कोशिकाओं की शारीरिक बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, स्थानीय microenvironment के यांत्रिक गुण, और कभी कभी कोशिकाओं के epigenetic भिन्नता का एक संकेत के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है. यह देखते हुए कि हमारे बेहतर सेल संस्कृति मंच लगभग निरंतर इमेजिंग की अनुमति देता है, ठीक अस्थायी संकल्प होने का लाभ एक विषम आबादी में एकल सेल ट्रैकिंग की क्षमता को अधिकतम.

हम लागू करने और ट्रैकिंग प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए अनुकूलित मैक्रो के साथ फिजी (http://fiji.sc) में प्लगइन TrackMate16 का उपयोग करें। TrackMate उपयोगकर्ता को लागू करने और फिजी स्क्रिप्ट संपादक से एक पटकथा भाषा का उपयोग कर एक ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म को अनुकूलित करने के लिए अनुमति देता है। ट्रैकिंग प्रक्रिया चरणों की एक श्रृंखला में विभाजित है: विभाजन, फ़िल्टरिंग, और कण को जोड़ने प्रक्रियाओं.

जैसा कि चित्र 6खमें दिखाया गया है, हमने सेल सामूहिक प्रवास और सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रदर्शन के रूप में एक "घाव हीलिंग परख" का प्रदर्शन किया। PC3-EPI और PC3-EMT कोशिकाओं को डिवाइस के केंद्र में सघन रूप से वरीयता प्राप्त किया गया था और उन्हें स्वतंत्र रूप से खाली क्षेत्र की ओर स्थानांतरित करने की अनुमति दी गई थी। दोनों फीनोटाइप की चाल का सामान्यीकृत हिस्टोग्राम चित्र 6गमें प्लॉट किया गया है। PC3-EMT का वेग 1.8x के एक कारक द्वारा PC3-EPI की तुलना में काफी अधिक था, जो इस तथ्य के अनुरूप है कि मेसेनकाइमल फीनोटाइप असाधारण क्षमता के साथ त्वचीय घाव भरने के एक घटक के रूप में कार्य करता है, तुलनात्मक रूप से विरोध के रूप में माइग्रेट करने की क्षमता के साथ स्थिर उपकला फीनोटाइप.

इसके अलावा, आदेश में एक तनाव मुक्त वातावरण में सेल गतिशीलता की प्रगति का निरीक्षण करने के लिए, हम एक समान प्रारंभिक बोने घनत्व के साथ PC3-ईपीआई और PC3-EMT की एक दीर्घकालिक सह संस्कृति प्रदर्शन किया और समय के साथ अलग सेल वेग के वितरण पर नज़र रखी. जैसा कि चित्र 7ए, बीमें दिखाया गया है, संस्कृति के 6 दिनों के बाद, के रूप में कोशिकाओं को उच्च संगम तक पहुँच गया, दोनों phenotypes के लिए सेल की गति के वितरण बाईं पूंछ की ओर झुकाव.

हम प्रत्येक वर्ग अंतराल में PC3-EPI की संख्या के अनुपात की तुलना PC3-EMT कर सकते हैं। जैसा कि चित्र 7Cमें दिखाया गया है, संस्कृति या कोशिकाओं के घनत्व के दिनों की परवाह किए बिना, PC3-EMT उच्च गति क्षेत्र पर हावी है, जबकि PC3-EPI कम गति क्षेत्र पर कब्जा कर लिया. यद्यपि समग्र वेग दोनों फीनोटाइप्स के लिए काफी कम हो गया, पीसी 3-ईएमटी गतिशील बनी रही और चित्र 7डीमें दर्शाए अनुसार सूक्ष्म पर्यावरण की भीड़ से कम प्रभावित हुई। PC3-EPI की औसत गति 40% के आसपास गिरा दिया, जबकि कि PC3-EMT केवल 14% गिरा दिया.

वहाँ कई कारक है कि सेल वेग और औसत गति के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे जनसंख्या की भीड़. सभी उप-जनसंख्या पर सतत सेल ट्रैकिंग और निगरानी phenotypic व्यवहार की प्रगति को समझने के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, यदि हम एक लेबलहीन उप-जनसंख्या की मेसेनकाइमल स्थिति के स्तर की मात्रा निर्धारित करना चाहते हैं, तो यह न केवल भौतिक मात्रा के वितरण (उदाहरण के लिए, वेग) के एक समारोह के रूप में प्राप्त करने के लिए अधिक जानकारीपूर्ण होगा समय है, लेकिन यह भी है कि कोशिकाओं के coexisting subpopulation के बाकी के सभी.

