Summary
Vi presenterar en mikroflödessystem cancer-on-chip modell, "evolution Accelerator"-teknik, som ger en kontrollerbar plattform för långsiktiga realtid kvantitativa studier av cancerdynamik inom väl definierade miljöförhållanden på Single-cell Nivå. Denna teknik förväntas fungera som en in vitro-modell för grundforskning eller preklinisk läkemedelsutveckling.
Abstract
Konventionell cellkultur är fortfarande den vanligast förekommande prekliniska modellen, trots dess bevisade begränsade förmåga att förutsäga kliniska resultat i cancer. Microfluidic cancer-on-chip modeller har föreslagits för att överbrygga klyftan mellan förenklad konventionella 2D kulturer och mer komplicerade djurmodeller, som har begränsad förmåga att producera pålitliga och reproducerbara kvantitativa resultat. Här presenterar vi en mikroflödessystem cancer-on-chip modell som återger viktiga komponenter i en komplex tumör mikromiljö på ett omfattande sätt, men är enkel nog att ge robusta kvantitativa beskrivningar av cancerdynamik. Denna mikroflödessystem cancer-on-chip modell, "evolution Accelerator," bryter ner en stor population av cancerceller i en sammanlänkad matris av tumör mikromiljöer samtidigt skapa en heterogen kemoterapeutiska stress landskap. Progressionen och den evolutionära dynamiken av cancer som svar på drogen gradient kan övervakas i veckor i realtid, och många nedströms experiment kan utföras kompletterar de tidsförlopp bilder tagna genom loppet av experimenten.
Introduction
Cancer har blivit alltmer erkänd som ett komplext ekosystem som beror inte bara på fortsatt dysreglering av muterade cellpopulationer utan också på vitala interaktioner mellan cancerceller och värd mikromiljö. I denna mening, cancer utvecklas på ett adaptivt landskap manifesteras genom en kombination av faktorer, inklusive en heterogen tumör mikromiljö och överhörning med en mängd olika värdceller, som alla bidrar selektivt tryck för ytterligare genetiska eller epigenetiska förändringar1,2,3. I samband med solida tumörer, ojämn fördelning av kemoterapeutika och andra resursgradienter bidrar till deras molekylära heterogenitet och kan spela en roll i utvecklingen av läkemedelsresistens, ökad angiogenes till viss tumör subpopulationer, och även metastaser4,5,6. Konventionella in vitro 2D-cellkulturstudier, samtidigt som den besitter storskalig, praktisk experimentell kapacitet, ger ett medelvärde-fält, enhetliga och fasta förhållanden, som ofta saknar den exakta rumsliga och temporala Miljökontrollen som krävs för att verkligen emulera in vivo tumördynamik. Sålunda, det finns ett behov av mer representativa ex vivo modeller för att reproducera tumören mikromiljö före djurmodeller i drogen utveckling pipeline för att en bättre förutsägelse av cancer progression samt svar på läkemedel inom dynamisk stress Landskap. Mikrofluidik har föreslagits för att överbrygga klyftan mellan 2D-cellkulturstudier och mer komplexa in vivo djurstudier som kanske inte kan stödja kontrollerbara kvantitativa studier7,8,9.
Ett idealiskt in vitro-system för att karakterisera cancercelldynamik bör ha förmågan att generera en heterogen mikromiljö för att efterlikna de adaptiva cellulära svar som kan ske i en tumör, samt möjliggöra observation av dessa dynamik på en encells-upplösning. I denna artikel, vi beskriver en mikroflödessystem cellkultur plattform, en PDMS-baserad enhet som kallas "evolution Accelerator" (EA), som möjliggör parallella in vitro-studier av cancer celldynamik på cellulära upplösning med realtid datainsamling över loppet av veckor, medan stabilt upprätthålla gradienter av stress över kulturlandskapet. Utformningen av denna plattform är baserad på vårt tidigare arbete, där den evolutionära dynamiken i organismer i en metapopulation kan påskyndas10,11. Specifikt, i en grupp av rumsligt åtskilda populationer som samverkar på någon nivå, när de utsätts för en heterogen stress landskap, de mest lämpade arter kan dominera i en lokalbefolkning snabbare jämfört med en stor enhetlig befolkning. De fördelaktiga arterna migrerar sedan till angränsande mikrohabitat i sökandet efter resurser och utrymme, och så småningom dominerar hela befolkningen. Som framgår i figur 1, är mönstret av mikroflödessystem EA chip består av (i) ett par Serpentine kanaler som ger färsk Media cirkulation och konstruera fasta gräns förhållanden för kemisk diffusion, och (II) den hexagonala cellkultur regionen som består 109 sammankopplade hexagonala och 24 halv-hexagonala kammare i centrum, som liknar en Honeycomb struktur. Chippet är 100 μm på djupet. Mediekanaler och cellkultur regionen förbinds med små slitsar (ca 15 μm bred), vilket förhindrar direkt media flöde och den resulterande skjuvning stress över cellkultur området, men ändå tillåta kemikalier att sprida sig genom små slitsar och utbyta näringsämnen, metaboliskt avfall etc. Generering av kemiska gradienter visas i figur 1B, där en mediekanal innehåller 0,1 mm fluorescein medan den andra kanalen är fri från fluorescein. Celler odlas på ett gas genomsläppligt membran, inkapslat av mikrostrukturer genom det positiva mottrycket på membranet mot chippet. Komponenterna i enhetshållaren illustreras i figur 2, och den experimentella inställningen illustreras i figur 3, där kulturen upprätthålls på ett inverterat Mikroskop vid 37 ° c, med över 85% relativ fuktighet och konditioneras under normoxia gassammansättning.
