Summary
Her præsenterer vi en protokol for indsamling af konfokale Raman Spectra fra mennesker i kliniske studier kombineret med chemometriske tilgange til spektral outlier fjernelse og den efterfølgende udvinding af nøglefunktioner.
Abstract
Udvikling af denne in vivo konfokale Raman spektroskopiske metode muliggør direkte måling af vand, proteiner og lipiderne med dybde opløsning hos mennesker. Disse oplysninger er meget vigtige for hudrelaterede sygdomme og kendetegner hudpleje produktets ydeevne. Denne protokol illustrerer en metode til Konfokal Raman Spectra kollektion og den efterfølgende analyse af spektral datasæt, der udnytter chemometrics. Formålet med denne metode er at etablere en standardprotokol for dataindsamling og give generelle retningslinjer for dataanalyse. Forbehandling (f. eks. fjernelse af outlier Spectra) er et afgørende skridt ved behandling af store datasæt fra kliniske studier. Som et eksempel giver vi vejledning baseret på forudgående kendskab til et datasæt for at identificere typerne af afvigende værdier og udvikle specifikke strategier til at fjerne dem. Der udføres en hovedkomponent analyse, og belastnings spektrene sammenlignes med spektre fra referencematerialer for at vælge det antal komponenter, der anvendes i den endelige multivariat kurve opløsning (MCR)-analyse. Denne fremgangsmåde er vellykket til udvinding af meningsfulde oplysninger fra et stort spektral datasæt.
Introduction
I kliniske studier har in vivo konfokale Raman spectroskopi vist sin unikke evne til at bestemme stratum corneum tykkelse og vandindhold1,2,3,4, og spore penetration af aktive materialer topisk påføres huden5,6. Som en ikke-invasiv tilgang detekterer konfokale Raman spectroskopi molekylære signaler baseret på vibrationelle tilstande. Således, mærkning er ikke nødvendig7. In vivo konfokale Raman spectroskopi giver kemisk information med dybde opløsning baseret på den konfokale karakter af teknikken. Denne dybde-afhængige oplysninger er meget nyttigt i at studere virkningerne af hudplejeprodukter4,8, aging9,10, sæson ændringer3, samt hud barriere funktion sygdomme, såsom atopisk dermatitis11,12. Der er en masse information i højfrekvens regionen af konfokale Raman spektroskopi (2500 – 4000 cm-1), hvor vand producerer forskellige toppe i regionen mellem 3250-3550 cm-1. Raman toppe af proteiner og lipider, som er centreret mellem ca. 2800-3000 cm-1, overlapper hinanden, fordi signalerne hovedsageligt produceres fra methylen (-CH2-) og methyl (-CH3) grupper13 . Disse overlappende oplysninger udgør en teknisk udfordring ved opnåelse af relative mængder af individuelle molekylære arter. Topmontering14,15 og selektiv peak position12,16 tilgange er blevet brugt til at løse denne udfordring. Men, det er vanskeligt for disse enkelt peak-baserede metoder til at udtrække ren komponentoplysninger, fordi flere Raman toppe fra samme komponent ændring samtidig17. I vores nylige publikation18blev en MCR-tilgang foreslået for at belyse den rene komponent information. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev tre komponenter (vand, proteiner og lipider) udvundet fra et stort in vivo konfokale Raman spektroskopisk datasæt.
