Summary
هنا، نقدم بروتوكول لجمع أطياف رامان البؤرية من البشر في الدراسات السريرية جنبا إلى جنب مع النهج الكيميائية للإزالة الطيفية الخارجية واستخراج لاحق ة من السمات الرئيسية.
Abstract
تطوير هذا في الجسم الحي البؤري رامان طريقة مطيافية تمكن من القياس المباشر للمياه والبروتينات والدهون مع دقة عمق في البشر. هذه المعلومات مهمة جدا للأمراض المتصلة بالبشرة وتميز أداء منتجات العناية بالبشرة. ويوضح هذا البروتوكول طريقة لجمع أطياف رامان البؤرية والتحليل اللاحق لمجموعة البيانات الطيفية التي تستفيد من المقاييس الكيميائية. والهدف من هذه الطريقة هو وضع بروتوكول موحد لجمع البيانات وتوفير التوجيه العام لتحليل البيانات. المعالجة المسبقة (على سبيل المثال، إزالة الأطياف الخارجية) هي خطوة حاسمة عند معالجة مجموعات البيانات الكبيرة من الدراسات السريرية. وعلى سبيل المثال، نقدم إرشادات تستند إلى المعرفة المسبقة لمجموعة البيانات لتحديد أنواع القيم الخارجية ووضع استراتيجيات محددة لإزالتها. يتم إجراء تحليل مكون رئيسي، ويتم مقارنة أطياف التحميل بالأطياف من المواد المرجعية لتحديد عدد المكونات المستخدمة في التحليل النهائي لدقة منحنى المتغيرات المتعددة (MCR). وقد نجح هذا النهج في استخراج معلومات ذات مغزى من مجموعة بيانات طيفية كبيرة.
Introduction
في الدراسات السريرية، في الجسم الحي البؤري رامان مطياف أظهرت قدرتها الفريدة لتحديد سمك القرنية الطبقة ومحتوى المياه1،2،3،4،وتتبع اختراق المواد النشطة تطبق موضعيا على الجلد5،6. كنهج غير الغازية، يكشف مطياف رامان البؤري الإشارات الجزيئية على أساس أوضاع الاهتزاز. وبالتالي، لا حاجة لوضع العلامات7. في الجسم الحي البؤري رامان مطيافييوفر المعلومات الكيميائية مع دقة عمق استنادا إلى الطبيعة البؤرية لهذه التقنية. هذه المعلومات التي تعتمد على العمق مفيدة جدا في دراسة آثار منتجات العناية بالبشرة4،8، الشيخوخة9،10، التغيرات الموسمية3، فضلا عن الأمراض وظيفة حاجز الجلد ، مثل التهاب الجلد التأتبي11،12. هناك الكثير من المعلومات في منطقة التردد العالي من مطياف رامان البؤري (2500-4000 سم-1)،حيث تنتج المياه قمم متميزة في المنطقة بين 3,250-3,550 سم-1. ومع ذلك، فإن قمم رامان من البروتينات والدهون، والتي تتركز بين ما يقرب من 2800-3000 سم-1،تتداخل مع بعضها البعض لأن الإشارات تنتج أساسا من الميثيلين (-CH2-) والميثيل (-CH3)مجموعات13 . وتمثل هذه المعلومات المتراكبة تحديا تقنيا عند الحصول على كميات نسبية من الأنواع الجزيئية الفردية. وقد استخدمت الذروة المناسب14،15 وانتقائية موقف الذروة12،16 النهج لحل هذا التحدي. ومع ذلك، فإنه من الصعب على هذه الطرق المستندة إلى الذروة واحدة لاستخراج معلومات المكون النقي لأن قمم رامان متعددة من نفس المكون تغيير في نفس الوقت17. في المنشور الأخير18، اقترح نهج MCR لتوضيح المعلومات المكون النقي. باستخدام هذا النهج، تم استخراج ثلاثة مكونات (الماء والبروتينات والدهون) من مجموعة بيانات مطيافية كبيرة في الجسم الحي.