Detta system ger detaljerad observation av lokaliserade cellulära interaktioner via brightfield och fluorescerande kanaler och möjliggör rumsligt-lösta nedströms analyser såsom immunofluorescens, Western blot, eller masspektrometri. Vi har tidigare visat som ett proof-of-princip av denna mikroflödessystem cancer-on-chip modell på långsiktig Co-kultur epitelial och mesenkymala PC3 prostatacancerceller12 samt uppkomsten av läkemedelsresistens polyploida jätte cancerceller med hjälp av epitelial PC3 cell linje13. Medan vi presenterar tillämpningen av denna plattform för att förstå den spatiotemporal dynamiken i epitelial PC3 och mesenkymala prostatacancerceller under en stressgradient av docetaxel, den mikroflödessystem systemet kan enkelt appliceras på någon kombination av cellinjer och resurs (dvs., läkemedel, näringsämnen, syre) gradienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av mikroflödessystem enhet
- Generera önskat mikroflödessystem mönster med hjälp av en layout designprogramvara (se kompletterande material).
- Fabricera Photomask. Se tabell över material för mer information.
- Använda en laserskrivare, skriva mönstret på en Soda-kalk glasplatta belagd med 100 nm i CR och 500 Nm i fotoresist AZ1518.
- Utveckla fotoresist med Developer AZ300MIF för 60 s.
- Etch bort krom utan skydd från fotoresist med CR-7 krometant.
- Remsor av resterande fotoresist med en fotoresist strippa vid 70 ° c för 45 min.
- Mönster den photoresist. Se tabell över material för mer information.
- Spin Coat HMDS på kisel wafer på 4000 RPM för 40 s.
- Spin Coat fotoresist AZ4330 på kisel wafer på 4000 RPM för 40 s.
- Mjuk Grädda kisel wafer vid 95 ° c för 60 s.
- Utnyttja masken Aligner att exponera UV till kisel wafer.
- Utveckla fotoresist med utvecklaren AZ300MIF för 4 min.
- Utför DRIE etsning. Se tabell över material för mer information.
- Dry-etch den wafer mönstrad med fotoresist med en kisel djup reaktiv Ion etsning (Drie) system för 100 μm djup.
- Remsor av fotoresist med aceton och plasma etch med en plasma etsare.
- Wafer oxidation och silanization. Se tabell över material för mer information.
- Utför termisk oxidation på den etsade kisel wafer i en ugn vid 1100 ° c i 1 h.
- Vänta tills kisel rånet svalnat och placera sedan rånet i en Exsickator med några droppar trikloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-SILANE (PFOTS) droppat i en liten behållare nära rånet.
- Pumpa trycket från exsickatorn till 0,5 ATM vid rumstemperatur under 60 min. Kisel wafer mögel bör bli hydrofoba efter ordentlig silanisering, som kan testas genom att tillsätta flera droppar vatten på wafer.
- Mjuk litografi. Se tabell över material för mer information.
- Blanda pre-polymer och Cross-Linker (från polymethylsiloxane (PDMS) kit) på en 10:1 i viktförhållande.
- Häll blandade PDMS att skapa en 10 mm film i höjd på silaniseras kisel wafer mögel.
- Degasa den resulterande PDMS-kisel wafer systemet i en exsickator i 30 min till 1 h.
- Inkubera PDMS-kisel wafer i en 70 ° c inkubator över natten för att bota PDMS.
- När PDMS är botad, skala PDMS filmen från kisel wafer noggrant.
- Använda biopsinålar, punch through-hål vid inlopps portarna baserat på placeringen av mönstret på PDMS och anställa en cirkulär Punch att skära marker 27 mm i diameter.
