Summary
우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.
Abstract
기존의 세포 배양은 암에서 임상 결과를 예측하는 입증된 제한된 능력에도 불구하고 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있습니다. 미세 유체 암 온 칩 모델은 지나치게 단순화된 기존의 2D 배양과 보다 복잡한 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 제안되었으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 결과를 생성하는 능력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 포괄적인 방식으로 복잡한 종양 미세 환경의 중요한 분대를 재현하는 microfluidic 암 온 칩 모형을 제시하고, 그러나 암 역학의 강력한 양적 설명을 제공하기 위하여 충분히 간단합니다. 이 미세 유체 암 온 칩 모델, "진화 가속기," 이질적인 화학 요법 스트레스 풍경을 생성 하는 동안 종양 미세 환경의 상호 연결 된 배열으로 암 세포의 큰 인구를 분해. 약물 구배에 반응하는 암의 진행 및 진화 역학은 몇 주 동안 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 수많은 다운스트림 실험은 실험 과정을 통해 촬영된 시간 경과 이미지에 상보적으로 수행될 수 있다.
Introduction
암은 돌연변이 된 세포 집단의 지속적인 dysregulation뿐만 아니라 암세포와 숙주 미세 환경 사이의 중요한 상호 작용에 의존하는 복잡한 생태계로 점점 인식되고 있습니다. 이러한 의미에서, 암은 다양한 숙주 세포와의 이기종 종양 미세 환경 및 누화를 포함한 요인의 조합에 의해 나타나는 적응형 풍경에서 진화하며, 이 모두는 추가 유전적 또는 또는 후성 유전학 변경1,2,3. 고형 종양의 맥락에서, 화학요법 및 그밖 자원 구배의 고르지 않은 분포는 그들의 분자 이질성에 기여하고 약 저항의 발달에 있는 역할을 할 수 있습니다, 특정 종양에 증가한 혈관 신생 하위 인구, 심지어 전이4,5,6. 기존의 시험관 내 2D 세포 배양 연구는 대규모의 편리한 실험 능력을 유지하면서 평균 필드, 균일 및 고정 조건을 제공하며, 종종 진정으로 필요한 정확한 공간 및 시간적 환경 제어가 부족합니다. 생체 내 종양 역학에 에뮬레이트합니다. 따라서, 역학 적 스트레스 내에서 약물에 대한 반응뿐만 아니라 암 진행의 더 나은 예측을 위해 약물 개발 파이프 라인에서 동물 모델 이전에 종양 미세 환경을 재현하는 보다 대표적인 ex vivo 모델에 대한 필요성이 있다. 풍경. 미세유체학은 제어 가능한 정량적연구를지원하지 못할 수 있는 2D 세포 배양 연구와 보다 복잡한 생체내 동물 연구 사이의 격차를 해소하기 위해7,8,9로제안되었다.
암 세포 역학을 특성화하는 이상적인 시험관 내 시스템은 종양에서 일어날 수 있는 적응형 세포 반응을 모방하는 이기종 미세 환경을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 역학의 관찰을 허용해야 합니다. 단일 셀 해상도. 이 기사에서는, 우리는 미세 유체 세포 배양 플랫폼, "진화 가속기"라는 PDMS 기반 장치를 설명 (EA), 즉 세포 해상도에서 암 세포 역학의 병렬 체외 연구를 허용 하는 실시간 데이터 수집 몇 주 동안, 문화 풍경에 걸쳐 스트레스의 그라데이션을 안정적으로 유지하면서. 이 플랫폼의 디자인은 메타 인구에서 유기체의 진화 역학을10,11가속화 할 수있는 우리의 이전 작업을 기반으로합니다. 특히, 공간적으로 분리된 집단의 그룹에서 어느 정도 상호작용하는 이질적인 응력 풍경에 노출될 때, 가장 적합한 종은 큰 균일한 집단에 비해 지역 집단에서 더 빨리 지배할 수 있다. 유리한 종은 자원과 공간을 찾기 위해 이웃 의 미생물 서식지로 이동하고, 결국 전체 인구를 지배. 도 1에도시된 바와 같이, 미세유체 EA 칩의 패턴은 (i) 한 쌍의 서펜타인 채널로 구성되어 신선한 배지 순환을 제공하고 화학적 확산을 위한 고정 경계 조건을 구성하고, (ii) 육각형 세포 배양 영역을 구성한다. 109 개의 상호 연결된 육각형 과 24 개의 반 육각 형 챔버가 중앙에 들어 있으며 벌집 구조를 닮았습니다. 칩의 깊이는 100 μm입니다. 미디어 채널 및 세포 배양 영역은 작은 슬릿 (약 15 μm 폭)과 연결되어 직접 적인 배지 흐름과 세포 배양 영역 전반에 걸친 전단 응을 방지하면서도 화학 물질이 작은 슬릿을 통해 확산되고 영양소를 교환 할 수 있습니다. 신진 대사 폐기물 등 화학 그라데이션의 생성은 한 매체 채널이 플루오레세인의 0.1 mM을 포함하고 다른 채널에는 불소가 없는 경우 그림 1B에서입증됩니다. 세포는 가스 투과성 멤브레인상에서 배양되고, 칩에 대한 멤브레인에 대한 양압을 통해 미세 구조에 의해 캡슐화된다. 장치 홀더의 구성 요소는 그림 2에도시되어 있으며, 실험 설정은 도 3에도시되어 있으며, 여기서 배양은 37 °C의 반전된 현미경상에서 유지되고, 상대 습도가 85% 이상이며, 아래 조건부로 조절됩니다. 노르목시아 가스 조성.