تنفيذ الدراسات السريرية الكبيرة يمكن أن تكون صعبة على الأفراد جمع في البيانات الطيفية الجسم الحي. وفي بعض الحالات، يمكن أن يتطلب الاكتساب الطيفي معدات تشغيل لعدة ساعات في اليوم، ويمكن أن تمتد الدراسة إلى أسابيع أو أشهر. وفي ظل هذه الظروف، يمكن أن يتم توليد البيانات الطيفية من قبل مشغلي المعدات الذين يفتقرون إلى الخبرة التقنية لتحديد واستبعاد وتصحيح جميع مصادر القطع الأثرية الطيفية. وقد تحتوي مجموعة البيانات الناتجة على جزء صغير من القيم الخارجية الطيفية التي يلزم تحديدها واستبعادها من البيانات قبل التحليل. توضح هذه الورقة بالتفصيل عملية تحليل قياس كيميائي "لتنظيف" مجموعة بيانات رامان السريرية قبل تحليل البيانات مع MCR. ولإزالة القيم الخارجية بنجاح، يلزم تحديد أنواع القيم الخارجية والسبب المحتمل لتوليد الأطياف الخارجية. ثم، يمكن تطوير نهج محدد لإزالة القيم الخارجية المستهدفة. ويتطلب ذلك معرفة مسبقة بمجموعة البيانات، بما في ذلك فهم مفصل لعملية توليد البيانات وتصميم الدراسة. في مجموعة البيانات هذه، فإن غالبية القيم الخارجية هي أطياف منخفضة من الإشارة إلى الضوضاء وتنشأ في المقام الأول من 1) الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد (6,208 من أصل 30,862)، و 2) مساهمة قوية في الطيف من ضوء غرفة الفلورسنت (67 من أصل 30,862). الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد تنتج استجابة رامان ضعيفة، كما يقترب نقطة الاتصال الليزر سطح الجلد، ومعظمها في نافذة الصك تحت الجلد. يتم إنشاء Spectra مع مساهمة قوية من ضوء غرفة الفلورسنت بسبب إما خطأ مشغل الصك أو حركة الموضوع، والتي تنتج حالة حيث لا يتم تغطية إطار جمع رامان البؤري ة بالكامل من قبل موقع الجسم للموضوع. وعلى الرغم من أنه يمكن تحديد هذه الأنواع من القطع الأثرية الطيفية ومعالجتها أثناء اكتساب الطيفية من قبل خبير مطيافي وقت الحصول على البيانات، فقد صدرت تعليمات لمشغلي الأجهزة المدربين المناوّقين المناوّقين في هذه الدراسة بجمع جميع البيانات ما لم يكن هناك ولوحظ فشل كارثي. وتدرج مهمة تحديد واستبعاد القيم الخارجية في بروتوكول تحليل البيانات. وقد وضع البروتوكول المقدم لمواجهة هذا التحدي. لمعالجة الأطياف المنخفضة للإشارة إلى الضوضاء فوق سطح الجلد، يجب تحديد موقع سطح الجلد أولاً للسماح بإزالة الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد. يتم تعريف موقع سطح الجلد على أنه العمق حيث تكون نقطة الاتصال ليزر رامان نصف في الجلد ونصف من الجلد كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. بعد إزالة الأطياف المنخفضة من الإشارة إلى الضوضاء، يتم تنفيذ تحليل مكون رئيسي (PCA) لاستخراج العامل الذي تهيمن عليه قمم ضوء غرفة الفلورسنت. تتم إزالة هذه القيم الخارجية استناداً إلى قيمة النتيجة للعامل المقابل.
يوفر هذا البروتوكول معلومات مفصلة عن كيفية تحديد ستة مكونات رئيسية في عملية MCR. ويتم ذلك من خلال تحليل الأنيكل الخماسي الكلور متبوعاً بمقارنة الشكل الطيفي بين عمليات التحميل للنماذج التي يتم إنشاؤها بعدد مختلف من المكونات الرئيسية. كما أن العملية التجريبية لجمع البيانات من المواد المرجعية فضلا عن المواضيع البشرية موضحة بالتفصيل أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الاستعراض المؤسسي لمستشفى بيجين للأطفال على هذه الدراسة امتثالا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لإعلان هلسنكي لعام 1975. وقد أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التراث الثقافي غير المادي للممارسة السريرية الجيدة. وقد أجريت الدراسة في الفترة من أيار/مايو إلى تموز/يوليه 2015.
1. جمع في الجسم الحي الأطياف رامان البؤرية من البشر مع التهاب الجلد التأتبي
- إدراج المواضيع التي تتوافق مع المعايير التالية.
- تشمل مواضيع تتراوح أعمارهم بين 4-18 سنة.
- تشمل الأشخاص الذين يعانون من التهاب الجلد التأتبي الخفيف إلى المعتدل (درجة 2 أو 3 وفقا للتقييم العالمي للطبيب) مع أعراض المرض النشط على 5٪ -30٪ من سطح الجسم، مع ما لا يقل عن اثنين من الآفات على الذراعين.