- PDMS skikt bindning.
- Värmebehandla två travar med 27 mm PDMS cylindrar (utan mönstringen), som kommer att bli reservoarskiktet och tak lagret av anordningen.
- Klipp ut två 7 mm cirklar runt inlopp på reservoarskiktet, och använda en biopsi nål för att stämpla igenom-hål vid inlopps portarna på tak skiktet.
- Bond tre högar av PDMS (mönstrad stapel, reservoarskikt, tak lager) med syrgas plasma behandling.
- Med biopsinålen, punch through-hål vid utlopp och centrum porten på enheten.
2. förberedelse av medier och cellinjer
- Förbered media för odling PC3 cellinjer, inklusive PC3-EMT och PC3-EPI: mix RPMI 1640 medium med 10% foster bovint serum (FBS) och 1x antibiotika-antimykotisk. Generera cellinjer som beskrivits tidigare14.
Obs: PC3 cellinjer bibehålls i ovanstående media i fuktade inkubatorer vid 37 ° c med 5% CO2. Dela celler och subkultur var 3 dagar, innan de når 100% confluency. - Transfect cellinjer med cytoplasmiska-märkta fluorescerande markörer för bättre visualisering, som beskrivits tidigare12, så att PC3-EMT uttrycker CYTOPLASMISKA GFP och PC3-EPI uttrycker cytoplasmiska mcherry. Observera att tekniken även är kompatibel med alla fluorescerande-märkta celler samt brightfield Imaging av omärkta celler.
3. experimentell inställning
- Tillverkning av metallplåt hållare
- Fabricera en skylthållare som är tillräcklig för att hålla samtidig gas-permeable kultur rätter för parallella experiment genom bearbetning eller 3D-utskrifter. 3D CAD-filen ("3-brunn tallrik. FCStd ") kan hittas på GitHub som referens (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Skruva loss komponenterna i hållaren (figur 2) med en skruvmejsel. Desinficera komponenterna via UV-exponering i minst 1 h och låt verka i en steril miljö.
Obs: hållaren är konstruerad för att ge betydande förutsättningar för termisk jämvikt och idealiska gas sammansättningar, med gas kanal inlopp som möjliggör luftflöde. Mer information finns i vårt tidigare arbete12. - Förbered upp till tre gas genomträngliga kultur rätter, av vilka cellkultur membranet är relativt flexibelt.
- Cellinssådd
- 24 timmar före starten av experimentet, Harvest PC3-EPI och PC3-EMT celler av trypsinization för 5 min. Lägg till förvärmda kultur medier, Centrifugera sedan på 150 x g i 3 min och Kassera supernatanten.
- Räkna celler av varje PC3-EPI och PC3-EMT med hjälp av en hemocytometern och isolera totalt 2,5 x 104 av varje celltyp för varje gas-permeable kultur skålen.
- Blanda och Omsuspendera de två celltyperna i 2 mL kulturmedia och frö cellerna till var och en av de gas genomträngliga kultur skålen.
- Lämna hela plattan hållaren i inkubatorn över natten för celler att fästa.
- Desinficera PDMS-apparaterna via UV-exponering i minst 1 h och låt verka i en steril miljö.
- Ställa in värmekontroll enhet och gasförsörjningssystem
- Som framgår av figur 3, inrätta ett gasförsörjningssystem som består av både Co2 och O2 styrenheter, en gas pump, en gas blandningskammare, en luftfuktare eller Bubbler, och tre separata uppsättningar av gas ventiler och tryckmätare. Mer information finns i vårt tidigare arbete12.
- Ställ in CO2 och o2 -styrenheter så att de justerar blandnings HASTIGHETEN för gasen från Co2 -och N2 -tankarna och o2 -källan. Alternativt, alla gasförsörjningssystem som ger gas under normoxia skick skulle fungera.
- Se till att gasen som är kombinerad i blandningskammaren och fuktad med en bubbelflaskan så att den relativa luftfuktigheten ökas upp till 85% (som läses ut från en relativ fuktighetsmätare) och att gasen leder till tre oberoende gas ventiler med tryckmätare för att Kontrollera och övervaka gasflödet i plåt hållaren.
- Placera hela plattan hållaren i en on-stage inkubation termisk kontrollenhet med separata värme subenheter för locket och bottenplattan, med alla enheter inställd på 37 ° c. Se tabell över material för mer information.
- Installation av mikroflödessystem-enhet. Se tabell över material för mer information.
