Summary
Vi presentiamo un modello microfluidico cancro su chip, la tecnologia "Evolution Accelerator", che fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine in tempo reale della dinamica del cancro all'interno di condizioni ambientali ben definite a singola cellula livello. Si prevede che questa tecnologia funzionerà come modello in vitro per la ricerca fondamentale o lo sviluppo di farmaci preclinici.
Abstract
La coltura cellulare convenzionale rimane il modello preclinico più utilizzato, nonostante la sua capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro. Sono stati proposti modelli microfluidici cancero-su chip per colmare il divario tra le colture 2D convenzionali semplificate e i modelli animali più complicati, che hanno una capacità limitata di produrre risultati quantitativi affidabili e riproducibili. Qui, presentiamo un modello microfluidico cancro su chip che riproduce i componenti chiave di un microambiente tumorale complesso in modo completo, ma è abbastanza semplice da fornire solide descrizioni quantitative delle dinamiche tumorali. Questo modello microfluidico cancro su chip, l'"Acceleratore evoluzione", scompone una grande popolazione di cellule tumorali in una serie interconnessa di microambienti tumorali generando un paesaggio di stress chemioterapico eterogeneo. La progressione e la dinamica evolutiva del cancro in risposta al gradiente farmacologico possono essere monitorate per settimane in tempo reale, e numerosi esperimenti a valle possono essere eseguiti in complemento alle immagini time-lapse scattate nel corso degli esperimenti.
Introduction
Il cancro è stato sempre più riconosciuto come un ecosistema complesso che dipende non solo dalla continua disregolazione delle popolazioni di cellule mutate, ma anche dalle interazioni vitali tra le cellule tumorali e il microambiente ospite. In questo senso, il cancro si evolve su un paesaggio adattivo che si manifesta con una combinazione di fattori, tra cui un microambiente tumorale eterogeneo e un incrocio con una varietà di cellule ospiti, che contribuiscono a pressioni selettive per ulteriori cambiamenti epigenetici1,2,3. Nel contesto dei tumori solidi, la distribuzione irregolare della chemioterapeutica e di altre sfumature di risorse contribuisce alla loro eterogeneità molecolare e può svolgere un ruolo nello sviluppo della resistenza ai farmaci, una maggiore angiogenesi a particolari tumori sottopopolazioni, e anche metastasi4,5,6. Gli studi convenzionali sulla coltura cellulare 2D in vitro, pur possedendo una capacità sperimentale su larga scala e conveniente, forniscono condizioni mediche, uniformi e fisse, spesso prive del preciso controllo ambientale spaziale e temporale necessario per emulare la dinamica tumorale in vivo. Pertanto, è necessario disporre di modelli ex vivo più rappresentativi per riprodurre il microambiente tumorale prima dei modelli animali nella pipeline di sviluppo dei farmaci, al fine di una migliore previsione della progressione del cancro e di risposte ai farmaci all'interno dello stress dinamico Paesaggi. La microfluidica è stata proposta per colmare il divario tra studi sulla coltura cellulare 2D e studi sugli animali in vivo più complessi che potrebbero non essere in grado di sostenere studi quantitativi controllabili7,8,9.
Un sistema in vitro ideale per caratterizzare la dinamica delle cellule tumorali dovrebbe possedere la capacità di generare un microambiente eterogeneo per imitare le risposte cellulari adattabili che possono avvenire in un tumore, nonché consentire l'osservazione di queste dinamiche in un risoluzione a cella singola. In questo articolo, descriviamo una piattaforma di coltura cellulare microfluidica, un dispositivo basato su PDMS chiamato "Evolution Accelerator" (EA), che consente studi paralleli in vitro della dinamica delle cellule tumorali a risoluzione cellulare con acquisizione di dati in tempo reale corso di settimane, pur mantenendo stabilmente gradienti di stress in tutto il paesaggio culturale. La progettazione di questa piattaforma si basa sul nostro lavoro precedente, in cui le dinamiche evolutive degli organismi in una metapopolazione possono essere accelerate10,11. In particolare, in un gruppo di popolazioni separate spazialmente che interagiscono a un certo livello, quando esposte a un paesaggio di stress eterogeneo, le specie più in forma possono dominare in una popolazione locale più velocemente rispetto a quella di una grande popolazione uniforme. Le specie vantaggiose migrano quindi verso i microhabitat vicini in cerca di risorse e spazio, e alla fine dominano l'intera popolazione. Come mostrato nella Figura 1,il modello del chip EA microfluidico è composto da (i) una coppia di canali serpentini che forniscono una circolazione dei supporti freschi e costruiscono condizioni limite fisse per la diffusione chimica e (ii) la regione di coltura cellulare esagonale che consiste di 109 camere esagonali interconnesse e 24 camere semi-esagonali al centro, simile a una struttura a nido d'ape. Il chip è 100 m di profondità. I canali mediatici e la regione di coltura cellulare sono collegati con piccole fessure (larghe circa 15 m), che impediscono il flusso diretto dei media e il conseguente stress da taglio nell'area di coltura cellulare, ma consentono comunque alle sostanze chimiche di diffondersi attraverso piccole fessure e scambiare nutrienti, rifiuti metabolici, ecc. La generazione di gradienti chimici è illustrata nella Figura 1B, in cui un canale multimediale contiene 0,1 mM di fluoresceina mentre l'altro canale è privo di fluoresceina. Le cellule sono coltivate su una membrana permeabile a gas, incapsulata dalle microstrutture attraverso la pressione posteriore positiva sulla membrana contro il chip. I componenti del titolare del dispositivo sono illustrati nella Figura 2e la configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 3, dove la coltura viene mantenuta al microscopio invertito a 37 , con umidità relativa superiore all'85%, e condizionata in composizione del gas normoxia.