- تضمين الأشخاص الذين هم في صحة جيدة، باستثناء الأعراض المرتبطة مباشرة بمرض AD.
- إدراج المواضيع التي توفر الموافقة الخطية المستنيرة.
- قم بتضمين المواضيع التي تحتوي على قيمة زاوية طبولوجيا فردية (ITA) أعلى من 40 في موقع الاختبار.
- استبعاد المواضيع التي تستوفي أي من المعايير التالية.
- استبعاد المواضيع التي تشارك حاليا أو التي سبق أن شاركت في دراسة سريرية في أي منشأة اختبار في غضون الأسابيع الأربعة السابقة.
- استبعاد الأشخاص المصابين بالسرطان أو الذين تم تشخيصهم أو علاجهم من السرطان في غضون 5 سنوات قبل الدراسة.
- استبعاد المصابين بمرض السكري.
- استبعاد الأشخاص الذين يعانون من مرض مناعي أو معدي يمكن أن يعرض الموضوع للخطر أو يتداخل مع دقة نتائج الدراسة (أي التهاب الكبد والسل وفيروس نقص المناعة البشرية والإيدز والذئبة والتهاب المفاصل الروماتويدي).
- استبعاد الأشخاص الذين يعانون من أمراض الجلد التي قد تتداخل مع قياسات مفيدة أو سوف تمنع التقييم الواضح للجلد فقط لالتهاب الجلد التأتبي. ومن الأمثلة على ذلك جفاف البشرة، والجلد التالف، والتخفيضات، والخدوش، وحروق الشمس، والوحمة، والوشم، والندوب واسعة النطاق، والطفح الجلدي، ونمو الشعر المفرط، أو حب الشباب.
- استبعاد الأشخاص الذين يستخدمون الأدوية المثبطة للمناعة عن طريق الفم، أو المضادات الحيوية، أو العلاجات النظامية الأخرى خلال الشهر الماضي، باستثناء المهدئات البسيطة.
- استبعاد الأشخاص الذين يعانون من أي حالات طبية أخرى، في رأي المحقق، تمنعهم من المشاركة في الدراسة.
- استبعاد الأشخاص الذين يعانون من تصبغ أعلى في منطقة الاختبار.
- تسمية منطقة الآفة من المشاركين في دراسة التهاب الجلد التأتبي وعلامة مع 3 سم × 4 سم المنطقة على أو بالقرب من موقع الآفة كما هو مبين في الشكل 1A.
- تسمية المنطقة غير الآفة مع نفس العلامة في موقع الجسم المقابل (على سبيل المثال، الساعد الأيسر مقابل الساعد الأيمن) كما هو مبين في الشكل 1B.
- ضع موقع الجسم المميز في اتصال وثيق مع نافذة أداة رامان في الجسم الحي البؤري كما هو موضح في الشكل 2A والشكل 2B. تغطية النافذة بأكملها لتجنب تأثير ضوء الغرفة على موقع الجسم.
- تنفيذ مجموعة بيانات Raman.
ملاحظة: للأداة دقة طيفية تبلغ 2 سم-1 و50 x هدف الفحص المجهري (NA = 0.9 الغمر بالزيت)، وذلك باستخدام ليزر 671 نانومتر بقوة 17 م.م.م. يتم معايرة الطول الموجي باستخدام طيف مصباح النيون الأرجون المدمج. تتم معايرة الكثافة من خلال قياس طيف معيار معايرة الزجاج NIST (المعهد الوطني للمعايير).- حرك التركيز حتى يتم ملاحظة الطيف كما هو موضح في الشكل 2C، ثم حرك التركيز بعيداً عن سطح الجلد 10 ميكرومتر.
- ابدأ جمع البيانات لـ 26 خطوة بحجم خطوة 2 ميكرومتر في منطقة التردد-1-4,000سم-1 2,510 سم. استخدم وقت تعرض قدره 1 s ومقياس ثمانية نسخ متماثل لكل منطقة تدوم حوالي 10-15 دقيقة.
2- جمع أطياف رامان البؤرية من المواد المرجعية
- وضع المواد المرجعية، والمكونات الرئيسية في الجلد البشري الطبقة القرنية19، على نافذة أداة رامان confocal (انظر جدول المواد: البقري المصل الزلال (BSA)، الماء منزوع الأيونات (دي المياه)، سيراميد، والكوليسترول، مجانا الأحماض الدهنية، وسكوالين).
- جمع أطياف رامان للمواد المرجعية على التوالي من خارج المادة إلى مركز المواد باستخدام نفس معلمات التجميع كما هو موضح أعلاه.