Gennemførelsen af store kliniske undersøgelser kan være krævende for enkeltpersoner at indsamle in vivo spektroskopiske data. I nogle tilfælde kan spektral erhvervelse kræve driftsudstyr i mange timer på en dag, og undersøgelsen kan strække sig op til uger eller måneder. Under disse omstændigheder kan spektroskopiske data genereres af udstyrs operatører, der mangler den tekniske ekspertise til at identificere, udelukke og korrigere for alle kilder til spektroskopiske artefakter. Det resulterende datasæt kan indeholde en lille brøkdel af spektroskopiske afvigende værdier, som skal identificeres og udelukkes fra data forud for analysen. Dette papir illustrerer i detaljer en chemometrisk analyse proces for at "rydde op" et klinisk Raman datasæt, før du analyserer data med MCR. For at kunne fjerne outliers, skal typerne af afvigende værdier og den potentielle årsag til genereringen af outlier Spectra identificeres. Derefter, en specifik tilgang kan udvikles til at fjerne de målrettede outliers. Dette kræver forudgående kendskab til datasættet, herunder en detaljeret forståelse af datagenererings processen og undersøgelsens design. I dette datasæt er størstedelen af afvigende værdier lav signal-til-støj-spektre og stammer primært fra 1) spektre indsamlet over hudens overflade (6.208 ud af 30.862) og 2) stærkt bidrag til spektret fra fluorescerende rum-lys (67 ud af 30.862). Spektre indsamlet over hudens overflade giver et svagt Raman-respons, da laser brændpunktet nærmer sig hudens overflade og er for det meste i instrument vinduet under huden. Spectra med et stærkt bidrag fra fluorescerende rum lys genereres på grund af enten instrument operatør fejl eller motiv bevægelse, som frembringer en tilstand, hvor konfokale Raman Collection vinduet ikke er fuldt dækket af motivet krop site. Selv om disse typer af spektral artefakter kunne identificeres og aflæres under spektral erhvervelse af en spektroskopisk ekspert på tidspunktet for dataindsamlingen, blev de uddannede instrument operatører, der anvendes i dette studie, instrueret om at indsamle alle data, medmindre en katastrofale svigt blev observeret. Opgaven med at identificere og udelukke afvigende værdier er indarbejdet i dataanalyse protokollen. Den forelagte protokol er udarbejdet for at løse denne udfordring. For at adressere det lave signal-til-støj-spektre over hudoverfladen skal placeringen af hudens overflade bestemmes først for at tillade fjernelse af spektre indsamlet over hudens overflade. Placeringen af hudens overflade defineres som dybden, hvor Raman laser brændpunktet er halvt i huden og halvt ud af huden som illustreret i supplerende figur 1. Efter fjernelse af lav signal-støj-spektre, en hovedkomponent analyse (PCA) er implementeret for at udtrække den faktor domineret af fluorescerende rum lys toppe. Disse afvigende værdier fjernes baseret på score værdien af den tilsvarende faktor.
Denne protokol indeholder detaljerede oplysninger om, hvordan seks hovedkomponenter bestemmes i MCR-processen. Dette sker gennem en PCA-analyse efterfulgt af spektral form sammenligning mellem belastningerne for modeller genereret med et forskelligt antal hovedkomponenter. Den eksperimentelle proces for dataindsamling af referencematerialer samt de menneskelige er også forklaret i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle undersøgelsesudvalg for børnehospitalet i Beijing i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Helsingfors-erklæringen fra 1975. Det blev udført i henhold til ICH retningslinjer for god klinisk praksis. Undersøgelsen fandt sted fra maj til juli 2015.
1. indsamling af in vivo konfokale Raman Spectra fra forsøgspersoner med atopisk dermatitis
- Omfatte emner i overensstemmelse med følgende kriterier.
- Inkluder personer i alderen 4 – 18 år.
- Inkluder personer med mild til moderat atopisk dermatitis (score på 2 eller 3 i henhold til lægens globale vurdering) med aktive sygdomssymptomer på 5% – 30% af kroppens overflade, med mindst to læsioner på armene.
- Medtag emner, der er ved godt helbred, eksklusive symptomer direkte relateret til ANNONCEN sygdom.
- Omfatte emner, der giver skriftlig informeret samtykke.
- Medtag emner, der har en enkelt topologi-vinkel (ITA) højere end 40 på test placeringen.
- Udelad emner, der opfylder et af følgende kriterier.
- Udelukke personer, der enten i øjeblikket deltager eller tidligere har deltaget i et klinisk studie på et forsøgslaboratorium inden for de foregående 4 uger.
- Udelukke personer med kræft, eller som er blevet diagnosticeret eller behandlet for kræft inden for 5 år før studiet.
- Udelukke diabetiske.
- Udelukke personer, der har en immunologisk eller infektionssygdom, der kan sætte forsøgspersonerne i fare eller forstyrre nøjagtigheden af undersøgelsens resultater (dvs. hepatitis, tuberkulose, HIV, AIDS, lupus eller reumatoid arthritis).
