Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la recolección de espectros Raman confocales de sujetos humanos en estudios clínicos combinados con enfoques quimiométricos para la eliminación de valores atípicos espectrales y la posterior extracción de características clave.
Abstract
El desarrollo de este método espectroscópico Deraman confocal in vivo permite la medición directa de agua, proteínas y lípidos con resolución de profundidad en sujetos humanos. Esta información es muy importante para las enfermedades relacionadas con la piel y caracterizar el rendimiento del producto para el cuidado de la piel. Este protocolo ilustra un método para la recolección de espectros Raman confocales y el análisis posterior del conjunto de datos espectral aprovechando la quimiometría. El objetivo de este método es establecer un protocolo estándar para la recopilación de datos y proporcionar orientación general para el análisis de datos. El preprocesamiento (por ejemplo, la eliminación de espectros atípicos) es un paso crítico al procesar grandes conjuntos de datos de estudios clínicos. Como ejemplo, proporcionamos orientación basada en el conocimiento previo de un conjunto de datos para identificar los tipos de valores atípicos y desarrollar estrategias específicas para eliminarlos. Se realiza un análisis de componentes principales y los espectros de carga se comparan con los espectros de los materiales de referencia para seleccionar el número de componentes utilizados en el análisis final de la resolución de curva sorcada (MCR). Este enfoque es exitoso para extraer información significativa de un dataset espectral grande.
Introduction
En estudios clínicos, la espectroscopia in vivo confocal de Raman ha demostrado su capacidad única para determinar el espesor del estrato córneo y el contenido de agua1,2,3,4, y el seguimiento de la penetración de materiales activos aplicados tópicamente a la piel5,6. Como enfoque no invasivo, la espectroscopia confocal de Raman detecta señales moleculares basadas en modos vibratorios. Por lo tanto, el etiquetado no es necesario7. La espectroscopia In vivo confocal de Raman proporciona información química con resolución de profundidad basada en la naturaleza confocal de la técnica. Esta información dependiente de la profundidad es muy útil en el estudio de los efectos de los productos para el cuidado de la piel4,8, envejecimiento9,10, cambios estacionales3, así como enfermedades de la función de barrera de la piel, como la dermatitis atópica11,12. Hay mucha información en la región de alta frecuencia de espectroscopia raman confocal (2.500-4.000 cm-1), donde el agua produce picos distintos en la región entre 3.250-3.550 cm-1. Sin embargo, los picos Raman de proteínas y lípidos, que se centran entre aproximadamente 2.800-3.000 cm-1, se superponen entre sí porque las señales se producen principalmente a partir de metileno (-CH2-) y metil (-CH3) grupos13 . Esta información superpuesta presenta un desafío técnico al obtener cantidades relativas de especies moleculares individuales. Se han utilizado los enfoques de ajuste máximo14,15 y posición pico selectiva12,16 para resolver este desafío. Sin embargo, es difícil para estos métodos basados en picos únicos extraer información de componentes puros porque varios picos Raman del mismo componente cambian simultáneamente17. En nuestra reciente publicación18, se propuso un enfoque MCR para dilucidar la información de componentes puros. Con este enfoque, se extrajeron tres componentes (agua, proteínas y lípidos) de un conjunto de datos espectroscópico Raman confocal grande in vivo.