- دمج المنطقة تحت كل أطياف رامان بين نطاق 2,510-4,000 سم-1 وتحديد أعلى ثلاث نقاط قيمة قصوى في هذه القياسات 26. متوسط أطياف رامان من تلك النقاط الثلاث للحصول على أطياف المواد المرجعية النهائية.
3- إزالة الأطياف الخارجية من خلال تحليل المقاييس الكيميائية
- تحديد سطح الجلد وإزالة الأطياف خارج الجلد.
- تغيير ملحق الملف من '.ric' إلى '.mat' وتحميل الملف .mat إلى النظام الأساسي لبرنامج MATLAB.
- تصحيح الأساس باستخدام الأساس (المربعات الأقل مرجح تلقائيًا) بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق مجموعة البيانات المستوردة ضمن تحليل | أدوات أخرى | المعالجة المسبقة في برنامج PLS_Toolbox مع الإعداد الافتراضي.
- قم بتلخيص القيم بين 2,910-2,965 سم-1 للحصول على قيم الكثافة تحت كل طيف رامان من قياس الخطوات الـ 26 المتتالية كما هو موضح في الشكل 3أ عبر وظيفة المجموع في MATLAB.
- احرف قيمة إزاحة الأداة (القيمة في المحور س في الشكل 3B)من 26-260 باستخدام وظيفة المسافة بين الفضاء في MATLAB.
- قم باستيفاء قيمة الكثافة من 26 إلى 260 باستخدام أسلوب الشريحة في MATLAB، والاستفادة من قيم الموضع 260 التي تم إنشاؤها حديثًا.
- استخدم وظائف MATLAB متعددة الملاءمة ومتعددة الدرجات للحصول على مجموعة جديدة من قيم الكثافة مع 260 نقطة. أولاً، استخدم قيم الموضع والكثافة 260 كمدخلات X و Y للدالة متعددة الملاءمة، على التوالي. تعيين قيمة الدرجة إلى 20. ثم استخدم معاملات الإخراج وقيم الموضع الموسع 260 كإدخال للمتعددة الانفال للحصول على قيم الكثافة 260 النهائية.
- استخدم وظائف MATLAB القصوى والدقيقة لتحديد الحد الأقصى والحد الأدنى من قيم الكثافة الـ 260 التي تم الاستيفاء لها حديثًا.
- حساب متوسط قيمة الكثافة عن طريق قسمة مجموع الحد الأقصى والحد الأدنى لقيمة الكثافة على اثنين.
- تحديد قيمة الكثافة من قيم الكثافة 260 (محسوبة من الخطوة 3.1.6) الأقرب إلى متوسط قيمة الكثافة وتعيين قيمة الموضع المقابلة كسطح الجلد. تعيين قيمة الموضع هذه كنقطة الصفر في المحور س كما هو موضح في الشكل 3B.
- تغيير كافة قيم الموضع الأخرى وفقًا لنقطة الصفر وحجم الخطوة المعروف 2 ميكرومتر.
- إزالة جميع الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد وفقا لقيمة موقفهم.
- استيراد بقية البيانات إلى الثابتة والمتنقلة_Toolbox لإنشاء مجموعة بيانات وإعادة تسميتها "RamanData.mat".
- قم بإزالة الأطياف الخارجية مع تأثير ضوء الغرفة.
- قم بتحميل مجموعة بيانات أطياف رامان (RamanData.mat) بعد إزالة الأطياف خارج الجلد وتنفيذ تحليل PCA.
- تحميل مجموعة البيانات في برنامج الثابتة والمتنقلة ضمن النظام الأساسي MATLAB وانقر بزر الماوس الأيمن فوق مجموعة البيانات لاختيار تحليل | PCA.
- حدد التسوية كنهج المعالجة المسبقة واختر بلا للتحقق من الصحة عبر.
- استخدام المكونات الثلاثة لتحليل تحلل الأنيل في الأنينول الخاص بالأنيقان على النحو المبين في الشكل التكميلي 2.
- إزالة الغطاء على نافذة جمع أداة رامان في الجسم الحي وجمع الأطياف ضوء الغرفة في منطقة التردد العالي باستخدام نفس المعلمات المستخدمة لجمع البيانات المواد المرجعية.
- تحديد عامل تأثير ضوء الغرفة من خلال المقارنة مع أطياف خلفية ضوء الغرفة كما هو موضح في الشكل التكميلي 3.
- إزالة الأطياف مع قيمة درجة المقابلة أعلى بكثير من المعتاد (أكثر من 99.8٪ من قيم نقاط مجموعة البيانات بأكملها، وهو 0.16 في هذه الدراسة).