이 시스템은 브라이트필드 및 형광 채널을 통해 국부적인 세포 상호 작용에 대한 상세한 관찰을 제공하며 면역 형광, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석과 같은 공간적으로 해결된 하류 분석법을 허용합니다. 우리는 이전에 상피 및 중간엽 PC3 전립선 암 세포(12)의 장기 공동 배양뿐만 아니라 약물 내성 폴리 플로이드 거인의 출현에 대한 이 미세 유체 암 온 칩 모델의 원리 증명으로 입증되었습니다. 상피 PC3세포주(13)를이용한 암세포. 우리는 도세탁셀의 스트레스 구배하에서 상피 PC3 및 중간엽 전립선 암 세포의 시공간 역학을 이해하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램을 제시하는 동안, 미세 유체 시스템은 세포주 조합의 모든 조합에 쉽게 적용 될 수있다 및 자원 (즉, 약물, 영양소, 산소) 그라데이션.
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Protocol
1. 미세 유체 장치의 제조
- 레이아웃 설계 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 유체 패턴을 생성합니다(보충 재료참조).
- 포토 마스크를 제작합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 레이저 라이터를 활용하여 100 nm의 Cr과 500 nm의 포토 레지스트 AZ1518로 코팅 된 소다 라임 유리 판에 패턴을 작성합니다.
- 60s에 대한 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.
- Cr-7 크롬 에찬트(Cr-7 크롬 에찬트)를 사용하여 포토레지스트로부터 보호하지 않고 크롬을 에칭합니다.
- 70°C에서 포토레지스트 스트리퍼를 사용하여 잔류 포토레지스트를 45분 동안 제거합니다.
- 포토레지스트 패턴을 패턴화합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 HMDS를 스핀 코트.
- 40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 스핀 코트 포토 레지던트 AZ4330.
- 실리콘 웨이퍼를 95°C에서 60s로 부드럽게 굽습니다.
- 마스크 얼라이너를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 UV를 노출시다.
- 4 분 동안 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.
- DRIE 에칭을 수행합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 100 μm 깊이의 실리콘 딥 반응성 이온 에칭(DRIE) 시스템을 사용하여 포토레지스트로 패턴처리된 웨이퍼를 드라이 에칭.
- 플라즈마 에칭으로 아세톤과 플라즈마 에칭으로 포토레지스트를 제거합니다.
- 웨이퍼 산화 및 실란화. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 1100 °C에서 1시간 동안 용광로에서 에칭된 실리콘 웨이퍼에 열 산화를 수행합니다.
- 실리콘 웨이퍼가 식을 때까지 기다린 다음 웨이퍼를 트리클로로-1H,1H,2H,2H-2H-2H-perfluorooctyl-silane(PFOTS) 몇 방울로 웨이퍼 근처의 작은 용기에 떨어뜨리는 데시케이터에 넣습니다.
- 건조기의 압력을 실온에서 0.5 atm로 60 분 동안 펌핑합니다. 실리콘 웨이퍼 금형은 적절한 실란화 후 소수성이되어야하며, 웨이퍼에 여러 방울의 물을 추가하여 테스트 할 수 있습니다.
- 부드러운 리소그래피. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 프리 폴리머와 크로스 링커(폴리메틸실록산(PDMS) 키트를 10:1 중량 비율로 혼합합니다.
- 혼합 PDMS를 부어 10mm 높이의 필름을 실란화 실리콘 웨이퍼 몰드에 만듭니다.
- 생성된 PDMS-실리콘 웨이퍼 시스템을 30분 내지 1시간 동안 건조기에서 탈기한다.
- PDMS-실리콘 웨이퍼를 70°C 인큐베이터에서 밤새 배양하여 PDMS를 경화한다.
- PDMS가 경화되면 PDMS 필름을 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 벗깁니다.
- 생검 바늘을 사용하여 PDMS의 패턴 위치에 따라 입구 포트에서 구멍을 뚫고 원형 펀치를 사용하여 직경 27mm의 칩을 절단합니다.
- PDMS 층 접합.