- Identifiera att de detaljerade komponenterna i 3-brunnen plåt hållaren är i ordning, som i figur 2. Var och en av de tre brunnar är identiska och oberoende, med ett par gaskanaler för varje brunn. Varje brunn besitter en gas-permeable kultur skålen hållare, en PDMS chip hållare, en glas fönster hållare, och ett par 35 mm glasfönstren. Dessa komponenter kan monteras med hjälp av de monterade skruvarna.
Anmärkning: glas fönster se till att det finns ett termiskt isolerade utrymme mellan gas-permeable kultur membran och väl så att ingen kondens uppstår på grund av temperaturskillnader vid gränssnittet. Observera att de 3 brunnarna är oberoende, och 3 experiment kan göras separat. - Pre-Warm kultur medium vid 37 ° c och Degas i en vakuumkammare för 20 min.
- Behandla PDMS chips med hjälp av en syrgas plasma system för 30 s för att bibehålla hydrofilicitet.
- Ställ in sprutsystemet. Ladda två sprutor långsamt med tillväxtmedia och andra två sprutor med önskad reagens av intresse (Media, media med läkemedel, etc.). Anslut varje enskild spruta till en 50 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) med en 23 G dispensering nål i en ihålig stål stift. Sätt in en ihålig stålnål i den andra änden av slangen.
- Prime slangen och sätt in stålnålen i varje PDMS chip genom tak skiktet. Fyll upp reservoarskiktet och blöt PDMS mönster lager mönster med media. Reservoarskiktet fungerar som en on-chip bubbla fälla för att förhindra luftbubblor från att komma in i mikroflödessystem mönster.
- Ladda en 1 mL spruta med odlingsmedium. Anslut sprutan till en 5 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) med en 23 G dispensering nål i en ihålig stålnål. Sätt i en ihålig stålnål i den andra änden av slangen och Prime slangen.
- Sätt in den ihåliga stål stiftet i mitten hålet av chip, där alltför stora medier kan extraheras ut från chip senare under spåntätning processen.
- Eftersom varje PDMS-enhet kräver 4 10 mL sprutor laddade på en sprutpump, Ladda 2 10 mL sprutor per chip i främre däck. Placera de två andra sprutorna i sprutsystemets uttags däck.
- Placera chip direkt ovanpå gas-permeable kultur membran (med celler redan anslutit sig till membranen). För att undvika att fastna mikrobubblor i mikroflödessystem mönstret, dispensera 1 ml förvärmda och avgasade media i 35 mm gas-permeable kultur skålen före montering, och sedan se till att chippet närmar sig vätskeytan med en 15-graders lutningsvinkel.
- Klämma den gas-permeable kultur skålen och brunnen i gas-permeable kultur skålen hållare för varje chip, med PDMS chip innehavaren trycka PDMS enheten nedåt.
- Tejpa ett ark av en sealer ovanpå PDMS enheten och klämma med PDMS chip hållaren för att förhindra att chippet torkar ut.
- Ställ in Medieflödet runt matrisen till 20 μL/h.
- Ställ hela plattan i on-stage inkubator på den motoriserade scenen i ett inverterat Mikroskop. Anslut gasförsörjningssystemet till gas kanalerna och tryck på gas-permeable kultur membran mot den installerade PDMS chip för att säkerställa tätning av enheten. Bibehålla mätar trycket vid 0,2 psi (1,4 x 104 PA).
- Extrahera långsamt överflödig media i kretsen med hjälp av 1 mL-sprutan från mitthålet. Observera chip under mikroskopet medan extrahera media och sedan sluta utvinna när kretsen är förseglad. Spåntätning bör vara uppenbar eftersom en del av cellerna skulle krossas av mikro-strukturer.
- Anslut temperatur Avkännings enheten på scenens inkubator till 3-välsplattan och Ställ in till 37 ° c.
- Identifiera att de detaljerade komponenterna i 3-brunnen plåt hållaren är i ordning, som i figur 2. Var och en av de tre brunnar är identiska och oberoende, med ett par gaskanaler för varje brunn. Varje brunn besitter en gas-permeable kultur skålen hållare, en PDMS chip hållare, en glas fönster hållare, och ett par 35 mm glasfönstren. Dessa komponenter kan monteras med hjälp av de monterade skruvarna.
4. fotografering med en cells tidsfördröjning
- Ställ in avbildningsprogram använda ett inverterat Mikroskop till Time-lapse bild förvärv. Observera att ett inverterat fluorescerande Mikroskop med helt motoriserade x-y-steg, Fokuseringsratt, slutare och filterkuber krävs för ett EA-experiment.