4. اختيار عدد المكونات في تحليل التحلل MCR
- تصحيح خط أساس أطياف رامان باستخدام نفس النهج الموصوف أعلاه (القسم 3-1-2).
- إجراء تحليل PCA على مجموعة البيانات المجهزة مسبقاً كما هو موضح أعلاه (القسم 3.2) باستثناء اختيار "PQN" - "متوسط المركز" بدلاً من "تطبيع"، ورسم قيم eigenvalues في مقياس اللوغاريتمي جنباً إلى جنب مع عدد المكونات (20) كرقم افتراضي في تحليل التحلل بالنقر فوق الزر اختيار المكونات وحدد السجل (eigenvalues) كقيمة Y. اختر ثلاثة إلى ثمانية كعدد المكونات المستخدمة لتحليل MCR.
- إجراء تحليل MCR.
- قم بتحميل مجموعة البيانات في البرنامج MCR_main20 من خلال الزر تحديد البيانات.
- اختر عدد المكونات (من ثلاثة إلى ثمانية) بالنقر فوق الزر تحديد عدد المكونات.
- انقر فوق الزر Pure ضمن علامة التبويب تقدير أولي، وحدد تركيز ضمن علامة التبويب اتجاه تحديد المتغير، وانقر فوق الزر "القيام".
- انقر فوق الزر موافق ثم الزر متابعة إلى الصفحة التالية.
- انقر فوق متابعة في الصفحة التالية ثم حدد fnnls و 6 ضمن تطبيق و Nr. من الأنواع مع التشكيلات الجانبية غير السلبية، على التوالي. انقر فوق الزر متابعة.
- اختر نفس المعلمات مثل القسم 4.3.5 لهذه الصفحة وانقر فوق متابعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة السريرية، تم جمع الأطياف رامان في الجسم الحي البؤري من 28 موضوعا ً تتراوح أعمارهم بين 4 و18 سنة. وقد جُمع ما مجموعه 862 30 أطياف رامان مع بروتوكول جمع البيانات المذكور أعلاه. تحتوي مجموعة البيانات الطيفية الكبيرة هذه على 20% من القيم الخارجية الطيفية كما هو موضح في الشكل 4ألف. تمت إزالة الأطياف الخارجية المنخفضة للإشارة إلى الضوضاء بعد تحديد سطح الجلد، تليها PCA لتحديد الأطياف مع ميزات ضوء الغرفة. العامل الثالث في هذا النموذج PCA هو تحديد قمم ضوء الغرفة. ويتأكد ذلك من خلال مقارنة أطياف التحميل للعامل 3 مع طيف من ضوء غرفة الفلورسنت الذي تم جمعه بشكل منفصل في موقع الدراسة باستخدام نفس أداة رامان البؤرية (انظر الشكل التكميلي 3). الشكل 4 يشير B إلى أن معظم الأطياف الخارجية تمت إزالتها بعد هذه العملية.
تم تنفيذ PCA على مجموعة بيانات رامان البؤرية المعالجة مسبقاً ويتم رسم قيمة eigenvalue مع عدد العوامل المستخدمة في الشكل 5. وفقا للدراسات السابقة12,19, يجب أن يتضمن النموذج على الأقل ثلاثة مكونات: الماء, البروتين, والدهون. ولوحظ انخفاض كبير في قيمة eigenفي العامل 9 كما هو مبين في الشكل 5. وتقترح هذه الملاحظة نماذج للتحقيق يتراوح عدد المكونات الرئيسية بين ثلاثة وثمانية عوامل لإدراجها في نموذج الرصد والمراقبة. يتم عرض تحميل MCR التي تحتوي على ميزات مطيافية الأكثر اتساقا مع البروتين والماء والدهون في الشكل 6.