- 27mm PDMS 실린더의 두 스택 (패터닝없이)을 가열하여 장치의 저장소 층과 캡핑 층이됩니다.
- 저수지 층의 입구 주위에 두 개의 7mm 원을 잘라 내고 생검 바늘을 사용하여 캡핑 층의 입구 포트에서 관통 구멍을 펀치합니다.
- PDMS의 세 스택을 결합 (패턴 스택, 저수지 층, 캡핑 층) 산소 플라즈마 처리와.
- 생검 바늘로 콘센트와 장치의 중앙 포트에서 구멍을 뚫습니다.
2. 미디어 및 세포주 준비
- PC3-EMT 및 PC3-EPI를 포함한 PC3 세포주 배양용 배지를 준비합니다: RPMI 1640 배지와 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 항생제 항마이코제를 혼합합니다. 앞서 설명한 대로 세포주를생성합니다(14)
참고: PC3 세포주들은 37°C에서 5%CO2로가습된 인큐베이터에서 상기 매질에서 유지된다. 세포와 하위 배양을 분할 3 일, 그들은 에 도달하기 전에 100% 합류. - 종시질 표지형 형광 마커를 가진 트랜스펙트 세포주,앞서12일설명한 바와 같이, PC3-EMT는 세포질 GFP를 표현하고 PC3-EPI는 세포질 mCherry를 표현한다. 이 기술은 또한 모든 형광 표지 세포뿐만 아니라 표지되지 않은 세포의 밝은 필드 이미징과 도 호환됩니다.
3. 실험 설정
- 금속 판 홀더 의 제조
- 가공 또는 3D 프린팅을 통해 병렬 실험을 위해 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 3D CAD 파일("3웰 플레이트. FCStd")는 GitHub에서 참조(https://github.com/kechihl/3-well-plate)로 찾을 수 있습니다.
- 드라이버로 홀더의 구성 요소를 풀습니다(그림2). 자외선 노출을 통해 성분을 최소 1시간 동안 소독하고 멸균 된 환경에 둡니다.
참고: 홀더는 공기 흐름을 허용하는 가스 채널 입구와 함께 열 평형 및 이상적인 가스 조성에 대한 실질적인 조건을 제공하도록 설계되었습니다. 자세한 내용은 전작12에서확인할 수 있습니다. - 세포 배양 막이 상대적으로 유연하다는 3 개의 가스 투과성 배양 접시를 준비합니다.
- 세포주 시딩
- 실험 시작 24시간 전에, 5분 동안 트립시네이징으로 PC3-EPI 및 PC3-EMT 세포를 수확합니다.
- 각 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 세포를 혈전계를 사용하여 카운트하고 각 가스 투과성 배양 접시에 대해 각 세포 유형의 총 2.5 x 104를 분리합니다.
- 2 mL의 배양 배지에서 두 세포 유형을 혼합하고 재중단하고 각각의 가스 투과성 배양 접시에 세포를 시드한다.
- 세포가 부착할 수 있도록 전체 플레이트 홀더를 밤새 인큐베이터에 둡니다.
- 적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다.
- 열 제어 장치 및 가스 공급 시스템 설정
- 그림 3에표시된 것처럼CO2 및O2 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 및 압력 게이지 3개로 구성된 가스 공급 시스템을 설정합니다. 자세한 내용은 전작12에서확인할 수 있습니다.
- CO 2 및 N 2탱크 및O2 소스로부터 가스의 혼합 속도를 조정하도록 CO2 및O2 제어 유닛을 설정합니다. 또는 노르목시아 조건하에서 가스를 공급하는 모든 가스 공급 시스템이 작동합니다.
- 상대 습도가 최대 85%(상대 습도 모니터에서 판독)되도록 혼합 챔버에 결합되어 버블러에 의해 가습되는 가스가 압력 게이지가 있는 3개의 독립적인 가스 밸브로 연결되는지 확인하십시오. 제어 하고 플레이트 홀더의 가스 유량을 모니터링합니다.
- 전체 플레이트 홀더를 뚜껑과 바닥 판에 별도의 가열 하위 장치가 있는 단계 의 인큐베이션 열 제어 장치에 놓고 모든 장치를 37°C로 설정합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 미세 유체 장치의 설치. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 그림 2와같이 3웰 플레이트 홀더의 상세 구성 요소가 순서대로 되어 있는지 확인합니다. 세 개의 우물은 각각 동일하고 독립적이며, 각 우물에 대한 가스 채널 쌍이 있습니다. 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35mm 유리 창 쌍을 보유하고 있습니다. 이러한 구성 요소는 장착 된 나사를 사용하여 조립 할 수 있습니다.
참고: 유리 창은 가스 투과성 배양 멤브레인과 웰 사이에 열 절연 공간이 있는지 확인하여 인터페이스의 온도 차이로 인해 물 결로가 발생하지 않도록 합니다. 3개의 웰은 독립적이며 3개의 실험을 별도로 수행할 수 있습니다. - 37°C에서 예온 배양배지를 20분 동안 진공 챔버에서 탈기하였다.