- Udelukke emner, der har hudlidelser, der kan forstyrre instrumentelle målinger eller vil forhindre en klar vurdering af huden kun til atopisk dermatitis. Eksempler omfatter ekstremt tør hud, beskadiget hud, nedskæringer, ridser, solskoldning, modermærker, tatoveringer, omfattende ardannelse, udslæt, overdreven hårvækst, eller acne.
- Udelukke emner, der bruger orale Immunsuppressive lægemidler, antibiotika, eller andre systemiske behandlinger inden for den seneste måned, bortset fra mindre tranquilizers.
- Udelukke forsøgspersoner med andre medicinske tilstande, som efter investigators opfattelse udelukker dem fra at deltage i studiet.
- Udelukke personer med højere pigmentering i testområdet.
- Mærk læsionsområdet for deltager i atopisk dermatitis, og Marker det med et 3 cm x 4 cm-område på eller i nærheden af læsionsstedet som vist i figur 1a.
- Etiketten ikke-læsionsområdet med samme markør i modpartens kropsside (f. eks. venstre underarm vs. højre underarm) som vist i figur 1B.
- Placer det markerede krops sted i tæt kontakt med vinduet på in vivo konfokale Raman-instrumentet som vist i figur 2A og figur 2B. Dække hele vinduet for at undgå virkningen af rum lys på kroppen site.
- Udfør Raman-dataindsamlingen.
Bemærk: instrumentet har en spektral opløsning på 2 cm-1 og 50x mikroskopi mål (NA = 0,9 olie nedsænkning), ved hjælp af en 671 nm laser med en effekt på 17 MW. Bølgelængde er kalibreret ved hjælp af spektret af en indbygget neon-argon lampe. Intensiteten kalibrering udføres ved at måle spektret af en NIST (National Institute of Standards) glas kalibrering standard.- Flyt fokus, indtil et spektrum som illustreret i figur 2C observeres, og flyt derefter fokus væk fra hudens overflade 10 μm.
- Start dataindsamlingen i 26 trin med en 2 μm trin størrelse i frekvensområdet 2.510 cm-1– 4.000 cm-1 . Brug en eksponeringstid på 1 s og mål otte replikater for hvert område, som varer ~ 10 – 15 min i alt.
2. indsamling af konfokale Raman Spectra fra referencematerialer
- Placer reference materialerne, de vigtigste bestanddele i den humane hudstratum corneum19, på vinduet af konfokale Raman-instrumentet (Se tabel over materialer: bovin serum albumin (BSA), deioniseret vand (di-vand), ceramid, kolesterol, gratis fedtsyre og squalen).
- Indsaml reference materialernes Raman Spectra fortløbende fra materialets ydermateriale til materiale centeret ved hjælp af de samme indsamlings parametre som beskrevet ovenfor.
- Integrer området under hvert Raman Spectra mellem intervallet 2510 cm-1 og Identificer de tre største maksimumværdi punkter i disse 26 målinger. Gennemsnitligt Raman Spectra fra disse tre punkter for at opnå det endelige referencemateriale Spectra.
3. fjernelse af outlier Spectra gennem kemo ometrisk analyse
- Bestem hudens overflade, og fjern spektrene ud af huden.
- Rediger filtypenavnet fra '. Ric ' til '. mat ', og Indlæs. mat-filen på MATLAB-softwareplatformen.
- Ret den oprindelige plan ved hjælp af Oprindelig plan (automatisk vægtede mindste kvadrater) ved at højreklikke på det importerede datasæt under analysér | Andre værktøjer | Forbehandling i PLS_Toolbox software med standardindstilling.
- Summen af værdierne mellem 2910-2965 cm-1 for at opnå intensitetsværdierne under hvert Raman spektrum fra de 26 trin målinger som vist i figur 3A via funktionen Sum i MATLAB.
- Interpolere instrumentets offset-værdi (værdi i X-aksen i figur 3B) fra 26 – 260 ved hjælp af LINSPACE -funktionen i MATLAB.
- Interpolere intensitetsværdien fra 26 til 260 ved hjælp af spline -metoden i MATLAB, der udnytter de nyligt genererede 260 positionsværdier.
- Brug MATLABS polyfit og polyval funktioner til at få det nye sæt af intensitetsværdier med 260 point. Brug først 260-positionen og intensitetsværdierne som X-og Y-indgange for henholdsvis polyfit -funktionen. Indstil graden værdi til 20. Brug derefter output koefficienterne og de 260 udvidede positionsværdier som input for polyval for at opnå de endelige 260 intensitetsværdier.