Questo sistema fornisce un'osservazione dettagliata delle interazioni cellulari localizzate tramite canali luminosi e fluorescenti e consente analisi a valle risolte nello spazio come l'immunofluorescenza, la macchia occidentale o la spettrometria di massa. In precedenza abbiamo dimostrato come una prova di principio di questo modello microfluidico cancro su chip sulla co-coltura a lungo termine delle cellule tumorali della prostata PC3 epiteria e mesenchymal12, nonché l'emergere di cellule poliploidi di resistenza ai farmaci 12 cellule tumorali utilizzando la linea cellulare PC3 epiteliale13. Mentre presentiamo l'applicazione di questa piattaforma per comprendere la dinamica spatiotemporale del PC3 epiteliale e delle cellule tumorali della prostata mesenchymal sotto un gradiente di stress di docetaxel, il sistema microfluidico può essere facilmente applicato a qualsiasi combinazione di linee cellulari e gradienti di risorse (ad es. droghe, nutrienti, ossigeno).
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Protocol
1. Fabbricazione di dispositivi microfluidici
- Generare il modello microfluidico desiderato utilizzando un software di progettazione del layout (vedere Materiali supplementari).
- Fabbricare la fotomaschera. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Utilizzando uno scrittore laser, scrivere il modello su una lastra di vetro soda-lime rivestito con 100 nm di Cr e 500 nm di photoresist A-1518.
- Sviluppare il fotoresist con lo sviluppatore A300MIF per 60 s.
- Incidere il cromo senza protezione dal fotoresist utilizzando Cr-7 Chromium Etchant.
- Elimina il fotoresist residuo con una spogliarellista fotoresist a 70 gradi centigradi per 45 min.
- Pattern il fotoresist. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Cappotto di rotazione HMDS su wafer di silicio a 4000 giri/min per 40 s.
- Spin cappotto fotoresist A4330 su wafer di silicio a 4000 rpm per 40 s.
- Cuocere il wafer di silicio a 95 gradi centigradi per 60 s.
- Utilizzare l'allineatore maschera per esporre i raggi UV al wafer di silicio.
- Sviluppare il fotoresist con lo sviluppatore A300MIF per 4 min.
- Eseguire l'incisione DRIE. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Asciugare il wafer modellato con il fotoresist utilizzando un sistema Silicon Deep Reactive Ion Etching (DRIE) per una profondità di 100 m.
- Spogliare il fotoresist con acetone e plasma inciso con un plasma etcher.
- Ossidazione e silanizzazione del wafer. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Eseguire l'ossidazione termica sul wafer di silicio inciso in un forno a 1100 gradi centigradi per 1 h.
- Attendere che il wafer di silicio si raffreddi, quindi mettere il wafer in un desiccatore con qualche goccia di trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) gocciolava in un piccolo contenitore vicino al wafer.
- Pompare la pressione del desiccatore a 0,5 atm a temperatura ambiente per 60 min. Lo stampo del wafer di silicio dovrebbe diventare idrofobico dopo una corretta silanizzazione, che può essere testata aggiungendo diverse goccioline d'acqua sul wafer.
- Litografia morbida. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Mescolare prepolimero e cross-linker (da kit polimetilsiloxane (PDMS) a un rapporto di peso 10:1.
- Versare il PDMS misto per creare una pellicola di 10 mm di altezza sullo stampo di wafer di silicio silanizzato.
- Degas il sistema di wafer PDMS-silicon risultante in un desiccatore per 30 min a 1 h.
- Incubare il wafer PDMS-silicon in un'incubatrice di 70 gradi centigradi durante la notte per curare il PDMS.
- Una volta che il PDMS è guarito, sbucciare con cura la pellicola PDMS dal wafer di silicio.
- Utilizzando aghi biopsia, perforare le porte di inserimento in base alla posizione del modello sul PDMS e utilizzare un punzone circolare per tagliare chip di 27 mm di diametro.
- Legame strato PDMS.
- Il calore cura due pile di cilindri PDMS da 27 mm (senza patterning), che diventeranno lo strato di serbatoio e lo strato di tappatura del dispositivo.