- 친수성을 유지하기 위해 30s의 산소 플라즈마 시스템을 사용하여 PDMS 칩을 치료하십시오.
- 주사기 시스템을 설정합니다. 성장 매체와 관심의 원하는 시약 (미디어, 약물이있는 매체 등)으로 두 개의 주사기를 천천히로드하십시오. 각 개별 주사기를 50cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입합니다.
- 튜브를 프라이밍하고 강철 핀을 캡핑 층을 통해 각 PDMS 칩에 삽입합니다. 저장소 층을 채우고 PDMS 패턴 레이어 패턴을 용지로 적시다. 저수지 층은 온칩 버블 트랩으로 작동하여 기포가 미세 유체 패턴으로 들어가는 것을 방지합니다.
- 배양 배지로 1mL 주사기를 로드합니다. 주사기를 5cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입하고 튜브를 프라이밍합니다.
- 칩 의 중앙 구멍에 중공 강철 핀을 삽입하여 칩 밀봉 공정 중에 나중에 칩에서 과도한 용지를 추출할 수 있습니다.
- 각 PDMS 장치에는 주사기 펌프에 적재된 4개의 10mL 주사기가 필요하므로 전방 데크에 칩당 2개의 10mL 주사기를 적재합니다. 다른 두 주사기를 주사기 시스템의 인출 데크에 놓습니다.
- 가스 투과성 배양 막 위에 칩을 직접 놓습니다 (세포가 이미 멤브레인에 부착된 경우). 미세 유체 패턴에 마이크로 버블이 갇히지 않도록 하기 위해 조립 전에 35mm 가스 투과성 배양 접시에 미리 따뜻해지고 탈기된 매체 1mL를 분배한 다음 칩이 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근하는지 확인하십시오.
- PDMS 칩 홀더를 아래쪽으로 밀어 내면서 각 칩에 대한 가스 투과성 배양 접시 홀더와 우물의 가스 투과성 배양 접시를 클램프합니다.
- 칩이 마르지 않도록 PDMS 장치 위에 실러 시트를 테이프로 고정하고 PDMS 칩 홀더로 클램프합니다.
- 어레이 주변의 미디어 유량을 20μL/h로 설정합니다.
- 반전 된 현미경의 전동 단계에 무대 인큐베이터에서 전체 플레이트를 설정합니다. 가스 공급 시스템을 가스 채널에 연결하고 설치된 PDMS 칩에 대해 가스 투과성 배양 막을 가압하여 장치의 밀봉을 보장합니다. 0.2 psi (1.4 x 104 Pa)에서 게이지 압력을 유지합니다.
- 중앙 구멍에서 1 mL 주사기를 사용하여 칩에서 과도한 매체를 천천히 추출합니다. 매체를 추출하는 동안 현미경 으로 칩을 관찰한 다음 칩이 밀봉되면 추출을 중지합니다. 칩 밀봉은 세포의 일부가 미세 구조에 의해 분쇄될 것이기 때문에 명백해야 한다.
- 온스테이지 인큐베이터의 온도 감지 장치를 3웰 플레이트에 연결하고 37°C로 설정합니다.
- 그림 2와같이 3웰 플레이트 홀더의 상세 구성 요소가 순서대로 되어 있는지 확인합니다. 세 개의 우물은 각각 동일하고 독립적이며, 각 우물에 대한 가스 채널 쌍이 있습니다. 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35mm 유리 창 쌍을 보유하고 있습니다. 이러한 구성 요소는 장착 된 나사를 사용하여 조립 할 수 있습니다.
4. 단세포 시간 경과 화상 진찰
- 역현미경을 활용하여 타임랩스 이미지 수집을 위한 이미징 소프트웨어를 설정합니다. EA 실험에는 완전히 전동된 x-y 단계, 초점 노브, 셔터 및 필터 큐브가 있는 반전형광 현미경이 필요합니다.
- 자동 초점 한 라운드 후 자동 이미지 스티치와 각 칩에 대한 10배 배율로 두 채널에 걸쳐 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 구성합니다. Perfect Focus와 같은 자동 보정 시스템이 만족스러운 이미지 품질을 보장하지는 않습니다. 칩 전체의 자동 초점 또는 수동 포커스를 기반으로 장기적인 이미지 수집을 위해 사용자 지정된 포커스 표면을 생성하는 것이 좋습니다.
- 매시간 이미지를 찍고 실험을 몇 주 단위로 실행합니다. 매일 이미지 품질을 모니터링하고 필요한 경우 초점 표면을 업데이트합니다.
- 앞서13일설명한 바와 같이 후속 면역형광 분석을 위해 PDMS 칩 및 가스 투과성 배양 접시를 준비한다.