- Brug MATLABS Max -og min -funktioner til at identificere maksimum-og minimum point fra de nyligt interpolerede 260-intensitetsværdier.
- Beregn middelintensitets værdien ved at dividere summen af maksimum-og minimums intensitetsværdien med to.
- Identificer intensitetsværdien fra 260-intensitetsværdierne (beregnet fra trin 3.1.6), der er tættest på middelintensitets værdien, og Angiv den tilsvarende positionsværdi som hudoverfladen. Angiv denne positionsværdi som nulpunktet i X-aksen som illustreret i figur 3B.
- Ændre alle de andre positionsværdier i henhold til nulpunktet og den kendte 2 μm trin størrelse.
- Fjern alle spektre, som er opsamlet over hudens overflade, i henhold til deres positionsværdi.
- Importer resten af dataene til PLS_Toolbox for at oprette et datasæt og omdøbe det "RamanData. mat".
- Fjern den outlier Spectra med rummet lyseffekt.
- Indlæs Raman Spectra DataSet (RamanData. mat) efter fjernelse af out-of-Skin-spektrene, og implementer PCA-analysen.
- Indlæs datasættet i PLS_Toolbox-softwaren under MATLAB-platformen, og højreklik på datasættet for at vælge analysér | PCA.
- Vælg Normaliser som forbehandlings metode, og vælg ingen til kryds valideringen.
- Brug de tre komponenter til PCA-nedbrydnings analysen som vist i supplerende figur 2.
- Fjern dækslet på det in vivo Raman Instruments opsamlings vindue, og saml rummet Light Spectra i højfrekvensområdet ved hjælp af de samme parametre, der anvendes til indsamling af referencematerialer.
- Identificer rummet lyseffekt faktor gennem sammenligning med rummet lys baggrund spektre som vist i supplerende figur 3.
- Fjern spektrene med en signifikant højere tilsvarende scoreværdi end normalt (mere end 99,8% af score værdierne for hele datasættet, som er 0,16 i dette studie).
4. udvælgelse af antallet af komponenter i MCR-nedbrydnings analyse
- Ret Raman Spectra baseline ved hjælp af samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor (afsnit 3.1.2).
- Udfør PCA-analysen på det forbehandlede datasæt som beskrevet ovenfor (afsnit 3,2), bortset fra at vælge "PQN" – "Mean Center" i stedet for "normalisere", og afbilde egenværdierne i logaritmisk skala sammen med antallet af komponenter (20) som standardnummer i nedbrydnings analysen ved at klikke på knappen Vælg komponenter og vælge Log (eigenvalues) som Y-værdi. Vælg mellem tre og otte som antallet af komponenter, der bruges til MCR-analysen.
- Udføre MCR-analyse.
- Indlæs datasættet i MCR_main-softwaren20 via knappen til valg af oplysninger .
- Vælg antallet af komponenter (tre til otte) ved at klikke på bestemmelsen af antallet af komponenter knappen.
- Klik på knappen ren under fanen Initial estimering , Vælg koncentration under retningen af fanen variabel valg , og klik på knappen do .
- Klik på knappen OK og derefter på knappen Fortsæt til næste side.
- Klik på Fortsæt på næste side, og vælg derefter fnnls og 6 under implementeringen og nr. af arter med fanerne ikke-negativitet profiler . Klik på knappen Fortsæt .
- Vælg de samme parametre som afsnit 4.3.5 for denne side, og klik på Fortsæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette kliniske studie blev in vivo konfokale Raman Spectra indsamlet fra 28 personer fra 4 – 18 år. I alt 30.862 Raman Spectra blev indsamlet med den ovennævnte dataindsamlings protokol. Dette store spektral datasæt indeholder 20% spektral outliers som vist i figur 4A. Den lave signal-til-støj outlier Spectra blev fjernet efter bestemmelse af hudens overflade, efterfulgt af PCA til at identificere spektrene med rum lys funktioner. Den tredje faktor i denne PCA-model er identificeret rum lys toppe. Dette bekræftes ved sammenligning af belastnings spektrene for faktor 3 med et spektrum af lysstofrør, der indsamles separat på forsøgsstedet ved hjælp af det samme konfokale Raman-instrument (Se supplerende figur 3). Figur 4 B indikerer, at det meste af outlier Spectra blev fjernet efter denne proces.