La ejecución de grandes estudios clínicos puede ser exigente en individuos que recopilan datos espectroscópicos in vivo. En algunos casos, la adquisición espectral puede requerir equipo operativo durante muchas horas al día y el estudio puede extenderse hasta semanas o meses. En estas condiciones, los operadores de equipos que carecen de la experiencia técnica para identificar, excluir y corregir para todas las fuentes de artefactos espectroscópicos pueden generar datos espectroscópicos. El conjunto de datos resultante puede contener una pequeña fracción de valores atípicos espectroscópicos que deben identificarse y excluirse de los datos antes del análisis. Este documento ilustra en detalle un proceso de análisis quimiométrico para "limpiar" un conjunto de datos clínico de Raman antes de analizar los datos con MCR. Para eliminar con éxito los valores atípicos, es necesario identificar los tipos de valores atípicos y la posible causa de la generación de los espectros atípicos. A continuación, se puede desarrollar un enfoque específico para eliminar los valores atípicos de destino. Esto requiere un conocimiento previo del conjunto de datos, incluida una comprensión detallada sobre el proceso de generación de datos y el diseño del estudio. En este conjunto de datos, la mayoría de los valores atípicos son espectros de señal a ruido bajos y se originan principalmente a partir de 1) espectros recogidos por encima de la superficie de la piel (6.208 de 30.862), y 2) una fuerte contribución al espectro de la luz fluorescente de la habitación (67 de 30.862). Los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel producen una respuesta Raman débil, ya que el punto focal del láser se acerca a la superficie de la piel y se encuentra principalmente en la ventana del instrumento debajo de la piel. Los espectros con una fuerte contribución de la luz fluorescente de la sala se generan debido a un error del operador del instrumento o al movimiento del sujeto, lo que produce una condición en la que la ventana de colección confocal de Raman no está completamente cubierta por el sitio del cuerpo del sujeto. Aunque estos tipos de artefactos espectrales podían ser identificados y remediados durante la adquisición espectral por un experto espectroscópico en el momento de la adquisición de datos, los operadores de instrumentos capacitados utilizados en este estudio recibieron instrucciones para recopilar todos los datos a menos que se observó un fallo catastrófico. La tarea de identificar y excluir valores atípicos se incorpora al protocolo de análisis de datos. El protocolo presentado está desarrollado para resolver este desafío. Para abordar los espectros de señal a ruido bajos por encima de la superficie de la piel, la ubicación de la superficie de la piel debe determinarse primero para permitir la eliminación de los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel. La ubicación de la superficie de la piel se define como la profundidad donde el punto focal láser Raman está la mitad en la piel y la mitad fuera de la piel como se ilustra en la Figura Suplementaria 1. Después de eliminar espectros bajos de señal a ruido, se implementa un análisis de componentes principales (PCA) para extraer el factor dominado por picos de luz fluorescente de la sala. Estos valores atípicos se eliminan en función del valor de puntuación del factor correspondiente.
Este protocolo proporciona información detallada sobre cómo se determinan seis componentes principales en el proceso MCR. Esto se hace a través de un análisis de PCA seguido de la comparación de la forma espectral entre las cargas de los modelos generados con un número diferente de componentes principales. También se explica en detalle el proceso experimental para la recopilación de datos de materiales de referencia, así como de los sujetos humanos.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional del Beijing Children's Hospital en cumplimiento de las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975. Se llevó a cabo de acuerdo con las pautas ich para buenas prácticas clínicas. El estudio tuvo lugar de mayo a julio de 2015.
1. Colección de espectros de Raman confocalines in vivo de sujetos humanos con dermatitis atópica
- Incluir asignaturas de conformidad con los siguientes criterios.
- Incluya sujetos entre las edades de 4–18 años.
- Incluir sujetos con dermatitis atópica leve a moderada (puntuación de 2 o 3 según la evaluación global del médico) con síntomas activos de la enfermedad en 5%–30% de la superficie corporal, con al menos dos lesiones en los brazos.
- Incluya sujetos que estén en buen estado de salud, excluyendo los síntomas directamente relacionados con la enfermedad de AD.
- Incluir temas que proporcionen consentimiento informado por escrito.
- Incluya sujetos que tengan un valor de ángulo de topología individual (ITA) superior a 40 en la ubicación de prueba.
- Excluya los temas que cumplan cualquiera de los siguientes criterios.
- Excluir sujetos que estén participando actualmente o que hayan participado previamente en un estudio clínico en cualquier centro de pruebas dentro de las 4 semanas anteriores.
- Excluya a los sujetos con cáncer o que hayan sido diagnosticados o tratados para el cáncer dentro de los 5 años anteriores al estudio.
- Excluir sujetos diabéticos.
- Excluya a los sujetos que tengan una enfermedad inmunológica o infecciosa que pueda poner al sujeto en riesgo o interferir con la precisión de los resultados del estudio (es decir, hepatitis, tuberculosis, VIH, SIDA, lupus o artritis reumatoide).
- Excluya los sujetos que tengan afecciones de la piel que puedan interferir con las mediciones instrumentales o que impidan la evaluación clara de la piel solo a la dermatitis atópica. Algunos ejemplos son la piel extremadamente seca, la piel dañada, los cortes, los arañazos, las quemaduras solares, las marcas de nacimiento, los tatuajes, las cicatrices extensas, las erupciones cutáneas, el crecimiento excesivo del cabello o el acné.