5. 이미지 처리 및 분석
- 실험 후 처리
- 피지/ImageJ를 활용하여 이미지 처리 및 측정을 위해 이미지를 TIFF 형식으로 변환합니다.
- TIFF 파일을 압축하여 추가 이미지 처리를 용이하게 합니다.
- 피지/이미지J 분석
- 세포를 식별하려면 배경 빼기 및 입자 분석을 수행하여 세포 위치 감지 및 자동 세포 계수를 위한 형광 밝은 반점을 식별합니다.
- 플러그인 (수동 추적, 화학 요법, 마이그레이션 도구, Trackmate)를 활용하여 세포 운동성 및 마이그레이션을 분석합니다.
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Representative Results
칩에서 최적의 세포 성장 검증
실험 플랫폼의 주요 목표는 복잡한 종양 미세 환경에서 중요한 구성 요소 와 상호 작용을 포괄적으로 재현하면서도 정량적이고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 제공하기에 충분합니다. 이 목표는 우리가 물리적 및 생화학적 환경 요인을 완전히 통제할 수 있는 경우에만 달성할 수 있습니다. 우리는 원하지 않는 요인을 배제하거나 모집단 행동을 올바르게 해석하기 위해 통제할 수 없는 요소를 정량적 모델에 통합하는 방법을 찾아야 합니다.
첫 번째 테스트는 장치에서 최적의 세포 성장을 보장하는 것입니다. 장치에 대한 세포 증식 속도는 종래의 세포 배양에서 그들의 성장 프로필과 동일하거나 비교할 필요가 있다. 원리의 증거로서, 인간 전립선암 세포주 PC3 세포는 외부 스트레스의 존재 없이 PDMS 칩에서 배양하였다. 이 세포는 세포질에서 형광 표지되었기 때문에 우리는 반전된 형광 현미경 검사법을 사용하여 세포의 집단을 관찰하고 정량화할 수 있었습니다. 세포에 의해 커버되는 영역으로 정의된 세포 합류는, 피지15를사용하여 형광 영상에 선택된 강도 임계값을 주어진 상이한 시간 프레임에서 각 마이크로서식지에서 측정하였다. 선택한 각 위치에서 셀의 성장 곡선은 그림 4에플롯됩니다. 선택한 위치는 미디어 유입의 정점 근처의 영역에서 미디어 콘센트에 가까운 정점에 이르기까지 칩 전체에 흩어져 있습니다.
도 4B의 성장 곡선은 잘 정렬되어, 칩 전반에 걸친 위치의 함수로서 세포 증식 프로파일의 동일성을 시사한다. 곡선의 초기 기울기는 증식 속도를 나타냅니다. 장치 내의 세포에 대한 두 배의 시간은 도 4B에 도시된 바와 같이 약 24시간 시간0 부터 24시간까지이며, 이는 종래의 배양웨어(13)에서 두 배의 시간과 동일하다. 따라서 외부 스트레스 원천이 없으면 물리적 및 생화학적 요인이 균일하게 분포되어 50시간에서 100시간까지 균질하고 최적화된 세포 성장을 이끌어냅니다.
우리는 또한 미세 환경에서 하위 집단 사이의 세포 역학을 정량화하는 능력을 고려했습니다. GFP 발현 PC3-EMT 및 mCherry 발현 PC3-EPI 세포주도 도 5에도시된 바와 같이 EA에서 공동 배양되었다. 세포에 의해 커버되는 지역의 백분율로 정의된 세포 합류는, 인구의 크기의 표시로 측정됩니다. 40% 합류에서 시작하여, 공동 문화는 3 일 안에 완전히 수렴되었습니다. 흥미롭게도, 우리는 미세 환경에서 각 표현형의 진행을 관찰 할 수있다. 총 합류의 성장 곡선은 물류 성장 모델의 형태로, PC3-EMT의 인구는 확장을 계속하고 PC3-EPI는 점근 단계에서 억제되었다.
혼합 인구에서 세포 운동성 분석의 데모
세포 운동성은 중요한 자형질 행동입니다. 집단의 운동성 분포는 세포의 물리적 상호 작용, 국소 미세 환경의 기계적 특성에 대한 정보를 제공할 수 있으며 때로는 세포의 후생 유전학적 변이의 표시로 분석 될 수 있습니다. 우리의 향상된 세포 배양 플랫폼이 거의 연속적인 화상 진찰을 허용한다는 것을 감안할 때, 미세한 시간 적 해결책을 갖는 이점은 이기종 인구에 있는 단 하나 세포 추적의 잠재력을 최대화합니다.
우리는 구현하고 추적 프로세스를 자동화하기 위해 사용자 정의 매크로피지 (http://fiji.sc)의 플러그인 TrackMate16을 사용합니다. TrackMate를 사용하면 사용자가 피지 스크립트 편집기의 스크립팅 언어를 사용하여 추적 알고리즘을 구현하고 사용자 정의 할 수 있습니다. 추적 프로세스는 세분화, 필터링 및 파티클 연결 프로세스와 같은 일련의 단계로 나뉩니다.