Figure 1
चित्रा 1: सिरिंज-पंप संचालित microfluidic ईए चिप. (क)माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण में दो अलग-अलग मध्यम इनलेट, दो आउटलेट और सेल सीडिंग या अत्यधिक माध्यम के निष्कर्षण के लिए एक केंद्रीय पत्तन है। ध्यान दें कि मध्यम इनलेट और कोशिका संवर्धन सरणियों के बीच, सर्पाकार चैनलों की एक जोड़ी जो गैस-पारगम्य झिल्ली के नीचे से गुजरे वायुमंडल के साथ माध्यम को बराबर करने की अनुमति देती है। (ख) ढाल का उत्पादन। सिरिंज ों के साथ मध्यम पंप $ 0.1 mM fluorescein और कोई fluorescein के साथ क्रमशः चिप में 2 मध्यम inlets के माध्यम से दाईं ओर, बाईं ओर 2 मध्यम दुकानों पर चिप से बाहर निकाला. फ्लोरेसीन की सांद्रता फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता के समानुपाती होती है, और इसे मध्य ख के निकट मध्यम इनलेट्स/आउटलेट्सके निकट profiled किया जाता है। चित्र लिन एट अल से अनुमति के साथ पुनरुत्पादित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अनुकूलित 3 अच्छी तरह से नमूना प्लेट के घटक. (क) 3 अच्छी प्लेट का मुख्य शरीर; (ख)गैस चैनलों की एक जोड़ी जो वातानुकूलित वातावरण को पंप करने की अनुमति देते हैं और गैस चैनलों के प्रवेश द्वार पर सेप्टा के माध्यम से बाहर निकल जाते हैं; (ग)एक ओ-अंगूठी जिसे अच्छी प्लेट और गैस पारगम्य संस्कृति डिश के बीच की जगह को सील करने के लिए डिज़ाइन किया गया है; (घ)35 मिमी व्यास गैस पारगम्य संस्कृति पकवान; (ई) डिश धारक; (च)PDMS डिवाइस; (जी) PDMS चिप धारकों; (ज)डबल परत 35 मिमी ग्लास खिड़कियां थर्मल अलगाव बनाए रखने और पानी संघनन को रोकने के लिए बनाया गया; (i)कांच की खिड़की धारक; (जे)हीटिंग पैड; (k) तापमान सेंसर; (स)चिपकने वाला सीलर जो चिप को सूखने से रोकता है। लिन एट अल से अनुमति के साथ चित्रा पुनरुत्पादित 201712. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध आंकड़ा. गैस आपूर्ति प्रणाली, गैस चैनल कनेक्शन, मध्यम आपूर्ति कनेक्शन और इमेजिंग प्रणाली सहित प्रयोग की स्थापना। लिन एट अल से अनुमति के साथ चित्रा पुनरुत्पादित 201712. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: तनाव के बिना ईए में PC3 के वृद्धि वक्र। PC3 बाहरी तनाव की उपस्थिति के बिना ईए में सुसंस्कृत थे. (ए) स्थिति लेबल के साथ ईए का पैटर्न। (ठ) सेल संगम के संदर्भ में चुने गए पदों पर PC3 के विकास वक्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: तनाव के बिना ईए में PC3-EPI और PC3-EMT की सह-संस्कृति। PC3-EPI (लाल) और PC3-EMT (हरा) सह बाहरी तनाव की उपस्थिति के बिना ईए में संस्कृति थे. (क) सेल संगम के संदर्भ में ट र् 0 ज (ठ) फ्लोरोसेंट इमेजपर ली गई दो फ्लोरोसेंट चैनलों का ओवरले । प्रत्येक सेल प्रकार के सेल संगम पूरे चिप पर मापा गया था. प्रत्येक डेटा बिंदु 15-मिनट अंतराल पर लिए गए 3 लगातार समय बिंदुओं पर औसत सेल संगम का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ 3 लगातार समय बिंदुओं पर सेल संगम के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एक मिश्रित आबादी में सेल गतिशीलता परख. एक मिश्रित आबादी में एकल सेल ट्रैकिंग प्रदर्शन का प्रदर्शन. ((क)गौसियन (एलओजी) विभाजन के लैप्लासी द्वारा कोशिकाओं का पता किस प्रकार