- Excluya los sujetos que utilizan medicamentos inmunosupresores orales, antibióticos u otras terapias sistémicas en el último mes, excepto para tranquilizantes menores.
- Excluir sujetos con cualquier otra condición médica que, en opinión del investigador, les impida participar en el estudio.
- Excluya los sujetos con mayor pigmentación en el área de prueba.
- Etiquete el área de la lesión del participante del estudio de la dermatitis atópica y marque con un área de 3 cm x 4 cm en o cerca del sitio de la lesión como se muestra en la Figura 1A.
- Etiquetar el área de no lesión con el mismo marcador en el sitio del cuerpo homólogo (por ejemplo, antebrazo izquierdo frente a antebrazo derecho) como se muestra en la Figura 1B.
- Coloque el sitio del cuerpo marcado en estrecho contacto con la ventana del instrumento Raman confocal in vivo como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B. Cubra toda la ventana para evitar el impacto de la luz de la habitación en el sitio del cuerpo.
- Realice la recopilación de datos de Raman.
NOTA: El instrumento tiene una resolución espectral de 2 cm-1 y 50x objetivo de microscopía (NA - 0,9 inmersión en aceite), utilizando un láser de 671 nm con una potencia de 17 mW. La longitud de onda se calibra utilizando el espectro de una lámpara de neón-argón incorporada. La calibración de intensidad se realiza midiendo el espectro de un estándar de calibración de vidrio NIST (National Institute of Standards).- Mueva el enfoque hasta que se observe un espectro como se ilustra en la Figura 2C y, a continuación, aleje el foco de la superficie de la piel a 10 m.
- Inicie la recopilación de datos durante 26 pasos con un tamaño de paso de 2 m en la región de frecuencia de 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Utilice un tiempo de exposición de 1 s y mida ocho réplicas para cada área que dure entre 10 y 15 minutos en total.
2. Colección de espectros Raman confocales a partir de materiales de referencia
- Colocar los materiales de referencia, los principales componentes en la piel humana estrato córneo19, en la ventana del instrumento Raman confocal (ver Tabla de Materiales: Albúmina Sérica Bovina (BSA), agua desionizada (agua DI), ceramida, colesterol, libre ácido graso, y el escualeno).
- Recoja los espectros Raman de los materiales de referencia consecutivamente desde el exterior del material hasta el centro de materiales utilizando los mismos parámetros de recogida descritos anteriormente.
- Integre el área bajo cada espectro de Raman entre el rango de 2.510-4.000 cm-1 e identifique los tres puntos de valor máximo principales en estas 26 mediciones. Promedio de los espectros Raman de esos tres puntos para obtener los espectros de material de referencia final.
3. Eliminación de los espectros atípicos mediante análisis quimiométricos
- Determinar la superficie de la piel y eliminar los espectros fuera de la piel.
- Cambie la extensión de archivo de '.ric' a '.mat' y cargue el archivo .mat en la plataforma de software MATLAB.
- Corrija la línea base con Línea base (Mínimos cuadrados ponderados automáticos) haciendo clic con el botón derecho en el dataset importado en Analizar . Otras herramientas ? Preprocesamiento en el software PLS_Toolbox con la configuración predeterminada.
- Sume los valores entre 2.910–2.965 cm-1 para obtener los valores de intensidad bajo cada espectro Raman a partir de la medición de 26 pasos consecutivos como se muestra en la Figura 3A a través de la función de suma en MATLAB.
- Interpolar el valor de desplazamiento del instrumento (valor en el eje X de la Figura 3B) de 26 a 260 utilizando la función linspace en MATLAB.
- Interpolar el valor de intensidad de 26 a 260 utilizando el método spline en MATLAB, aprovechando los valores de 260 posiciones recién generados.
- Utilice las funciones polyfit y polyval de MATLAB para obtener el nuevo conjunto de valores de intensidad con 260 puntos. En primer lugar, utilice los valores de posición e intensidad 260 como entradas X e Y para la función polyfit, respectivamente. Establezca el valor de grado en 20. A continuación, utilice los coeficientes de salida y los 260 valores de posición extendida como entrada para polyval para obtener los valores de intensidad finales de 260.