PCA blev udført på det præbehandlede konfokale Raman-datasæt, og egenværdi sammen med antallet af anvendte faktorer er afbildet i figur 5. Ifølge tidligere undersøgelser12,19, modellen bør omfatte mindst tre komponenter: vand, protein, og lipid. Der blev observeret et signifikant fald i egenværdi for faktor 9 som vist i figur 5. Denne observation foreslår, at man undersøger modeller med antallet af hovedkomponenter, som varierer mellem tre og otte faktorer, som indgår i MCR-modellen. MCR-belastninger, som indeholder spektroskopiske funktioner, der er mest konsistente med protein, vand og lipid, er vist i figur 6.
Figur 1 . Illustration af læsion og ikke-læsions mærke på underarm. A) et afmærket område på 3 cm x 4 cm på et læsions sted. B) et afmærket område på 3 cm x 4 cm på et ikke-læsions sted. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Illustration af dataindsamlingen i konfokale Raman. A) Konfokal Raman-instrumentet. B) spektra indsamling på under armen af menneskelige. C) et skærmbillede til bestemmelse af Referencepositionen for dataindsamlingen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Bestemmelse af hudens overflade. A) integration af protein området under hvert Raman spektrum. B) indstilling af hudoverfladen baseret på maksimums-og minimums punkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Raman DataSet Spectra. (A) Konfokal Raman Spectra før fjernelse af outlier Spectra. B) Konfokal Raman Spectra efter fjernelse af outlier Spectra. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Bestemmelse af antallet af komponenter fra PCA-analyse. A) egenværdi på en logaritmisk skala afbildet som en funktion af det antal komponenter, der anvendes i PCA-modellen. B) forskel i egenværdi, mellem» n «-og» n + 1 «-komponenterne Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Sammenligning af belastnings formen med de tilsvarende referencematerialer» Spectra med tre til otte komponenter i MCR-modellen. (A) protein, (B) vand, og (C) lipid faktorer form med tre til otte komponenter i MCR model sammenlignet med BSA, vand, og lipid referencematerialer ' Spectra, hhv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . De yderligere tre belastninger fra den seks komponent MCR-model, der ikke blev anvendt i den endelige model. Disse tre MCR-komponenter domineres af fluorescens og baseline artefakter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Illustration af bestemmelsen af hudens overflade, hvor centrum af laser fokus rører huden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2. Illustration af udvælgelsen af tre komponenter i PLS_Toolbox-softwaren PCA Analysis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3. Identifikation af belastningsfaktoren domineret af lokale lys overlejret på et referencespektrum af rum lys. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 4. Sammenligning af belastninger fra MCR-modellen før og efter fjernelse af kosmiske stråler. (A), (B) og (C) er de faktorer, der repræsenterer henholdsvis vand, protein og lipid. De yderligere Belastningsfaktorer, der ikke anvendes i den endelige MCR-model, er d, e og f. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 5. Raman Spectra af typiske lipidmaterialer i stratum corneum. (A) kolesterol 3-sulfat natrium og kolesterol. B) olie-, palmitinsyre-, palæolinsyre-og stearinsyre. (C) squalen. D) n-behenoyl-d-Erythro-sphingosin, n-Lignoceroyl-d-Erythro-sphinganine og d-Erythro-Dihyrosphingosin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under dataindsamlingen, som beskrevet i afsnit 2 og 3 i protokollen, blev hver dybde profil indsamlet i et område med kontakt mellem instrument vinduet og huden ved at finde de mørkere områder fra de mikroskopiske billeder, der er fremhævet i de røde cirkler i Figur 2C. Når disse områder var