- Ritagliare due cerchi da 7 mm intorno alle insenature sullo strato del serbatoio e utilizzare un ago biopsia per perforare i fori alle porte di ristoro sullo strato di tappatura.
- Legare tre pile di PDMS (stack modellato, strato di serbatoio, strato di tappatura) con trattamento al plasma di ossigeno.
- Con l'ago della biopsia, perforare i fori alle prese e alla porta centrale del dispositivo.
2. Preparazione della linea di file multimediali e celle
- Preparare i supporti per la coltura di linee cellulari PC3, tra cui PC3-EMT e PC3-EPI: mescolare RPMI 1640 medio con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1x antibiotic-antimycotico. Generare le linee di cella come descritto in precedenza14.
NOTA: le linee cellulari PC3 sono mantenute nei media di cui sopra in incubatrici umidificate a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Dividi le cellule e la sottocultura ogni 3 giorni, prima che raggiungano il 100% di confluenza. - Le linee cellulari transfect con marcatori fluorescenti con etichettaci citoplasmase per una migliore visualizzazione, come descritto in precedenza12, in modo tale che PC3-EMT esprime GFP citoplasmica e PC3-EPI esprime mCherry citoplasmaco. Si noti che la tecnologia è compatibile anche con qualsiasi cella con etichetta fluorescente e con l'imaging a campo luminoso di cellule senza etichetta.
3. Configurazione sperimentale
- Fabbricazione del supporto per piastre metalliche
- Fabbricare un supporto di piastra sufficiente a contenere piatti di coltura simultanei permeabili a gas per esperimenti paralleli mediante lavorazione o stampa 3D. Il file CAD 3D ("piastra a 3 piani. FCStd") può essere trovato su GitHub come riferimento (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Svitare i componenti del supporto (Figura 2) con un cacciavite. Disinfettare i componenti tramite esposizione ai raggi UV per almeno 1 h e lasciare in un ambiente sterile.
NOTA: Il supporto è progettato per fornire condizioni sostanziali per l'equilibrio termico e composizioni ideali del gas, con insenature a canale di gas che consentono il flusso d'aria. Maggiori dettagli possono essere trovati nel nostro lavoro precedente12. - Preparare fino a tre piatti di coltura permeabili al gas, di cui la membrana cellulare è relativamente flessibile.
- Seeding della linea cellulare
- 24 ore prima dell'inizio dell'esperimento, raccogliere le cellule PC3-EPI e PC3-EMT propsinizzazione per 5 min. Aggiungere supporti di coltura preriscaldati, quindi centrificare a 150 x g per 3 min e scartare il supernatante.
- Contare le celle di ogni PC3-EPI e PC3-EMT utilizzando un emocitometro e isolare un totale di 2,5 x 104 di ogni tipo di cellula per ogni piatto di coltura permeabile per gas.
- Mescolare e risospendere i due tipi di cellule in 2 mL di mezzi di coltura e seminare le cellule in ciascuna delle parabole di coltura permeabili al gas.
- Lasciare l'intero supporto della piastra nell'incubatrice durante la notte per le cellule da attaccare.
- Disinfettare i dispositivi PDMS tramite esposizione ai raggi UV per almeno 1 h e lasciare in un ambiente sterile.
- Impostazione dell'unità di controllo termico e del sistema di alimentazione del gas
- Come mostrato nella Figura 3, istituire un sistema di alimentazione del gas costituito da unità di controllo CO2 e O2, una pompa di gas, una camera di miscelazione a gas, un umidificatore o un gorgogliatore e tre set separati di valvole di gas e indicatori di pressione. Maggiori dettagli possono essere trovati nel nostro lavoro precedente12.
- Impostare le unità di controllo CO2 e O2 in modo da regolare il tasso di miscelazione del gas dai serbatoi CO2 e N2 e dalla sorgente O2. In alternativa, qualsiasi sistema di approvvigionamento di gas che fornisca gas in condizioni di ossia funzionerebbe.
- Assicurarsi che il gas combinato nella camera di miscelazione e umidizzato da un gorgogliatore in modo tale che l'umidità relativa sia aumentata fino all'85% (come letto da un monitor di umidità relativa) e che il gas porti a tre valvole di gas indipendenti con indicatori di pressione per controllare e monitorare la portata del gas nel supporto della piastra.
- Posizionare l'intero supporto della piastra in un'unità di controllo termico di incubazione in fase con sottounità di riscaldamento separate per il coperchio e la piastra inferiore, con tutte le unità impostate a 37 gradi centigradi. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Installazione di dispositivo microfluidico. Per ulteriori dettagli, vedere Tabella dei materiali.
- Identificare che i componenti dettagliati del supporto piastra 3-po sono in ordine, come in Figura 2. Ognuno dei tre pozzi sono identici e indipendenti, con un paio di canali di gas per ogni pozzo. Ogni pozzo possiede un portapiatti a gas permeabile, un supporto per chip PDMS, un supporto per finestre di vetro e un paio di finestre di vetro da 35 mm. Questi componenti possono essere assemblati utilizzando le viti montate.