도 6B에나타낸 바와 같이, 세포 집단 이동 및 세포-세포 상호작용을 연구하기 위한 시연으로서 "상처 치유 분석"을 수행했다. PC3-EPI 및 PC3-EMT 셀은 장치의 중앙에 조밀하게 시드되었고 빈 영역으로 자유롭게 마이그레이션할 수 있었습니다. 두 표현형의 속도의 정규화 된 히스토그램은 그림 6C에서플롯됩니다. PC3-EMT의 속도는 1.8배의 비율로 PC3-EPI보다 훨씬 높았으며, 이는 중간엽 표현형이 비교적 마이그레이션할 수 있는 탁월한 능력을 가진 상처 치유의 구성 요소역할을 한다는 사실과 일치합니다. 고정 상피 표현형.
또한, 스트레스 없는 환경에서 세포 운동성의 진행을 관찰하기 위해, 우리는 균일한 초기 시드 밀도를 가진 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 장기적인 공동 배양을 수행하고 시간에 따라 변화하는 세포 속도의 분포를 추적했습니다. 도 7A,B에도시된 바와 같이, 배양 6일 후, 세포가 더 높은 합류에 도달함에 따라, 두 표현형모두에 대한 세포 속도의 분포는 왼쪽 꼬리쪽으로 기울었다.
각 클래스 간격에서 PC3-EPI와 PC3-EMT의 수를 비교할 수 있습니다. 도7C에도시된 바와 같이, 배양일이나 세포의 밀도에 관계없이 PC3-EMT는 고속 영역을 지배하고 PC3-EPI는 저속 영역을 점유하였다. 전체 속도는 두 표현형 모두에 대해 현저히 감소되었지만, PC3-EMT는 운동성으로 남아 있었고 도 7D에나타난 바와 같이 미세 환경의 혼잡에 의해 덜 영향을 받았다. PC3-EPI의 평균 속도는 약 40% 떨어졌고 PC3-EMT의 속도는 14% 감소했습니다.
세포 속도의 분포와 평균 속도의 분포에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 요인이 있습니다, 이러한 인구의 혼잡과 같은. 모든 하위 집단에 대한 지속적인 세포 추적 및 모니터링은 현상형 행동의 진행을 이해하는 데 필수적입니다. 예를 들어, 레이블이 지정되지 않은 하위 모집단의 중간엽 상태 수준을 정량화하려는 경우 관심 있는 하위 모집단의 물리적 수량(예: 속도)의 분포를 함수로 획득하는 것이 더 유익할 것입니다. 시간뿐만 아니라 세포의 공존 하위 집단의 모든 나머지의.
그림 1: 주사기 펌프 구동 미세 유체 EA 칩. (a)미세 유체 장치에는 두 개의 분리된 매체 입구, 2개의 출구 및 과도한 배지의 세포 파종 또는 추출을 위한 하나의 중앙 포트가 있습니다. 배지 입구와 세포 배양 배열 사이에서, 매체가 가스 투과성 막 의 밑에 통과된 대기와 평형을 허용하는 뱀 채널의 쌍. (B)그라데이션의 생성입니다. 주사기는 각각 0.1 mM의 플루오레세인과 불소가 없는 배지를 오른쪽에 있는 2개의 배지 입구를 통해 칩내로 펌핑하고, 왼쪽에 있는 2개의 중간 출구에서 칩에서 추출한다. 플루오레세인의 농도는 형광 신호의 강도에 비례하며, 중간 입구/출구 a 및 중앙 b. 도면으로부터 허가를 받아 재현된 배지 입구/출구근처에서 프로파일화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 사용자 정의 된 3 웰 샘플 플레이트의 구성 요소. (a)3 웰 플레이트의 본체; (b)조절된 대기가 가스 채널의 입구에서 중혈구를 통해 펌핑되고 배출될 수 있도록 하는 한 쌍의 가스 채널; (c)웰 플레이트와 가스 투과성 배양 접시 사이의 공간을 밀봉하도록 설계된 O-링; (d)직경 35 mm 가스 투과성 배양 접시; (e)접시 홀더; (f)PDMS 장치; (g)PDMS 칩 홀더; (h)열 절연을 유지하고 물 응축을 방지하기 위해 설계된 이중 층 35mm 유리 창; (i)유리 창 홀더; (j)가열 패드; (k)온도 센서; (l)칩이 건조되지 않도록 하는 접착제 실러. 그림 은 Lin 외. 201712의허가를 받아 재현 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 설정의 개략적인 그림입니다. 가스 공급 시스템, 가스 채널 연결, 매체 공급 연결 및 이미징 시스템을 포함하는 실험의 설정. 그림 은 Lin 외. 201712의허가를 받아 재현 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스트레스 없이 EA에서 PC3의 성장 곡선. PC3는 외부 스트레스없이 EA에서 배양되었다. (A)위치 레이블이 있는 EA 패턴입니다. (B)세포 합류 측면에서 선택한 위치에서 PC3의 성장 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 스트레스 없이 EA에서 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 공동 문화. PC3-EPI(적색) 및 PC3-EMT(녹색)는 외부 스트레스없이 EA에서 공동 배양되었다. (a)t =0 h.