placeret, det var vigtigt at starte dybden profil over hudens overflade til præcist at bestemme placeringen af hudens overflade for dataanalyse procedure. Placeringen af hudoverfladen blev efterfølgende anvendt til at bestemme den relative dybde af hvert spektrum i den tilsvarende dybde profil. Som nævnt i punkt 1 i protokollen, starter dybde profilen 10 μm over hudens overflade frembringer fem datapunkter uden for huden. Dette giver mulighed for med succes at bestemme placeringen af den maksimale og minimale signalintensitet på begge sider af hudens overflade. Det er også vigtigt at undgå at målesteder, der indeholder pennemærker og højere pigmenterede områder som fregner, fordi disse områder producerer et højt fluorescens baggrunds signal. Udvælgelsen af eksponeringstid er en balance mellem spektral kvalitet og måle varighed. Længere eksponeringstid forbedrer signal-til-støj og øger den samlede måle tid betydeligt. Men mange emner finder det udfordrende at forblive ubevægelig i længere perioder. Dette er for eksempel yderst udfordrende for børn. Stigende laser effekt øger signal-til-støj. Men for meget magt kan beskadige huden på grund af absorptionen af energien. Den maksimalt tilladte eksponering, 17 mW Laser effekt som defineret af den kinesiske nationale standard (GB 7247.1-2012) og den internationale laser sikkerhedsstandard (IEC 60285-1:2007; < 20 mW for 671 nm og < 30 mW for 785 nm) kan ikke overskrides. Andre sikkerhedsforanstaltninger omfatter at sikre, at hvert emne er iført Øjenværn forud for dataindsamling, at kroppen sites har en individuel topologi vinkel (ITA) værdi højere end 40, og undgå områder med høj hud pigmentering.
For at bestemme placeringen af hudens overflade, blev området under proteinet Raman Peak (2910-2965 cm-1) integreret for at opnå dybde profilen af protein signalet. Raman Spectra var første baseline-korrigeret ved hjælp af den automatiserede vægtede mindste kvadratiske metode fra PLS_Toolbox før integrationen af toppene. De 26 datapunkter fra en dybde profil blev interpoleret til 260 punkter ved hjælp af linspace -metoden for instrumentets offset værdi (X-akse-værdi i figur 3A) og spline -metoden for den tilsvarende intensitetsværdi. De resulterende data blev interpoleret på en 20th Order polynomium ved hjælp af polyfit og polyval funktioner i MATLAB og den maksimale og mindste punkter af de interpolerede data blev fastlagt. Den gennemsnitlige intensitetsværdi blev beregnet ved at dividere summen af maksimum-og minimumsværdierne med 2. Hudoverfladen blev defineret som det sted, hvor intensitetsværdien fra den interpolerede dybde profil var tættest på den gennemsnitlige intensitet. Den nøjagtige placering af hudens overflade behøver ikke at falde sammen med et eksperimentelt datapunkt. Denne metode kan kun måle en begrænset dybde af huden på grund af absorption og spredning af strålen21. Indsamling af spektroskopiske data nedenfor ~ 50 μm under hudens overflade kan kræve betydelige ændringer i de eksperimentelle parametre.
Som beskrevet i afsnit 3 i protokollen, efter fjernelse af outlier Spectra med lav signal-til-støj og høj bidrag fra rummet lys, forblev en lille brøkdel af spektre indeholdende kosmiske stråler i datasættet. En sammenligning af de læsse spektre, der genereres før og efter fjernelse af kosmisk stråler, vises i supplerende figur 4. En sammenligning af belastnings spektre vist i supplerende figur 4 indikerer, at virkningen af et lille antal spektre med kosmiske stråler var ubetydelig. De tre faktorer, der repræsenterer vand, protein og lipid, var identiske, og de yderligere tre belastninger forbundet med støj og spektral artefakter var også meget ens. Dette kan tilskrives en lav forekomst af kosmiske stråler i spektre (~ 0,25%) fordi placeringen af kosmiske stråler i spektre er tilfældige.