الشكل 1 . رسم توضيحي للآفة وعلامة غير آفة على الساعد. (أ)مساحة 3 سم × 4 سم على موقع الآفة. (ب)مساحة 3 سم × 4 سم على موقع غير الآفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 . رسم توضيحي لجمع بيانات رامان. (أ)أداة رامان البؤرية. (ب)جمع الأطياف على الساعد من موضوع الإنسان. (C)لقطة شاشة لتحديد الموضع المرجعي لجمع البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 . تحديد سطح الجلد. (أ)دمج منطقة البروتين تحت كل طيف رامان. (ب)وضع سطح الجلد على أساس الحد الأقصى والحد الأدنى من النقاط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 . رامان dataset الأطياف. (أ)مطياب رامان قبل إزالة الأطياف الخارجية. (ب)الأطياف رامان كونفوكال بعد إزالة الأطياف الخارجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 . تحديد عدد المكونات من تحليل الأنيكل الخماسي الكلور. (أ)قيمة Eigenعلى مقياس لوغاريتمي مرسومة كدالة لعدد المكونات المستخدمة في نموذج PCA. (B)الفرق في القيم eigenvalues بين 'ن' و 'ن + 1' المكونات الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 . مقارنة شكل التحميل مع أطياف المواد المرجعية المقابلة مع ثلاثة إلى ثمانية مكونات في نموذج MCR. (أ)البروتين،(ب)الماء، و(ج)شكل عوامل الدهون مع ثلاثة إلى ثمانية مكونات في نموذج MCR مقارنة مع BSA، الماء، وأطياف المواد المرجعية للدهون، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 . لم يتم استخدام التحميلات الثلاثة الإضافية من طراز MCR المكون الستة في الطراز النهائي. وتهيمن على هذه المكونات الثلاثة MCR من قبل الفلورة والقطع الأثرية خط الأساس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. توضيح لتحديد سطح الجلد حيث مركز التركيز الليزر يمس الجلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2. رسم توضيحي لاختيار ثلاثة مكونات في تحليل PCA لبرنامج PLS_Toolbox. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3. تحديد عامل التحميل الذي يهيمن عليه ضوء الغرفة المفروض على طيف مرجعي من ضوء الغرفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 4. مقارنة التحميلات من نموذج MCR قبل وبعد إزالة الأشعة الكونية. (أ)و(ب)و(ج)هي العوامل التي تمثل الماء والبروتين والدهون على التوالي. عوامل التحميل الإضافية غير المستخدمة في نموذج MCR النهائي هي d, e, و f. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 5. رامان أطياف من المواد الدهنية النموذجية في الطبقة القرنية. (أ)الكوليسترول 3 كبريتات الصوديوم والكوليسترول. (ب)الأوليك، بالميتيك، بالميتوليك، وحامض دهني. (ج)سكوالين. (د)ن-بيهينويل-د-اريثرو-سفنغوسين، ن-ليغنوسرويل-د-اريثرو-سفنجانين، ودي-اريثرو-ديهيروسفينغوزين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء جمع البيانات، كما هو موضح في القسمين 2 و3 من البروتوكول، تم جمع كل ملف عمق في منطقة مع اتصال بين نافذة الصك والجلد من خلال العثور على المناطق الداكنة من الصور المجهرية التي تم تسليط الضوء عليها في الدوائر الحمراء في الشكل 2جيم وبمجرد تحديد هذه المناطق، كان من الضروري بدء ملف عمق فوق سطح الجلد لتحديد موقع سطح الجلد بدقة لإجراء تحليل البيانات. وقد استُخدم موقع سطح الجلد فيما بعد لتحديد العمق النسبي لكل طيف في ملف العمق المقابل. كما هو مذكور في القسم 1 من البروتوكول، بدء ملف تعريف العمق 10 ميكرومتر فوق سطح الجلد ينتج خمس نقاط بيانات خارج الجلد. وهذا يسمح لتحديد مواقع الحد الأقصى والحد الأدنى من كثافة الإشارة على كلا الجانبين من سطح الجلد. من المهم أيضًا تجنب قياس المواقع التي تحتوي على علامات القلم والمناطق المصطبغة الأعلى مثل النمش، لأن هذه المناطق تنتج إشارة خلفية عالية الفلورة. واختيار وقت التعرض هو توازن بين الجودة الطيفية ومدة القياس. يعمل وقت التعرض الأطول على تحسين الإشارة إلى الضوضاء ويزيد بشكل كبير من وقت القياس الإجمالي. ومع ذلك، يجد العديد من المواضيع صعوبة في البقاء بلا حراك لفترات طويلة من الزمن. وهذا يشكل تحديا ً كبيراً للأطفال، على سبيل المثال. زيادة قوة الليزر يزيد من إشارة إلى الضوضاء. ومع ذلك، فإن الكثير من الطاقة يمكن أن تضر الجلد بسبب امتصاص الطاقة. ولا يمكن تجاوز الحد الأقصى للتعرض المسموح به، وهو قوة الليزر التي تبلغ قدرتها 17 مالقوة على النحو المحدد في المعيار الوطني الصيني (GB 7247.1-2012)، والمعيار الدولي للسلامة بالليزر (IEC 60285-1:2007؛ و20 م.ل.م.ل. لـ 671 نانومتر و/لتر/30 كيلوواط لـ 785 نانومتر. وتشمل احتياطات السلامة الأخرى ضمان أن كل موضوع يرتدي حماية العين قبل الحصول على البيانات، وأن مواقع الجسم لديها زاوية طبولوجيا فردية (ITA) قيمة أعلى من 40، وتجنب المناطق مع تصبغ الجلد عالية.