(B)형광 이미지에서 두 개의 형광 채널의 오버레이는 t = 95 h.(C)세포 합류의 관점에서 성장 곡선. 각 세포 유형의 세포 합류도 전체 칩에서 측정되었다. 각 데이터 포인트는 15분 간격으로 3회 연속 적인 시점에서의 평균 셀 합류를 나타냅니다. 오류 막대는 3개의 연속된 시간 점에서 셀 합류의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 혼합 된 집단에서 세포 운동성 분석. 혼합 된 인구에서 단일 셀 추적 성능의 데모. (A)가우시안(LoG) 분절의 라플락시안에 의해 세포가 검출되는 방법의 데모. 원은 LoG 알고리즘에 의해 검색된 셀의 위치를 나타냅니다. 검출된 셀은 선형 할당 문제에 따라 프레임간 연결되어 셀 운동성을 정량화합니다. (B)PC3-EPI 및 PC3-EMT 공동 배양 실험의 "상처 치유 분석". 세포는 중앙에 명확한 경계를 가진 100% 합류까지 국부적으로 시드되었다. EA 칩을 설치한 후, 백색 화살표로 표시된 바와 같이 세포가 마이크로서식지 어레이를 통해 이동하는 것을 관찰하였다. (C)세포 운동성의 히스토그램을 정규화. PC3-EMT는 PC3-EPI보다 1.8배 더 빠릅니다. 오류 막대는 5개의 실험 샘플의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: PC3-EPI 및 PC3-EMT의 장기 공동 배양에 대한 운동성 분석. 균일한 초기 시드 밀도를 가진 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 장기적인 공동 배양. 셀 속도의 분포는 시간에 따라 다릅니다. (A)2일째에 세포 속도의 정규화된 분포. (B)6일째에 세포 속도의 정규화된 분포. (C)각 클래스 간격에서 PC3-EPI와 PC3-EMT의 수의 비율입니다. (D)시간의 함수로 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 평균 속도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
종래의 세포 배양은 거의 100년 전에 개발되었으며, 암17에서임상 결과를 예측하는 능력이 제한적이라는 입증된 능력에도 불구하고 생물의학 연구에서 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있다. 동물 모델은 인간에게 가장 높은 생리학적 관련성 및 합리적인 유전적 유사성을 제공하지만, 인간의 결과를 예측하는 데 상당한 한계가 있다고 오랫동안 인정되어 왔다18. 기존의 모든 전임상 모델 중에서, 미세유체암-온칩 모델은 암 연구에서 충족되지 않은 요구를충족시키는 가장 유망한 후보로 나타났다9,19,20. 그러나 현재 암 온 칩 모델은 종양 미세 환경을 포괄적으로 모방하는 주요 구성 요소 및 상호 작용을 재현할 수 있는 플랫폼을 아직 제공하지 않았지만 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 데이터를 제공할 수 있을 만큼 간단합니다. 당사의 대표적인 데이터는 당사의 미세 유체 세포 배양 기술이 이기종 미세 환경에서 장기 세포 배양을 위한 안정적인 물리적 및 생화학적 조건을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 다기능 플랫폼은 시간 의존적 화학 그라데이션과 주변 가스 조성의 정교한 조정을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 휴대가 가능하고 고해상도 실시간 이미징을 위한 대부분의 형광 역 현미경과 호환되며, 세포 형태, 집단 역학, 세포 를 포함한 시간의 함수로서 세포의 다차원 정보를 제공합니다. 단일 세포 수준에서 운동성 및 세포 이동.
전작11에비해, 우리는 우리의 미세 유체 장치에 대한이 압력 밀봉 포장 및 조립 방법은 수많은 다운 스트림 실험 용량을 가능하게한다는 점에 유의하십시오 (예를 들어, FACS, 로컬 대사 산물 추출, 하위 클론 인구) 확장, IF, DNA/RNA FISH 등) 실험 과정에서 찍은 시간 경과 이미지에 보완됩니다. 이종 배양에서 특정 위치에서 세포를 제거하는 이러한 능력은 이전 장치에 비해 큰 진보이며, 여기서 칩에 대한 밀봉 표면은 배양에 접근할 수 있기 전에 제거되어야 한다11. 또한, 이 경우에도, 커버를 제거하는 행위는 단일 에서 몇 개의 서식지 수준에서 세포의 국소 시험이 불가능하도록 배양을 현저하게 방해하였다. 이러한 국소 추출은 유연한 가스 투과성 멤브레인의 부드러운 "재밀봉"특성으로 인해 우리의 경우 가능했습니다.