NOTA: Le finestre di vetro assicurano che vi sia uno spazio termoisolato tra la membrana di coltura permeabile a gas e il pozzo in modo che non si verifichi la condensa dell'acqua a causa delle differenze di temperatura all'interfaccia. Si noti che i 3 pozzi sono indipendenti e 3 esperimenti possono essere eseguiti separatamente. - Mezzo di coltura pre-caldo a 37 gradi centigradi e degas in una camera a vuoto per 20 min.
- Trattare i chip PDMS utilizzando un sistema plasma di ossigeno per 30 s al fine di mantenere l'idrofiliacertezza.
- Impostare il sistema di siringhe. Caricare due siringhe lentamente con mezzi di crescita e altre due siringhe con il reagente di interesse desiderato (media, media con droga, ecc.). Collegare ogni singola siringa a un tubo da 50 cm (0,020" x 0,060"OD) con un ago da 23 G in un perno di acciaio cavo. Inserire un perno in acciaio cavo nell'altra estremità del tubo.
- Prime il tubo e inserire il perno d'acciaio in ogni chip PDMS attraverso lo strato di tappatura. Riempire il livello del serbatoio e umidare il pattern pattern PDMS con i supporti. Lo strato di serbatoio funziona come una trappola a bolle su chip per evitare che le bolle d'aria entrino nel modello microfluidico.
- Caricare una siringa da 1 mL con i supporti di coltura. Collegare la siringa a un tubo da 5 cm (0,020" x 0,060"OD) con un ago da 23 G che eroga in un perno d'acciaio cavo. Inserire un perno in acciaio cavo nell'altra estremità del tubo e prime il tubo.
- Inserire il perno in acciaio cavo nel foro centrale del chip, dove un numero eccessivo di supporti può essere estratto dal chip in un secondo momento durante il processo di sigillazione del chip.
- Poiché ogni dispositivo PDMS richiede quattro siringhe da 10 mL caricate su una pompa di siringa, caricare due siringhe da 10 mL per chip nel ponte di prua. Posizionare le altre due siringhe nel ponte di ritiro del sistema di siringhe.
- Posizionare il chip direttamente sopra le membrane di coltura permeabili al gas (con cellule già aderenti alle membrane). Per evitare di intrappolare microbolle nel modello microfluidico, erogare 1 mL di supporti preriscaldati e degassati nella parabola di coltura permeabile a gas di 35 mm prima dell'assemblaggio, quindi assicurarsi che il chip si avvicini alla superficie liquida con un angolo di inclinazione di 15 gradi.
- Bloccare il piatto di coltura a gas permeabile e il pozzo nel portapiatti a gas permeabile per ogni chip, con il titolare del chip PDMS che spinge il dispositivo PDMS verso il basso.
- Nastro adesivo su un sigillante sulla parte superiore del dispositivo PDMS e morsetto con il supporto del chip PDMS per evitare che il chip si secchi.
- Impostare la portata del flusso multimediale intorno all'array in modo che sia di 20 l/h.
- Impostare l'intera piastra nell'incubatrice sul palco sullo stadio motorizzato di un microscopio invertito. Collegare il sistema di alimentazione del gas ai canali del gas e pressurizzare la membrana di coltura a gas permeabile contro il chip PDMS installato per garantire la sigillazione del dispositivo. Mantenere la pressione del misuratore a 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).
- Estrarre lentamente un numero eccessivo di supporti nel chip utilizzando la siringa da 1 mL dal foro centrale. Osservare il chip al microscopio mentre si estrae i supporti e quindi interrompere l'estrazione quando il chip è sigillato. La sigillazione dei trucili dovrebbe essere ovvia poiché una parte delle cellule verrebbe schiacciata dalle microstrutture.
- Collegare l'unità di rilevamento della temperatura dell'incubatrice sul palco alla piastra a 3 pozze tazzini e impostarla a 37 gradi centigradi.
- Identificare che i componenti dettagliati del supporto piastra 3-po sono in ordine, come in Figura 2. Ognuno dei tre pozzi sono identici e indipendenti, con un paio di canali di gas per ogni pozzo. Ogni pozzo possiede un portapiatti a gas permeabile, un supporto per chip PDMS, un supporto per finestre di vetro e un paio di finestre di vetro da 35 mm. Questi componenti possono essere assemblati utilizzando le viti montate.
4. Imaging time-lapse a cella singola
- Configurare il software di imaging utilizzando un microscopio invertito per l'acquisizione di immagini time-lapse. Si noti che per un esperimento EA è necessario un microscopio fluorescente invertito con stadio x-y completamente motorizzato, manopola di messa a fuoco, otturatore e cubo del filtro.
- Configura il software per acquisire immagini su due canali con ingrandimento 10 volte superiore per ogni chip con cucitura automatica delle immagini dopo un round di messa a fuoco automatica. Tieni presente che i sistemi di correzione automatica come Perfect Focus non garantiscono una qualità dell'immagine soddisfacente. Si consiglia di generare una superficie di messa a fuoco personalizzata per l'acquisizione di immagini a lungo termine in base alla messa a fuoco automatica o manuale sul chip.