لتحديد موقع سطح الجلد، تم دمج المنطقة تحت البروتين رامان الذروة (2910-2965 سم-1)للحصول على ملف عمق إشارة البروتين. تم تصحيح أطياف رامان أولاً باستخدام الطريقة المؤتمتة الأقل مربعًا من الثابتة والمتنقلة قبل دمج القمم. تم استيفاء نقاط البيانات الـ 26 من ملف تعريف عمق واحد إلى 260 نقطة باستخدام طريقة لينسبيس للأداة المقابلة vaue (قيمة المحور س في الشكل 3A)وطريقة الشريحة لقيمة الكثافة المقابلة. وقد تم الاستيفاء بين البيانات الناتجة عن ذلك على متعدد الحدود منالدرجة العشرين باستخدام الوظائف المتعددة الملاءمة والمتعددة الصمامات في MATLAB، وتم تحديد الحد الأقصى والحد الأدنى من النقاط الأدنى للبيانات المحرفة. تم حساب متوسط قيمة الكثافة بقسمة مجموع القيم القصوى والدنيا على 2. تم تعريف سطح الجلد بأنه الموقع حيث كانت قيمة الكثافة من ملف عمق الاستيفاء الأقرب إلى متوسط الكثافة. الموقع الدقيق لسطح الجلد لا يحتاج إلى أن يتزامن مع نقطة بيانات تجريبية. هذه الطريقة يمكن قياس فقط عمق محدود من الجلد بسبب امتصاص وتشتت شعاع21. قد يتطلب جمع البيانات الطيفية أقل من 50 ميكرومتر تحت سطح الجلد تغييرات كبيرة في المعلمات التجريبية.
وكما هو موضح في الفرع 3 من البروتوكول، وبعد إزالة الأطياف الخارجية ذات الإشارات المنخفضة إلى الضوضاء والمساهمة العالية من أضواء الغرف، ظل جزء صغير من الأطياف التي تحتوي على الأشعة الكونية في مجموعة البيانات. وترد مقارنة بين أطياف التحميل التي تم إنشاؤها قبل وبعد إزالة الأشعة الكونية في الشكل التكميلي 4. وتشير مقارنة بين أطياف التحميل المبينة في الشكل التكميلي 4 إلى أن تأثير عدد صغير من الأطياف مع الأشعة الكونية كان ضئيلاً. وكانت العوامل الثلاثة التي تمثل الماء والبروتين والدهون متطابقة، وكانت التحميلات الثلاثة الإضافية المرتبطة بالضوضاء والقطع الأثرية الطيفية متشابهة جداً أيضاً. ويمكن أن يعزى ذلك إلى انخفاض حدوث الأشعة الكونية في الأطياف (حوالي 0.25٪) لأن موقع الأشعة الكونية في الأطياف عشوائي.
إن اختيار عدد المكونات المستخدمة في تحليل الـ MCR أمر بالغ الأهمية، لأن تفسير شكل التحميلات من حيث الأنواع الجزيئية المقابلة المسؤولة عن كل تحميل يؤثر بشكل كبير على كيفية النتيجة المقابلة يتم استخدام القيم وأداء الأسلوب الكلي. وكما هو موضح في الفرع 4 من البروتوكول، أُجريت أولاً دراسة تطور قيمة الأيجين المرتبط بزيادة عدد المكونات. وقد استُخدم هذا التحقيق لتحديد عدد المكونات التي ينبغي استخدامها في تحليل الـ MCR التالي. يمكن أن يؤدي رسم قيمة eigenvalue على مقياس لوغاريتمي إلى جعل عملية تحديد الهوية هذه أسهل من فحص القيم الأولية، كما هو موضح في الشكل 5A. كل قيمة eigenvalue هو تمثيل التباين الذي يمكن التقاط مكون واحد. كلما كانت قيمة eigenvalue أكبر، كلما زاد التباين الذي يمكن لهذا المكون أن يُنمذجه في الأطياف. يجب اختيار Eigenvalues مع حجم مماثل أو القضاء عليها معا22. وباتباع هذا المبدأ التوجيهي، تم النظر في مكونين وخمسة وثمانية عناصر لتحليل الـ MCR لأن المكونات الثلاثة وأربعة وخمسة تنتج قيم eigenvalues مماثلة في الحجم. ولوحظ أيضا اتجاه مماثل للعناصر ستة وسبعة وثمانية. الشكل 5 B هي مؤامرة للفرق في القيم الذاتية بين مكونات 'n' و 'n+1' التي تظهر الأقصى المحلي بعد المكونات الثانية والخامسة والثامنة. المعرفة السابقة حول التركيب الجزيئي للبشرة جنبا إلى جنب مع تصميم الدراسة يدعم ما لا يقل عن ثلاثة مكونات المطلوبة لنمذجة الأطياف رامان عالية التردد. ولذلك، تم التحقيق في نماذج متعددة من المواد العضوية المكلورة متعددة تحتوي على ثلاثة إلى ثمانية مكونات وقارنت عمليات التحميل بالأطياف من المواد المرجعية لتحديد المكونات الرئيسية المطلوبة للنموذج النهائي.