- Konfigurera programvara för att hämta bilder över två kanaler vid 10X förstoring för varje chip med automatisk bild-sömnad efter en runda av autofokus. Tänk på att automatiska korrigeringssystem som perfekt fokus inte garanterar tillfredsställande bildkvalitet. Det är mer rekommenderat att generera en anpassad fokus yta för långsiktig bild förvärv baserat på antingen autofokus eller manuell fokusering över chippet.
- Ta bilder varje timme och lämna experiment som körs på tidsskalan för veckor. Övervaka bildkvaliteten på en daglig basis och uppdatera fokus ytan om det behövs.
- Förbered PDMS chip och gas-permeable kultur skålen för efterföljande Immunofluorescerande analys, som beskrivs tidigare13.
5. bildbehandling och analys
- Efter experimentell bearbetning
- Konvertera bilder till TIFF-format för bildbehandling och mätningar som utnyttjar Fiji/ImageJ.
- Komprimera TIFF-filer för att underlätta ytterligare bildbehandling.
- Fiji/ImageJ analys
- För att identifiera celler, utför bakgrunds subtraktion och Partikelanalys för att identifiera fluorescerande ljuspunkter för cell lokaliserings detektering och automatisk cellräkning.
- Använda plugins (Manuell spårning, chemotaxis, Migration Tool, Trackmate) för att analysera cellernas motilitet och migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av optimal celltillväxt på chip
Ett viktigt mål för experiment plattformen är att återge viktiga komponenter och interaktioner i en komplex tumör mikromiljö på ett heltäckande sätt, men ändå enkelt att tillhandahålla kvantitativa, pålitliga och reproducerbara data. Detta mål kan bara uppnås om vi har full kontroll över de fysiska och biokemiska miljöfaktorerna. Vi måste antingen utesluta de oönskade faktorerna eller räkna ut ett sätt att införliva de okontrollerbara faktorerna i den kvantitativa modellen för att korrekt tolka befolkningens beteenden.
Det första testet är att säkerställa optimal celltillväxt på enheten. Cellernas spridningshastighet på enheten måste vara identisk eller jämförbar med deras tillväxt profil i konventionell cellkultur. Som ett bevis på princip, mänskliga prostatacancer cell linje PC3 celler var odlade i PDMS chip utan närvaro av yttre stress. Dessa celler var fluorescently-märkt i cytoplasman så att vi kunde observera och kvantifiera populationen av celler med inverterad fluorescerande mikroskopi. Celler Confluence, definierat som det område som täcks av celler, mättes vid varje mikrohabitat vid olika tidsramar med tanke på en vald intensitet tröskel på fluorescerande bilder med Fiji15. Cellernas tillväxtkurvor vid varje vald position ritas i figur 4. De valda positionerna är spridda över chippet, från regionen nära spetsen av media inflöde till spetsen nära Media uttag.
Tillväxtkurvor i figur 4B är väl anpassade, vilket tyder på att cellernas spridnings profil som en funktion av position över chip. Den initiala lutningen på kurvorna avslöjar spridningstakten. Fördubblings tiden för celler i enheten är cirka 24 timmar som visas i figur 4B från tid 0 till 24 timmar, vilket är samma som fördubblings tiden i konventionella cultureware13. Därför drar vi slutsatsen att utan närvaron av en extern källa till stress, de fysiska och biokemiska faktorer är jämnt fördelade, vilket leder till den homogena och optimerad celltillväxt från tid 50 till 100 timmar.
Vi ansåg vidare möjligheten att kvantifiera celldynamiken mellan subpopulationer i en mikromiljö. GFP-uttrycker PC3-EMT och mCherry-uttrycker PC3-EPI cellinjer var Co-odlade i EA som visas i figur 5. Cell sammanflödet, definierat som procentandelen av området som täcks av cellerna, mäts som en indikation på befolkningens storlek. Med början från 40% sammanflödet, växte samkulturen helt konfluenta inom 3 dagar. Intressant, vi kan observera utvecklingen av varje fenotyp i mikromiljön. Medan tillväxtkurvan av totala sammanflödet är i form av logistisk tillväxtmodell, populationen av PC3-EMT fortsatte att expandera och PC3-EPI dämpades i den asymptotiska fasen.
Demonstration av cell motilitetsanalys i en blandad population
Cellmotilitet är ett viktigt fenotypiskt beteende. Den motilitetsfördelning av en population kan ge information om den fysiska interaktionen av celler, de mekaniska egenskaperna hos lokala mikromiljön, och kan ibland analyseras som en indikation på epigenetisk variation av celler. Med tanke på att vår förbättrade cellkultur plattform tillåter nästan kontinuerlig avbildning, maximerar fördelen med att ha fin temporala upplösningen potentialen för enkel cell spårning i en heterogen population.