- Prendere immagini ogni ora e lasciare esperimento in esecuzione sulla scala cronologica di settimane. Monitorare la qualità dell'immagine su base giornaliera e aggiornare la superficie di messa a fuoco, se necessario.
- Preparare il chip PDMS e la parabola di coltura permeabile a gas per la successiva analisi immunofluorescente, come descritto in precedenza13.
5. Elaborazione e analisi delle immagini
- Elaborazione post-sperimentale
- Converti le immagini in formato TIFF per l'elaborazione delle immagini e le misurazioni utilizzando Fiji/ImageJ.
- Comprimere i file TIFF per facilitare un'ulteriore elaborazione delle immagini.
- Analisi Fiji/ImageJ
- Per identificare le cellule, eseguire La sottrazione di sfondo e l'analisi delle particelle per identificare i punti luminosi fluorescenti per il rilevamento della posizione delle celle e il conteggio automatico delle celle.
- Utilizza i plugin (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) per analizzare la motilità e la migrazione delle cellule.
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Representative Results
Convalida della crescita cellulare ottimale sul chip
Uno degli obiettivi principali della piattaforma sperimentale è quello di riprodurre i componenti e le interazioni chiave in un microambiente tumorale complesso in modo completo, ma abbastanza semplice da fornire dati quantitativi, affidabili e riproducibili. Questo obiettivo può essere raggiunto solo se abbiamo il pieno controllo dei fattori ambientali fisici e biochimici. Dobbiamo escludere i fattori indesiderati o trovare un modo per incorporare i fattori incontrollabili nel modello quantitativo per interpretare correttamente i comportamenti della popolazione.
Il primo test è quello di garantire la crescita ottimale delle cellule sul dispositivo. Il tasso di proliferazione cellulare sul dispositivo deve essere identico o paragonabile al loro profilo di crescita nella coltura cellulare convenzionale. Come prova di principio, le cellule PC3 della linea cellulare del cancro della prostata umana sono state coltivate nel chip PDMS senza la presenza di stress esterno. Queste cellule sono state etichettate fluorescente nel citoplasma in modo da poter osservare e quantificare la popolazione di cellule utilizzando la microscopia fluorescente invertita. La confluenza delle cellule, definita come l'area coperta dalle cellule, è stata misurata in ogni microhabitat in diversi intervalli di tempo data una soglia di intensità selezionata sulle immagini fluorescenti utilizzando Fiji15. Le curve di crescita delle celle in ogni posizione scelta vengono tracciate nella Figura 4. Le posizioni scelte sono sparse in tutto il chip, dalla regione vicino all'apice dell'afflusso di supporti all'apice vicino ai media.
Le curve di crescita nella Figura 4B sono ben allineate, suggerendo l'identicità del profilo di proliferazione cellulare in funzione della posizione attraverso il chip. La pendenza iniziale delle curve rivela il tasso di proliferazione. Il tempo di raddoppio per le celle nel dispositivo è di circa 24 ore, come illustrato nella Figura 4B dal tempo 0 alle 24 ore, che è lo stesso del tempo di raddoppio in colture convenzionali13. Pertanto, concludiamo che senza la presenza di una fonte esterna di stress, i fattori fisici e biochimici sono distribuiti uniformemente, portando alla crescita cellulare omogenea e ottimizzata da 50 a 100 ore.
Abbiamo inoltre considerato la capacità di quantificare le dinamiche cellulari tra le sottopopolazioni in un microambiente. PC3-EMT che esprime GFP e le linee cellulari PC3-EPI che esprimono mCherry sono state co-coltivate nell'EA, come illustrato nella Figura 5. La confluenza cellulare, definita come la percentuale di superficie coperta dalle cellule, viene misurata come indicazione delle dimensioni della popolazione. A partire dalla confluenza del 40%, la co-cultura è cresciuta completamente confluente entro 3 giorni. È interessante notare che possiamo osservare la progressione di ogni fenotipo nel microambiente. Mentre la curva di crescita della confluenza totale è sotto forma di modello di crescita logistica, la popolazione di PC3-EMT ha continuato ad espandersi e PC3-EPI è stata soppressa nella fase asintotica.
Dimostrazione di test sulla motilità cellulare in una popolazione mista
La motilità cellulare è un importante comportamento fenotipico. La distribuzione di motilità di una popolazione può fornire informazioni sull'interazione fisica delle cellule, sulle proprietà meccaniche del microambiente locale e talvolta può essere analizzata come indicazione della variazione epigenetica delle cellule. Dato che la nostra piattaforma di coltura cellulare migliorata consente l'imaging quasi continuo, il vantaggio di avere una risoluzione temporale fine massimizza il potenziale di tracciamento di singole cellule in una popolazione eterogenea.