مقارنة التحميلات مع أطياف رامان من المواد المرجعية تسمح بسهولة تحديد وتعيين اثنين من مكونات MCR النهائية للبروتين والماء لأنها تهيمن على تحميل MCR لجميع النماذج التي تم اختبارها وتطابق المرجع المقابل الأطياف، والتي هي BSA وDI المياه. ومع ذلك، فإن الخصائص الطيفية المتوقعة للدهون في بعض مكونات MCR كانت أضعف من الطيف المرجعي للدهون الموضح في نماذج MCR التي تحتوي على ثلاثة وأربعة مكونات. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت قمم البروتين المتبقية (2840-3000 سم-1)في تحميل المياه MCR لجميع النماذج التي تم اختبارها تحت ستة مكونات. واستناداً إلى هذه الملاحظات، استُخدم نموذج مكون من ستة مكونات في التحليل النهائي للرصد والمراقبة. وقد تم تخصيص ثلاثة من المكونات الستة للمياه والبروتين والدهون عن طريق مطابقة طيف التحميل الخاص بها مع الطيف المرجعي المقابل. ويستند تفسير وتعيين عامل الدهون على مقارنة التحميل إلى أطياف رامان من ثلاث مواد سيراميد ممثل، بما في ذلك N-behenoyl-D-erythro-sphingosine، N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine، و د-اريثرو-ديهيروسفينغوسين. كما تم فحص أطياف رامان من المواد الدهنية الأخرى في الطبقة القرنية. وتشمل هذه المواد الأحماض الدهنية (الأوليك، بالميتيك، بالميتوليك، وحامض دهني)، والكوليسترول (الكوليسترول 3 كبريتات الصوديوم والكوليسترول)، والسكوالين، كما هو مبين في الشكل التكميلي 5. وكان عامل الدهون المستخدم في نموذج MCR النهائي مباراة قوية لأطياف سيراميد ويتسق مع المواد الأخرى التي تحتوي على الهيدروكربونات سلسلة طويلة. أما المكونات الثلاثة الأخرى لـ MCR فقد هيمنت عليها الفلورة والقطع الأثرية الأساسية ولم تستخدم قيم نقاطها المقابلة في أي حسابات. وترد هذه المكونات الثلاثة في الشكل 7.
ينتج نهج التحليل العام المعروض في هذه المخطوطة طريقة نهائية مع تحسين الخصوصية والدقة لقياس المكونات الرئيسية في الجلد مقارنة بنهج الذروة أو الذروة الأخرى. وتبين هذه المنهجية أنه يمكن استخراج المكونات الحرجة من مجموعة بيانات سريرية تحتوي على جزء صغير نسبياً من الأطياف السيئة. وتركز الجهود المقبلة على التشغيل الآلي لهذه المنهجية في مجموعة برامجحاسوبية لتحسين كفاءتها وتقليل كمية الخبرة التقنية اللازمة للتحليل. ويجري وضع منهجية مماثلة لأطياف رامان التي تم جمعها في منطقة بصمات الأصابع (400-1800 سم-1)باستخدام مصدر ليزر 785 نانومتر بدلاً من الليزر 671 نانومتر المدمجة في نفس الأداة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويقر المؤلفون إلى حد كبير بالدعم المالي المقدم من قسم الرعاية التحليلية والتطهير الشخصي للوظائف المؤسسية. ونود أن نعرب عن امتناننا للمديرين المعاوبين التحليليين السيدة ياسمين وانغ والدكتور روب غاردنر على توجيههم ودعمهم، والسيدة لي يانغ على مساعدتها في جمع البيانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