किया जाता है। हलकों लॉग एल्गोरिथ्म द्वारा पता लगाया कोशिकाओं के स्थान से संकेत मिलता है. पता चला कोशिकाओं सेल गतिशीलता मात्रा के लिए रैखिक असाइनमेंट समस्या के आधार पर फ्रेम से फ्रेम करने के लिए जुड़े हुए हैं। (बी) पीसी 3-ईपीआई और पीसी 3-ईएमटी सह-संस्कृति प्रयोग की "घाव चिकित्सा परख"। कोशिकाओं को स्थानीय स्तर पर 100% केंद्र में एक स्पष्ट सीमा के साथ संगम तक बीज थे. ईए चिप की स्थापना के बाद, कोशिकाओं को सफेद तीर द्वारा इंगित के रूप में microhabitat सरणी के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए मनाया गया. (ग) कोशिका गतिशीलता का सामान्य हिस्टोग्राम। PC3-EMT 1.8x के एक कारक द्वारा PC3-EPI की तुलना में तेजी है। त्रुटि पट्टियाँ 5 प्रयोग नमूनों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: पीसी 3-ईपीआई और पीसी 3-ईएमटी की दीर्घकालिक सह-संस्कृति की गतिशीलता परख। एक समान प्रारंभिक बोने घनत्व के साथ PC3-EPI और PC3-EMT की एक दीर्घकालिक सह-संस्कृति। सेल वेग का वितरण समय के साथ बदलता रहता है। (क)दूसरे दिन सेल गति का सामान्य वितरण। (ठ) दिन 6 पर सेल की गति का सामान्यीकृत वितरण। (ग)प्रत्येक वर्ग अंतराल में पीसी 3-ईपीआई की संख्या का अनुपात PC3-EMT के लिए। (घ)समय के एक समारोह के रूप में PC3-EPI और PC3-EMT की औसत गति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पारंपरिक सेल संस्कृति लगभग एक सदी पहले विकसित किया गया था और जैव चिकित्सा अनुसंधान में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया पूर्व नैदानिक मॉडल बनी हुई है, इसके सिद्ध सीमित करने के लिए कैंसर में नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी करने की क्षमता के बावजूद17. पशु मॉडल मानव के लिए उच्चतम शारीरिक प्रासंगिकता और उचित आनुवंशिक समानता प्रदान करते हैं, लेकिन लंबे समय से मानव परिणामों की भविष्यवाणी में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं स्वीकार किया गया है18. सभी मौजूदा पूर्व नैदानिक मॉडलों में, माइक्रोफ्लूइडिक कैंसर-ऑन-चिप मॉडल कैंसर अनुसंधान9,19,20में कच्ची आवश्यकता को पूरा करने के लिए सबसे होनहार उम्मीदवार प्रतीत होते हैं। हालांकि, वर्तमान कैंसर पर चिप मॉडल अभी तक एक मंच है कि प्रमुख घटकों और बातचीत को पुन: पेश करने के लिए एक व्यापक तरीके से एक ट्यूमर microenvironment नकल करने में सक्षम है की पेशकश करने के लिए, अभी तक काफी सरल विश्वसनीय और reproduible मात्रात्मक डेटा प्रदान करने के लिए. हमारे प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है कि हमारे microfluidic सेल संस्कृति प्रौद्योगिकी विषमांगी microenvironments में लंबी अवधि के सेल संस्कृति के लिए स्थिर शारीरिक और जैव रासायनिक स्थितियों प्रदान करता है. इस बहुआयामी मंच एक समय पर निर्भर रासायनिक ढाल के साथ ही परिवेश गैस संरचना के परिष्कृत समायोजन की अनुमति देता है. मंच पोर्टेबल और उच्च संकल्प वास्तविक समय इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट उल्टे माइक्रोस्कोप के अधिकांश के लिए संगत है, जो समय के एक समारोह के रूप में कोशिकाओं की बहुआयामी जानकारी प्रदान करता है, सेल आकृति विज्ञान सहित, जनसंख्या गतिशीलता, सेल गतिशीलता और एक एकल सेल स्तर पर सेल प्रवास.