Usiamo il plugin TrackMate16 in Fiji (http://fiji.sc) con macro personalizzata per implementare e automatizzare il processo di monitoraggio. TrackMate consente all'utente di implementare e personalizzare un algoritmo di tracciamento utilizzando un linguaggio di scripting da Fiji Script Editor. Il processo di tracciamento è suddiviso in una serie di passaggi: i processi di segmentazione, filtraggio e collegamento delle particelle.
Come mostrato nella Figura 6B, abbiamo eseguito un "saggio di guarigione delle ferite" come dimostrazione per studiare la migrazione collettiva cellulare e l'interazione cellula-cellule. Le cellule PC3-EPI e PC3-EMT erano densamente semiate al centro del dispositivo e potevano migrare liberamente verso una regione vuota. L'istogramma normalizzato della velocità di entrambi i fenotipi è tracciato nella figura 6C. La velocità del PC3-EMT era significativamente superiore a PC3-EPI di un fattore di 1,8x, il che è coerente con il fatto che il fenotipo mesenchymal serve come componente della guarigione della ferita cutanea con eccezionale capacità di migrare rispetto al fenotipo epiteliale stazionario.
Inoltre, al fine di osservare la progressione della motilità cellulare in un ambiente privo di stress, abbiamo eseguito una co-cultura a lungo termine di PC3-EPI e PC3-EMT con una densità di semina iniziale uniforme e monitorato la distribuzione della velocità cellulare variabile con il tempo. Come mostrato nella Figura 7A, B, dopo 6 giorni di coltura, poiché le cellule hanno raggiunto una maggiore confluenza, le distribuzioni della velocità cellulare per entrambi i fenotipi si sono orientate verso la coda sinistra.
Possiamo confrontare il rapporto tra il numero di PC3-EPI e PC3-EMT in ogni intervallo di classe. Come mostrato nella Figura 7C, indipendentemente dai giorni di coltura o densità delle cellule, PC3-EMT ha dominato la regione ad alta velocità, mentre PC3-EPI occupava la zona a bassa velocità. Anche se la velocità complessiva è diminuita in modo significativo per entrambi i fenotipi, PC3-EMT è rimasto motile ed è stato influenzato meno dall'affollamento del microambiente come mostrato nella Figura 7D. La velocità media di PC3-EPI è scesa intorno al 40%, mentre quella del PC3-EMT è scesa solo del 14%.
Ci sono diversi fattori che possono influenzare la distribuzione della velocità cellulare e la velocità media, come l'affollamento della popolazione. Il monitoraggio e il monitoraggio continuo delle cellule su tutta la sottopopolazione è essenziale per comprendere la progressione del comportamento fenotipica. Ad esempio, se vogliamo quantificare il livello dello stato mesenchymal di una sottopopolazione senza etichetta, sarebbe più informativo acquisire non solo la distribuzione della quantità fisica (ad esempio, la velocità) della sottopopolazione interessata in funzione tempo, ma anche quello di tutto il resto della sottopopolazione coesistente di cellule.
Figura 1: Il chip EA microfluidico a siringa-pompa. (A) Il dispositivo microfluidico ha due prese medie separate, due prese e una porta centrale per la semina cellulare o l'estrazione di un mezzo eccessivo. Si noti che tra le insenature medie e gli array di coltura cellulare, una coppia di canali serpentini che permettono al mezzo di eclacazione con l'atmosfera passata sotto la membrana permeabile a gas. (B) La generazione del gradiente. Le siringhe pompano il mezzo con 0,1 mM di fluoresceina e nessuna fluoresceina rispettivamente nel chip attraverso le 2 prese medie a destra, estratte dal chip a 2 prese medie a sinistra. La concentrazione di fluoresceina è proporzionale all'intensità del segnale di fluorescenza, ed è profilata vicino alle insenature medie /prese a e vicino al centro b. Figura riprodotta con il permesso di Lin et al. 201712. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I componenti della piastra campione 3 pozzo personalizzata. (a) il corpo principale di 3 pozzetto; b) un paio di canali di gas che permettono di pompare l'atmosfera condizionata attraverso il setto all'ingresso dei canali di gas; (c) un O-ring progettato per sigillare lo spazio tra la piastra del pozzo e il piatto di coltura permeabile a gas; (d) il piatto di coltura permeabile a gas di 35 mm; e) il portapiatti; (f) il dispositivo PDMS; (g) i supporti del chip PDMS; (h) le vetrate a doppio strato 35 mm progettate per mantenere l'isolamento termico e prevenire la condensazione dell'acqua; (i) portavela in vetro; (j)pastiglie di riscaldamento; (k) sensore di temperatura; (l) il sigillante adesivo che impedisce al chip di asciugarsi. Figura riprodotta con il permesso di Lin et al. 201712. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La figura schematica dell'installazione sperimentale. La configurazione dell'esperimento, compreso il sistema di alimentazione del gas, la connessione dei canali di gas, la connessione di alimentazione media e il sistema di imaging. Figura riprodotta con il permesso di Lin et al. 201712. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curve di crescita del PC3 nell'EA senza stress. PC3 sono stati coltivati in EA senza la presenza di stress esterno. (A) Modello di EA con etichette di posizione. (B) Curve di crescita del PC3 nelle posizioni scelte in termini di confluenza cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La co-cultura di PC3-EPI e PC3-EMT in EA senza stress. PC3-EPI (rosso) e PC3-EMT (verde) sono stati co-coltivati nell'EA senza la presenza di stress esterno. (A) Sovrapposizione di due canali fluorescenti a t - 0 h. (B) Immagine fluorescente scattata a t - 95 h. (C) Curve di crescita in termini di confluenza cellulare. La confluenza cellulare di ogni tipo di cellula è stata misurata sull'intero chip. Ogni punto dati rappresenta la confluenza media delle celle a 3 punti temporali consecutivi effettuati a intervalli di 15 min. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della confluenza cellulare nei 3 punti temporali consecutivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Saggio di motilità cellulare in una popolazione mista. Dimostrazione delle prestazioni di tracciamento a cella singola in una popolazione mista. (A) Una dimostrazione di come le cellule vengono rilevate dal Laplacian della segmentazione gaussiana (LoG). I cerchi indicano la posizione delle cellule rilevate dall'algoritmo LoG. Le cellule rilevate sono collegate da un fotogramma all'altro in base al problema dell'assegnazione lineare per quantificare la motilità cellulare. ((B)Il "saggio di guarigione delle ferite" dell'esperimento di cocoltura PC3-EPI e PC3-EMT. Le cellule sono state semiate localmente fino al 100% di confluenza con un confine chiaro al centro. Dopo l'installazione del chip EA, le cellule sono state osservate migrare attraverso l'array di microhabitat come indicato dalle frecce bianche. (C) Istogramma normalizzato della motilità cellulare. PC3-EMT è più veloce di PC3-EPI di un fattore di 1.8x. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 5 campioni di esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Il saggio di motilità di una co-cultura a lungo termine di PC3-EPI e PC3-EMT. Co-cultura a lungo termine di PC3-EPI e PC3-EMT con densità di seeding iniziale uniforme. La distribuzione della velocità cellulare varia a seconda del tempo. (A) Distribuzione normalizzata della velocità cellulare il giorno 2. (B) La distribuzione normalizzata della velocità cellulare il giorno 6. (C) Rapporto tra numero di PC3-EPI e PC3-EMT in ogni intervallo di classe. (D) Velocità media di PC3-EPI e PC3-EMT in funzione del tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La coltura cellulare convenzionale è stata sviluppata quasi un secolo fa e rimane il modello preclinico più frequentemente utilizzato nella ricerca biomedica, nonostante la sua comprovata capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro17. I modelli animali offrono la massima rilevanza fisiologica e una ragionevole somiglianza genetica con gli esseri umani, ma sono stati a lungo riconosciuti per avere limitazioni significative nella previsione degli esiti umani18. Tra tutti i modelli preclinici esistenti, i modelli microfluidici canceroprotesi su chip sembrano essere il candidato più promettente per soddisfare il bisogno insoddisfatto della ricerca sul cancro9,19,20. Tuttavia, gli attuali modelli cancero-on-chip non hanno ancora offerto una piattaforma in grado di riprodurre componenti e interazioni chiave per imitare un microambiente tumorale in modo completo, ma abbastanza semplice da fornire dati quantitativi affidabili e riproducibili. I nostri dati rappresentativi dimostrano che la nostra tecnologia di coltura cellulare microfluidica fornisce condizioni fisiche e biochimiche stabili per la coltura cellulare a lungo termine in microambienti eterogenei. Questa piattaforma multifunzionale consente la sofisticata regolazione di un gradiente chimico dipendente dal tempo e la composizione del gas ambientale. La piattaforma è portatile e compatibile con la maggior parte dei microscopi invertiti fluorescenti per l'imaging in tempo reale ad alta risoluzione, che offre informazioni multidimensionali delle cellule in funzione del tempo, tra cui morfologia cellulare, dinamiche della popolazione, cellule motilità e la migrazione cellulare a livello di cellula singola.
Rispetto al nostro precedente lavoro11, notiamo che questo metodo di imballaggio e assemblaggio di sigillazione a pressione per il nostro dispositivo microfluidico consente numerose capacità di esperimento a valle (ad esempio, FACS, estrazione metabolita locale, popolazioni sub-clonali espansione, IF, DNA/RNA FISH, ecc.) complementari alle immagini time-lapse scattate nel corso degli esperimenti. Questa capacità di rimuovere le cellule da luoghi specifici in una coltura eterogenea è un importante progresso rispetto ai dispositivi precedenti, dove la superficie di saltellazione di un chip doveva essere rimossa prima di poter accedere alla coltura11. Inoltre, anche in questo caso, l'atto di rimuovere la copertura ha disturbato significativamente la coltura in modo che non fosse possibile testare localmente le cellule su un unico o pochi livelli di habitat. Tale estrazione localizzata è stata possibile nel nostro caso a causa della natura morbida "risialable" della membrana flessibile permeabile a gas.