제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 안정적인 유체 역학으로 장기 실험을 시작하려면 마이크로 버블을 가능한 한 피해야 합니다. 따라서, 배지를 주사기에 로딩하기 전에 배양 배지(단계 3.4.2)를 미리 웜 및 탈기하는 것이 중요하다. 미디어 로딩 및 디스펜싱의 조작은 거품 형성을 방지하기 위해 천천히 부드럽게 수행해야합니다. PDMS 패턴은 배양 배지 공급 시스템에 연결하기 전에 산소 플라즈마(단계 3.4.3)로 처리되어야 한다. 산소 플라즈마 처리는 PDMS 표면의 친수성을 보장하고 마이크로 버블 포획의 가능성을 현저히 감소시킵니다. 단계 3.4.7.에서, 세포 배양 막의 상단에 칩을 배치 할 때, PDMS 칩은 배양 접시 내부의 액체 표면에 기포 (있는 경우)를 제거하기 위해 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근해야합니다. 둘째, 압력 밀봉 방법은 세포 배양 막을 가압하는 안정적인 가스 공급 시스템을 필요로 한다. 압력은 0.2 ~ 0.6 psi 사이로 설정되어야 합니다. 0.2psi 보다 낮은 압력은 칩 밀봉에 충분하지 않습니다. 1.2 psi 이상, 상당한 양의 가스가 멤브레인을 통해 침투하여 미세 유체 패턴 내에서 기포를 생성합니다. 금속 3웰 플레이트의 구성 요소가 제대로 조립되지 않은 경우(플레이트 본체, 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더, O-링 및 35mm 유리 창 포함), 가스 누출을 식별할 수 있습니다. 압력 판독은 가스 흐름의 증가에 반응하지 않을 것입니다. 누설 문제는 누출 테스트를 수행한 다음 구성 요소를 다시 어셈블하는 것만으로 해결할 수 있습니다.
EA 기술의 활용과 함께 획득 한 데이터의 주요 형태는 이미징을 통해입니다. 앞서 언급했듯이 EA 기술은 모든 반전된 현미경에 설치할 수 있습니다. 그러나 시스템의 장점을 충분히 활용하려면 완전히 전동식 x-y 스테이지, 전동 초점 노브, 전동 셔터 및 전동 필터 큐브가 장착된 반전형광 현미경에 시스템을 설치하는 것이 좋습니다. 또한 완벽한 포커스가 만족스러운 이미지 품질을 보장하지 않을 수도 있습니다. 다차원 이미지 수집 및 사용자 정의 이미징 스크립트를 허용하는 이미징 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다. 이미지 의 초점을 잘 맞추는 것은 이미지 수집 주기 동안 사용자 정의 초점 표면을 생성 정기적 (매 24 시간 또는 48 시간) 자동 초점 명령없이 어려울 수 있습니다.
제시된 미세유체 EA 기술은 화학적 스트레스경관(12)에서전립선암 세포 메타집단의 적응 및 진화 역학을 연구하기 위해 구현되었다. 우리는 또한 종양 같이 이질적인 마이크로 생태학에 있는 약 저항 polyploid 거대 암 세포의 출현을 설명했습니다, 종양 인구 내의 세포 이동과 결합된 환경 이질성이 증폭을 일으키는 원인이 될 것이라는 것을 보여주는 저항하는 표현형13의출현에 . 잘 통제된 스트레스 구배하에서 혼합 종양 세포 집단의 행동을 제어하고 모니터링할 수 있는 능력으로, 당사의 미세 유체 EA 기술은 규제 메커니즘과 관련된 현상형 변환을 연구하는 플랫폼역할을 할 수도 있습니다. 암 치료 전략의 맥락에서 EMT21. 마지막으로, 제시된 압력 밀봉 포장 방법은 주변 가스 조성뿐만 아니라 다운스트림 실험 용량의 정교한 조정을 필요로 하는 다른 미세 유체 시스템에서도 구현될 수 있습니다. 예를 들어, 동일한 패키징 방법은 세균 집단 파도가 물리적장벽(22)을통해 전파하는 방법을 연구하기 위해 다른 미세 유체 패턴을 통합하는 데 사용되었다.
요약하면, 집단 인구 역학은 단세포 행동에서 질적으로 다릅니다. 미세 유체 EA 기술은 진화 역학 및 현상기 행동의 정량적 연구를 개별적으로 그리고 총체적으로 시간의 함수로 허용합니다. 이 기술은 암 연구를 위한 더 생리적으로 관련있는 시험관내 모형을 제시할 수 있고, 잠재적으로 전임상 약 개발 및 검열을 위한.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF PHY-1659940에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
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