हमारे पिछले काम11की तुलना में, हम ध्यान दें कि हमारे microfluidic डिवाइस के लिए इस दबाव सील पैकेजिंग और विधानसभा विधि कई बहाव प्रयोग क्षमता सक्षम बनाता है (जैसे, FACS, स्थानीय मेटाबोलाइट निष्कर्षण, उप-क्लोनल आबादी विस्तार, IF, DNA/RNA FISH, आदि) प्रयोगों के दौरान लिया समय चूक छवियों के पूरक. विषमजात संस्कृति में विशिष्ट स्थानों से कोशिकाओं को हटाने की यह क्षमता पहले के उपकरणों की तुलना में एक प्रमुख अग्रिम है, जहां एक चिप के लिए सील सतह को हटाना था इससे पहले कि कोई संस्कृति11का उपयोग कर सकता था। इसके अलावा, यहां तक कि उस मामले में, कवर को हटाने का कार्य संस्कृति को काफी परेशान करता है ताकि एक से कुछ आवास स्तरों पर कोशिकाओं का स्थानीय परीक्षण संभव नहीं था। लचीला गैस पारगम्य झिल्ली के नरम "रीसीलेबल" प्रकृति के कारण इस तरह के स्थानीयकृत निष्कर्षण हमारे मामले में संभव था।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, स्थिर fluidic गतिशीलता के साथ एक लंबी अवधि के प्रयोग आरंभ करने के लिए, microbubbles के रूप में ज्यादा संभव के रूप में बचा जाना चाहिए. इसलिए, यह prewarm और degas संस्कृति माध्यम (कदम 3.4.2) सिरिंजों में मीडिया लोड करने से पहले महत्वपूर्ण है. बुलबुला गठन को रोकने के लिए मीडिया लोडिंग और वितरण का हेरफेर धीरे-धीरे और धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। PDMS पैटर्न संस्कृति मीडिया आपूर्ति प्रणाली से कनेक्ट करने से पहले ऑक्सीजन प्लाज्मा (चरण 3.4.3) के साथ इलाज किया जाना चाहिए. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार PDMS सतह के hydrophilicity सुनिश्चित करता है और काफी microbubble entrapping की संभावना कम कर देता है. चरण 3.4.7. में, जब कोशिका संस्कृति झिल्ली के शीर्ष पर चिप रखने, PDMS चिप एक 15 डिग्री झुकाव कोण के साथ तरल सतह दृष्टिकोण चाहिए करने के लिए बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए (यदि कोई हो) संस्कृति पकवान के अंदर तरल सतह पर. दूसरे, दबाव सील विधि एक स्थिर गैस की आपूर्ति प्रणाली है कि सेल संस्कृति झिल्ली दबाव की आवश्यकता है. दबाव 0.2 से 0.6 साई के बीच सेट किया जाना चाहिए। 0.2 साई से कम दबाव चिप सीलिंग के लिए अपर्याप्त है। ऊपर 1.2 साई, गैस का एक महत्वपूर्ण राशि झिल्ली के माध्यम से व्याप्त है और microfluidic पैटर्न के भीतर बुलबुले उत्पन्न होगा. हम ध्यान दें कि अगर धातु 3 अच्छी तरह से थाली के घटकों को ठीक से इकट्ठा नहीं कर रहे हैं (प्लेट शरीर सहित, गैस पारगम्य संस्कृति पकवान धारक, एक PDMS चिप धारक, एक गिलास खिड़की धारक, ओ-अंगूठी, और 35 मिमी कांच खिड़कियों की एक जोड़ी), एक रिसाव गैस की पहचान के रूप में होगा दबाव पढ़ने गैस प्रवाह की वृद्धि के लिए अप्रतिसादी होगा. रिसाव समस्या बस एक रिसाव परीक्षण कर रही है और फिर घटकों reassembling द्वारा हल किया जा सकता है।