Il protocollo presentato prevede diversi passaggi critici. Prima di tutto, per avviare un esperimento a lungo termine con dinamica fluidica stabile, le microbolle devono essere evitate il più possibile. Pertanto, è importante preriscaldare e degas il mezzo di coltura (passaggio 3.4.2) prima di caricare il supporto nelle siringhe. La manipolazione del carico e dell'erogazione dei supporti deve essere eseguita lentamente e delicatamente per evitare la formazione di bolle. Il modello PDMS deve essere trattato con plasma di ossigeno (passaggio 3.4.3) prima di connettersi al sistema di alimentazione dei mezzi di coltura. Il trattamento del plasma di ossigeno garantisce l'idrofilia della superficie del PDMS e riduce significativamente la possibilità di intrappolamento delle microbolle. Nel passaggio 3.4.7., quando si posiziona il chip sulla parte superiore della membrana di coltura cellulare, il chip PDMS deve avvicinarsi alla superficie liquida con un angolo di inclinazione di 15 gradi per sbarazzarsi delle bolle (se presenti) sulla superficie liquida all'interno del piatto di coltura. In secondo luogo, il metodo di sigillamento della pressione richiede un sistema di approvvigionamento di gas stabile che pressurizza la membrana di coltura cellulare. La pressione deve essere impostata tra 0,2 e 0,6 psi. Pressione inferiore a 0,2 psi non è sufficiente per la sigillazione del chip. Al di sopra di 1,2 psi, una quantità significativa di gas permeerebbe attraverso la membrana e genererebbe bolle all'interno del modello microfluidico. Notiamo che se i componenti della piastra metallica 3-well non sono assemblati correttamente (compreso il corpo della piastra, il supporto per piatti a gas permeabile, un supporto per chip PDMS, un supporto per finestre di vetro, anelli O e un paio di finestre di vetro da 35 mm), si identificherebbero le perdite di gas come la lettura della pressione sarebbe irriadatta all'aumento del flusso di gas. Il problema di perdita può essere risolto semplicemente facendo un test di perdita e quindi riassemblando i componenti.
La principale forma di dati acquisiti con l'utilizzo della tecnologia EA è attraverso l'imaging. Come accennato in precedenza, la tecnologia EA può essere installata su qualsiasi microscopio invertito. Tuttavia, per sfruttare appieno i vantaggi del sistema, si consiglia vivamente di installare il sistema su un microscopio fluorescente invertito dotato di fase x-y completamente motorizzato, manopola di messa a fuoco motorizzata, otturatore motorizzato e cubo filtro motorizzato. Inoltre, tieni presente che Perfect Focus potrebbe non garantire una qualità dell'immagine soddisfacente. Si consiglia di utilizzare un software di imaging che consente l'acquisizione di immagini multidimensionali e script di imaging personalizzati. Mantenere le immagini ben focalizzate potrebbe essere impegnativo senza un comando di messa a fuoco automatica periodica (ogni 24 ore o 48 ore), che ha generato una superficie di messa a fuoco personalizzata durante il ciclo di acquisizione delle immagini.
La tecnologia EA microfluidica presentata è stata implementata per studiare le dinamiche di adattamento ed evoluzione nelle metapopolazioni cellulari del cancro della prostata sotto un paesaggio chemioterapico di stress12. Abbiamo anche dimostrato l'emergere di cellule tumorali giganti poliploidi resistenti ai farmaci in questa microecologia eterogenea simile al tumore, dimostrando che l'eterogeneità ambientale combinata con la migrazione cellulare all'interno della popolazione tumorale causerebbe amplificazione sull'emergere di fenotipi resistenti13. Con la capacità di controllare e monitorare i comportamenti delle popolazioni di cellule tumorali miste sotto gradienti di stress ben controllati, la nostra tecnologia Microfluidica EA può anche servire come piattaforma per studiare i meccanismi regolatori e la trasformazione fenomenotica coinvolta in EMT nel contesto delle strategie terapeutiche contro il cancro21. Infine, ma non meno importante, il metodo di imballaggio di sigillamento a pressione presentato può essere implementato anche in altri sistemi microfluidici che richiedono la sofisticata regolazione della composizione del gas ambientale e le capacità di esperimento a valle. Ad esempio, lo stesso metodo di imballaggio è stato utilizzato per incorporare diversi modelli microfluidici per studiare come le onde della popolazione batterica si propagano attraverso le barriere fisiche22.
In sintesi, le dinamiche collettive della popolazione sono qualitativamente diverse dai comportamenti monocellulari. La tecnologia Microfluidica EA consente lo studio quantitativo delle dinamiche evolutive e dei comportamenti fenotipici individualmente e collettivamente in funzione del tempo. Questa tecnologia può presentare un modello in vitro più fisiologicamente rilevante per la ricerca sul cancro e potenzialmente per lo sviluppo e lo screening di farmaci preclinici.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
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