Vi använder plugin TrackMate16 i Fiji (http://Fiji.SC) med anpassade makro för att genomföra och automatisera spårningsprocessen. TrackMate tillåter användaren att implementera och anpassa en spårningsalgoritm med ett skriptspråk från Fiji Script Editor. Spårningsprocessen är uppdelad i en serie steg: segmentering, filtrering och partikel länkning.
Som framgår av figur 6B, utförde vi en "sårläknings analys" som en demonstration för att studera cell kollektiv migration och cell-cell interaktion. PC3-EPI och PC3-EMT celler var tätt seedade i mitten av enheten och tilläts att fritt migrera mot tomma regionen. Det normaliserade histogrammet av hastigheten hos båda fenotyperna ritas i figur 6C. Hastigheten på PC3-EMT var signifikant högre än PC3-EPI med en faktor 1,8 x, vilket är förenligt med det faktum att mesenkymala fenotyp fungerar som en del av kutana sårläkning med exceptionell förmåga att migrera i motsats till den comparably stationär epitelial fenotyp.
Vidare, för att observera utvecklingen av cellmotilitet i en stressfri miljö, utförde vi en långsiktig Co-kultur av PC3-EPI och PC3-EMT med enhetlig initial sådd densitet och spårade fördelningen av cellhastighet varierande med tiden. Som visas i figur 7A, B, efter 6 dagar av kultur, som celler nådde högre sammanflödet, fördelningen av cellhastighet för båda fenotyper lutade mot den vänstra svansar.
Vi kan jämföra förhållandet mellan antalet PC3-EPI till PC3-EMT i varje klass intervall. Som visas i figur 7C, oavsett dagar av kultur eller densitet av celler, dominerade PC3-EMT höghastighets regionen medan PC3-EPI ockuperade låg hastighet zonen. Även om den totala hastigheten minskade markant för båda fenotyperna förblev PC3-EMT motilen och påverkades mindre av den krökning av mikromiljön som visas i figur 7D. Den genomsnittliga hastigheten på PC3-EPI sjönk runt 40% medan den av PC3-EMT bara sjönk 14%.
Det finns flera faktorer som kan påverka fördelningen av cellhastighet och medelhastighet, såsom tätbefolkade av befolkningen. Kontinuerlig cell spårning och övervakning över alla subpopulation är viktigt att förstå utvecklingen av fenotypisk beteende. Till exempel, om vi skulle vilja kvantifiera nivån på mesenkymala status för en omärkt subpopulation, skulle det vara mer informativ att förvärva inte bara fördelningen av den fysiska kvantiteten (t. ex. hastighet) av den intresserade subpopulationen som en funktion av tid, men också att alla resten av den samexisterande subpopulationen av celler.
Bild 1: sprutan-pump driven mikroflödessystem EA chip. (A) mikrofluidic-enheten har två separata medium inlopp, två uttag och en central port för cell sådd eller extraktion av överdrivet medium. Observera att mellan medium inlopp och cellkultur arrayer, ett par Serpentine kanaler som gör det möjligt för mediet att jämbrate med atmosfären passerade under gas-permeable membranet. B) generering av lutning. Sprutorna pumpa mediet med ~ 0,1 mM av fluorescein och ingen fluorescein respektive i chippet genom 2 medium vikar till höger, utvinns ur chip på 2 medelstora utlopp på vänster. Koncentrationen av fluorescein är proportionell mot intensiteten av fluorescenssignalen, och är profilerad nära medium inlopp/utlopp a och nära centrum b. figur som återges med tillstånd från lin et al. 201712. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: komponenterna i den anpassade 3 väl prov plattan. a) huvud organet i 3-välsplattan. bett par gaskanaler som medger att betingad atmosfär pumpas in och ventileras ut genom septa vid ingången till gas kanalerna. cen O-ring avsedd att försegla utrymmet mellan brunnen plattan och den gas genomträngliga kultur skålen. d) den gas genomträngliga kultur skålen med en diameter på 35 mm. e) diskhållaren. fPDMS-enhet. g) hållare för PDMS-chip. hde dubbla lager 35 mm glas fönster som är konstruerade för att bibehålla värmeisoleringen och förhindra kondensbildning. iglas fönster hållare. j) värmedynor. ktemperaturgivare. (l) den adhesiva sealer som håller spånan från att torka ut. Figur som återges med tillstånd från lin et al. 201712. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: den schematiska siffran för den experimentella installationen. Installationen av experimentet, inklusive gasförsörjningssystemet, gaskanaler anslutning, mediet försörjnings anslutning och avbildnings systemet. Figur som återges med tillstånd från lin et al. 201712. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tillväxtkurvor av PC3 i EA utan stress. PC3 var odlade i EA utan närvaro av yttre stress. (A) EA-mönster med positions etiketter. (B) tillväxtkurvor av PC3 vid de valda positionerna när det gäller cell sammanflödet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Co-kulturen i PC3-EPI och PC3-EMT i EA utan stress. PC3-EPI (röd) och PC3-EMT (grön) var Co-odlade i EA utan närvaro av yttre stress. (A) överlagring av två fluorescerande kanaler vid t = 0 h. (B) fluorescerande bild tagen vid t = 95 h. (C) tillväxtkurvor när det gäller cell sammanflödet. Cell sammanflödet av varje celltyp mättes på hela chipet. Varje datapunkt representerar den genomsnittliga cell sammanflödet vid 3 på varandra följande tidpunkter som tas med 15 minuters mellanrum. Felstaplarna representerar standardavvikelsen för cell sammanflödet vid de tre på varandra följande tids punkterna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analys av cellmotilitet i en blandad population. Demonstration av enstaka cell spårning prestanda i en blandad population. (A) en demonstration av hur celler upptäcks av Laplacian av Gaussian (log) segmentering. Cirklarna indikerar platsen för celler som upptäckts av Loggalgoritmen. De identifierade cellerna länkas från ram till ram baserat på det linjära tilldelnings problemet för att kvantifiera cellernas motilitet. (B) "sårläknings analys" av PC3-EPI och PC3-EMT Co-Culture experiment. Celler var seedade lokalt upp till 100% sammanflödet med en tydlig gräns i centrum. Efter installationen av EA-chip, celler observerades för att migrera genom microhabitat array som indikeras av de vita pilarna. Cnormaliserat histogram över cellernas motilitet. PC3-EMT är snabbare än PC3-EPI med en faktor på 1,8 x. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 5 experiment exempel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: motilitetsanalysen av en långsiktig samodling av PC3-EPI och PC3-EMT. En långsiktig samodling av PC3-EPI och PC3-EMT med enhetlig initial sådd densitet. Fördelningen av cell hastigheten varierar med tiden. (A) normaliserad distribution av cellhastighet på dag 2. Bden normaliserade fördelningen av cell hastigheten dag 6. (C) förhållandet mellan antalet PC3-EPI och PC3-EMT i varje klass intervall. (D) medelhastighet på PC3-EPI och PC3-EMT som en funktion av tiden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionell cellkultur utvecklades för nästan ett sekel sedan och är fortfarande den mest använda prekliniska modellen inom biomedicinsk forskning, trots dess bevisade begränsade förmåga att förutsäga kliniska resultat i cancer17. Djurmodeller erbjuder den högsta fysiologiska relevansen och rimlig genetisk likhet med människor, men har länge erkänts ha betydande begränsningar för att förutsäga mänskliga utfall18. Bland alla befintliga prekliniska modeller, mikroflödessystem cancer-on-chip modeller verkar vara den mest lovande kandidaten för att tillfredsställa den ouppträffade behov i cancerforskning9,19,20. Emellertid, nuvarande cancer-on-chip modeller har ännu inte erbjuda en plattform som kan reproducera viktiga komponenter och interaktioner för att efterlikna en tumör mikromiljö på ett omfattande sätt, men enkelt nog att ge tillförlitlig och reproducerbara kvantitativa data. Våra representativa data visar att vår teknik för mikrofluidisk cellodling ger stabila fysikaliska och biokemiska förutsättningar för långsiktig cellkultur i heterogena mikromiljöer. Denna multifunktionella plattform möjliggör sofistikerad justering av en tidsberoende kemisk gradient samt omgivande gassammansättning. Plattformen är portabel och kompatibel med de flesta av de fluorescerande inverterade Mikroskop för högupplösta realtids avbildning, som erbjuder flerdimensionell information av celler som en funktion av tid, inklusive cellmorfologi, populationsdynamik, cell rörlighet och cell migration på en enda cellnivå.
Jämfört med vårt tidigare arbete11, noterar vi att denna tryck-tätning förpackning och monteringsmetod för vår mikroflödessystem enhet möjliggör många nedströms experiment kapacitet (t. ex. FACS, lokal metabolit extraktion, sub-klonala populationer expansion, om, DNA/RNA-fisk, etc.) komplement till de tids fördröjnings bilder som tagits under experimenten. Denna förmåga att ta bort celler från specifika platser i en heterogen kultur är ett stort framsteg jämfört med tidigare enheter, där tätningsytan till ett chip måste tas bort innan man kunde komma åt kulturen11. Vidare, även i detta fall, handlingen att ta bort locket betydligt störde kulturen så att lokala tester av celler på en enda till få Habitat nivåer var inte möjligt. Sådana lokaliserade utvinning var möjligt i vårt fall på grund av den mjuka "återförslutningsbara" karaktären av den flexibla gas-permeable membranet.