ईए प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ प्राप्त आंकड़ों का प्रमुख रूप इमेजिंग के माध्यम से है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ईए प्रौद्योगिकी किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया जा सकता है। हालांकि, पूरी तरह से प्रणाली के फायदे का फायदा उठाने के लिए, यह अत्यधिक पूरी तरह से motorized एक्स-वाई चरण, motorized फोकस घुंडी, motorized शटर, और motorized फिल्टर घन के साथ सुसज्जित एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर प्रणाली स्थापित करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, ध्यान रखें कि बिल्कुल सही फोकस संतोषजनक छवि गुणवत्ता की गारंटी नहीं हो सकता है. हम एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि बहु आयामी छवि अधिग्रहण और अनुकूलित इमेजिंग स्क्रिप्ट की अनुमति देता है का उपयोग करने का सुझाव देते हैं. छवियों को अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित रखते हुए एक आवधिक (हर 24 घंटे या 48 घंटे) autofocus आदेश है, जो छवि अधिग्रहण चक्र के दौरान एक अनुकूलित ध्यान सतह उत्पन्न बिना चुनौतीपूर्ण हो सकता है.

प्रस्तुत माइक्रोफ्लूइडिक ईए प्रौद्योगिकी को एक रसायन चिकित्सा तनाव परिदृश्य12के तहत प्रोस्टेट कैंसर सेल मेटापॉपेशन में अनुकूलन और विकास गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है . हम भी इस ट्यूमर की तरह विषम सूक्ष्म पारिस्थितिकी में दवा प्रतिरोध बहुगुणित विशाल कैंसर कोशिकाओं के उद्भव का प्रदर्शन किया है, दिखा रहा है कि पर्यावरण विषमता ट्यूमर आबादी के भीतर सेल प्रवास के साथ संयुक्त प्रवर्धन का कारण होगा प्रतिरोधी phenotypes13के उद्भव पर . नियंत्रण और अच्छी तरह से नियंत्रित तनाव gradients के तहत मिश्रित ट्यूमर सेल आबादी के व्यवहार की निगरानी करने की क्षमता के साथ, हमारे microfluidic ईए प्रौद्योगिकी भी नियामक तंत्र और phenotypic परिवर्तन में शामिल अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं कैंसर चिकित्सीय रणनीतियों के संदर्भ में EMT21| पिछले नहीं बल्कि कम से कम, प्रस्तुत दबाव सील पैकेजिंग विधि भी अन्य microfluidic प्रणाली है कि परिवेश गैस संरचना के परिष्कृत समायोजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव प्रयोग क्षमता की आवश्यकता में लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, उसी पैकेजिंग विधि का उपयोग विभिन्न माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्न को शामिल करने के लिए किया गया था ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि जीवाणु जनसंख्या तरंगें भौतिक अवरोधों के माध्यम से किस प्रकार प्रचार करती हैं22।

संक्षेप में, सामूहिक जनसंख्या गतिशीलता गुणात्मक एकल-सेल व्यवहार से भिन्न होती है। microfluidic ईए प्रौद्योगिकी विकासवादी गतिशीलता और phenotypic व्यवहार के मात्रात्मक अध्ययन व्यक्तिगत और सामूहिक रूप से समय के एक समारोह के रूप में अनुमति देता है. इस तकनीक कैंसर अनुसंधान के लिए इन विट्रो मॉडल में एक और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक पेश कर सकते हैं, और संभावित रूप से पूर्व नैदानिक दवा विकास और स्क्रीनिंग के लिए.

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Disclosures

ब्याज का कोई संघर्ष घोषित नहीं किया गया।

Acknowledgments

यह कार्य एनएसएफ पीएचई-1659940 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes BD 14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic Sigma-Aldrich A5955 1x anti-anti
AZ 300 MIF Merck KGaA 18441123163 Photoresist developer
AZ1518 Merck KGaA AZ1518 Photoresist
AZ4330 Merck KGaA AZ4330 Photoresist
Cr Chromium Etchant Sigma-Aldrich 651826
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation 10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter Heidelberg Instruments DWL66+ Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich 379212 For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins New England Small Tube NE-1300-01  .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame ibidi 10929 On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needle McMaster-Carr 75165A684 To connect syringes and tubings
Lumox dish 35 Sarstedt 94.6077.331 Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165 Dow Electronic Materials Microposit Remover 1165 Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer Bio-Rad Laboratories MSB1001 Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing) McMaster-Carr 9452K114 Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing) McMaster-Carr 9452K74 Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System Plasmatic Systems, Inc Plasma-Preen Oxygen plasma system
RPMI 1640 Life Technologies Corporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIE Samco RIE800iPB Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner SUSS MicroTec MA6 Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone Elastomer Fisher Scientific NC9285739 PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher PVA TePla M4L Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) Sigma-Aldrich 448931 For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) Cole-Parmer EW-06419-01 Tubings for media delivery

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 151 microfabrication कैंसर पर एक चिप ट्यूमर microenvironment रसायन चिकित्सा ढाल प्रतिरोध सेल प्रवास
वास्तविक समय अवलोकन के लिए एक Microfluidic विकास त्वरक पर कैंसर आबादी के पार Heterogeneous दवा gradients की पीढ़ी
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Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y.,… More

Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y., Pienta, K. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation. J. Vis. Exp. (151), e60185, doi:10.3791/60185 (2019).

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