Udvælgelsen af antallet af komponenter, der anvendes i MCR-analysen, er kritisk, fordi fortolkningen af belastningerne i form af de tilsvarende molekylære arter, som er ansvarlige for hver ladning, i væsentlig grad påvirker både, hvordan den tilsvarende score værdier bruges og den overordnede metodens ydeevne. Som beskrevet i afsnit 4 i protokollen blev PCA først udført for at undersøge udviklingen i egenværdi i forbindelse med forøgelsen af antallet af komponenter. Denne undersøgelse blev brugt til at identificere antallet af komponenter, der skal anvendes i følgende MCR-analyse. At afbilde egenværdien på en logaritmisk skala kan gøre denne identifikationsproces lettere end at undersøge de rå eigenvalues, som vist i figur 5a. Hver egenværdi er en gengivelse af den varians, som en komponent kan hente. Jo større eigenvalue er, jo mere varians kan denne komponent modellere i spektrene. Eigenvalues med tilsvarende størrelse bør udvælges eller elimineres sammen22. Efter denne retningslinje blev der taget hensyn til to, fem og otte komponenter i MCR-analysen, fordi komponenterne tre, fire og fem producerer egenværdier af samme størrelse. En lignende tendens blev også observeret for komponenterne seks, syv og otte. Figur 5 B er et plot af forskellen i egenværdi, mellem ' n ' og ' n + 1 ' komponenter, der viser lokale maksime efter den anden, femte og ottende komponent. Forudgående viden om den molekylære sammensætning af huden kombineret med undersøgelsens design understøtter et minimum af tre komponenter, der kræves for at modellere højfrekvente Raman Spectra. Derfor blev flere MCR-modeller med tre til otte komponenter undersøgt, og belastningerne blev sammenlignet med spektre fra referencematerialer for at identificere de nøglekomponenter, der kræves til den endelige model.
Sammenligning af belastningerne med Raman Spectra fra referencematerialer gør det let at identificere og tildele to af de endelige MCR-komponenter til protein og vand, fordi de dominerer MCR-belastningerne for alle testede modeller og matcher den tilsvarende reference spektre, som er BSA-og DI-vand. De forventede spektroskopiske egenskaber af lipid i nogle af MCR-komponenterne var imidlertid en svagere match til lipid-reference spektret illustreret i MCR-modeller, der indeholder tre og fire komponenter. Desuden blev rest protein toppe (2840-3000 cm-1) observeret i MCR-vand belastningerne for alle modeller, der blev testet under seks komponenter. På grundlag af disse observationer blev der anvendt en seks komponent MCR-model i den endelige MCR-analyse. Tre af de seks komponenter blev tildelt vand, protein og lipid ved at matche deres belastnings spektrum med det tilsvarende referencespektrum. Fortolkningen og Tildelingen af lipid-faktoren er baseret på sammenligning af belastningen til Raman Spectra af tre repræsentative ceramid-materialer, herunder N-behenoyl-D-Erythro-sphingosin, N-Lignoceroyl-D-Erythro-sphinganine, og D-Erythro-Dihyrosphingosin. Raman Spectra fra andre lipidmaterialer i stratum corneum blev også undersøgt. Disse materialer omfatter fedtsyrer (oliesyre, palmitic, palmitoleic, og stearinsyre), kolesterol (kolesterol 3-sulfat natrium og kolesterol), og squalen, som vist i supplerende figur 5. Den lipidfaktor, der blev anvendt i den endelige MCR-model, var et stærkt match til ceramid og i overensstemmelse med andre materialer, der indeholder langkædede carbonhydrider. De tre andre MCR-komponenter var domineret af fluorescens og baseline artefakter og deres tilsvarende score værdier blev ikke brugt i nogen beregninger. Disse tre komponenter er vist i figur 7.
Den overordnede analyse tilgang, der præsenteres i dette manuskript, frembringer en endelig metode med forbedret specificitet og nøjagtighed til måling af de vigtigste komponenter i huden sammenlignet med andre enkelt spidsbelastnings-eller TOPMONTEREDE tilgange. Denne metode viser, at kritiske komponenter kan udvindes fra et klinisk datasæt, der indeholder en relativt lille brøkdel af dårlige spektre. Den fremtidige indsats er fokuseret på automatisering af denne metode i en softwarepakke for at forbedre dens effektivitet og reducere mængden af teknisk ekspertise, der kræves til analysen. Lignende metode er ved at blive udviklet til Raman Spectra indsamlet i fingeraftryks området (400 – 1800 cm-1) ved hjælp af en 785 nm laser kilde snarere end 671 nm laser indarbejdet i samme instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender i høj grad den finansielle støtte fra corporate funktion analytisk og personlig udrensning Care afdeling. Vi ønsker at udtrykke vores taknemmelighed over for analytiske associerede direktører MS Jasmine Wang og Dr. Robb Gardner for deres vejledning og støtte og MS Li Yang for hendes hjælp på dataindsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