Det finns flera kritiska steg i det presenterade protokollet. Först av allt, att initiera ett långsiktigt experiment med stabil fluidic dynamik, mikrobubblor måste undvikas så mycket som möjligt. Därför är det viktigt att förvärma och Degas odlingsmediet (steg 3.4.2) innan du fyller på mediet i sprutorna. Manipulering av media lastning och dispensering bör göras långsamt och försiktigt för att förhindra bubbelbildning. PDMS-mönstret ska behandlas med syre plasma (steg 3.4.3) innan det ansluts till kultur mediernas försörjningssystem. Syrgas plasma behandling säkerställer hydrofilicitet av PDMS ytan och avsevärt minskar risken för mikrobubblor entrapping. I steg 3.4.7., när du placerar chip på toppen av cellen kultur membran, den PDMS chip bör närma sig flytande yta med en 15-graders lutning vinkel för att bli av med bubblor (om någon) på den flytande ytan inne i kulturen skålen. För det andra kräver den trycktäta metoden ett stabilt gasförsörjningssystem som pressar cell odlings membranet. Trycket bör ställas in mellan 0,2 till 0,6 psi. Trycket lägre än 0,2 psi är otillräckligt för spåntätning. Över 1,2 PSI, en betydande mängd gas skulle genomsyra genom membranet och generera bubblor i mikroflödessystem mönster. Vi noterar att om komponenterna i metall 3-brunnen plattan inte är korrekt monterade (inklusive plattan kroppen, gas-permeable kultur skålen innehavaren, en PDMS chip Holder, ett glas fönster hållare, O-ringar, och ett par 35 mm glasfönstren), skulle man identifiera gasläckage som Tryck läsningen skulle vara olyhörd för ökningen av gasflödet. Läckageproblemet kan lösas genom att helt enkelt göra ett läckagetest och sedan återmontera komponenterna.
Den stora form av data som förvärvats med utnyttjande av EA-tekniken sker genom avbildning. Som tidigare nämnts kan EA-tekniken installeras på alla inverterade Mikroskop. Men för att fullt ut utnyttja fördelarna med systemet, är det starkt rekommenderat att installera systemet på en inverterad fluorescerande Mikroskop utrustad med helt motoriserade x-y steg, motoriserad fokus knopp, motoriserad slutare och motoriserad filterkub. Tänk också på att perfekt fokus kanske inte garanterar tillfredsställande bildkvalitet. Vi föreslår att du använder en avbildning programvara som tillåter flerdimensionella bild förvärv och anpassade Imaging script. Att hålla bilderna väl fokuserade kan vara utmanande utan en periodisk (varje 24 timmar eller 48 timmar) autofokus kommando, som genererade en skräddarsydd fokus yta under bilden förvärvs cykeln.
Den presenterade mikroflödessystem EA-teknik har genomförts för att studera anpassning och evolution dynamik i prostatacancer cell metapopulationer under en kemoterapeutiska stress landskap12. Vi har också visat uppkomsten av läkemedelsresistens polyploida jätte cancerceller i denna tumör-liknande heterogena mikro-ekologi, visar att miljö heterogenitet kombinerat med cell migration inom tumör population skulle orsaka amplifiering uppkomsten av resistenta fenotyper13. Med förmågan att kontrollera och övervaka beteenden av blandade tumör cells populationer under välkontrollerade spännings gradienter, kan vår mikrofluidiska EA-teknik också fungera som en plattform för att studera regleringsmekanismer och den fenotypiska omvandlingen som ingår i EMT i samband med cancer terapeutiska strategier21. Sist men inte minst, den presenterade trycktätning förpackningsmetod kan också genomföras i andra mikroflödessystem system som kräver sofistikerad justering av omgivande gassammansättning samt nedströms experiment kapacitet. Till exempel användes samma förpackningsmetod för att införliva olika mikrofluidiska mönster för att studera hur bakterie populations vågor propagerar genom fysiska barriärer22.
Sammanfattningsvis är kollektiv populationsdynamik kvalitativt sett annorlunda från encellig beteenden. Den mikroflödessystem EA-tekniken möjliggör kvantitativ studie av evolutionära dynamik och fenotypiska beteenden individuellt och kollektivt som en funktion av tiden. Denna teknik kan utgöra en mer fysiologiskt relevant in vitro-modell för cancerforskning, och potentiellt för preklinisk läkemedelsutveckling och screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