- Utilice las funciones max y min de MATLAB para identificar los puntos máximos y mínimos de los valores de intensidad 260 recién interpolados.
- Calcule el valor de intensidad media dividiendo la suma del valor de intensidad máximo y mínimo por dos.
- Identifique el valor de intensidad de los valores de intensidad 260 (calculados a partir del paso 3.1.6) más cercanos al valor de intensidad media y establezca su valor de posición correspondiente como superficie de la piel. Establezca este valor de posición como el punto cero en el eje X como se muestra en la Figura 3B.
- Cambie todos los demás valores de posición de acuerdo con el punto cero y el tamaño de paso conocido de 2 m.
- Retire todos los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel de acuerdo con su valor de posición.
- Importe el resto de los datos a PLS_Toolbox para crear un conjunto de datos y cámbiele el nombre a "RamanData.mat".
- Retire los espectros atípicos con el efecto de luz de la habitación.
- Cargue el conjunto de datos de espectros de Raman (RamanData.mat) después de eliminar los espectros fuera de la piel e implemente el análisis de PCA.
- Cargue el conjunto de datos en el software PLS_Toolbox en la plataforma MATLAB y haga clic con el botón derecho del programa en el conjunto de datos para elegir Analizar . PCA.
- Seleccione Normalizar como enfoque de preprocesamiento y elija Ninguno para la validación cruzada.
- Utilice los tres componentes para el análisis de descomposición PCA tal y como se muestra en de la Figura Suplementaria 2.
- Retire la cubierta de la ventana de recogida del instrumento In vivo Raman y recoja los espectros de luz de la habitación en la región de alta frecuencia utilizando los mismos parámetros utilizados para la recopilación de datos de materiales de referencia.
- Identifique el factor de efecto de luz de la habitación mediante la comparación con los espectros de fondo de luz de la habitación, como se muestra en la Figura complementaria 3.
- Elimine los espectros con un valor de puntuación correspondiente significativamente mayor de lo normal (más del 99,8% de los valores de puntuación de todo el conjunto de datos, que es 0,16 en este estudio).
4. Selección del número de componentes en el análisis de descomposición de MCR
- Corrija la línea base del espectro Raman utilizando el mismo enfoque descrito anteriormente (sección 3.1.2).
- Realice el análisis de PCA en el conjunto de datos preprocesado como se describió anteriormente (sección 3.2) excepto para seleccionar "PQN" – "Centro medio" en lugar de "Normalizar", y trazar los valores propios en escala logarítmica junto con el número de componentes (20) como el número predeterminado en el análisis de descomposición haciendo clic en el botón Elegir componentes y seleccione log(eigenvalues) como el valor Y. Elija de tres a ocho como el número de componentes utilizados para el análisis MCR.
- Realice el análisis MCR.
- Cargue el conjunto de datos en el software MCR_main20 a través del botón Selección de datos.
- Seleccione el número de componentes (tres a ocho) haciendo clic en el botón Determinación del número de componentes.
- Haga clic en el botón Puro en la pestaña Estimación inicial, seleccione Concentración en la ficha Dirección de la selección de variables y haga clic en el botón Hacer.
- Haga clic en el botón Aceptar y, a continuación, en el botón Continuar a la página siguiente.
- Haga clic en Continuar en la página siguiente y, a continuación, seleccione fnnls y 6 en las pestañas Implementación y Nr. de especies con perfiles de no negatividad, respectivamente. Haga clic en el botón Continuar.
- Elija los mismos parámetros que la sección 4.3.5 para esta página y haga clic en Continuar.
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Representative Results
En este estudio clínico, se recogieron espectros de Raman confocal in vivo de 28 sujetos de 4 a 18 años de edad. Un total de 30.862 espectros Raman fueron recogidos con el protocolo de recopilación de datos mencionado anteriormente. Este dataset espectral grande contiene 20% de valores atípicos espectrales como se muestra en la Figura 4A. Los espectros atípicos de señal a ruido bajos se eliminaron después de determinar la superficie de la piel, seguidos por el PCA para identificar los espectros con características de luz de la habitación. El tercer factor en este modelo de PCA se identifican los picos de luz de la habitación. Esto se confirma comparando los espectros de carga del factor 3 con un espectro de luz fluorescente recogida por separado en el sitio de estudio utilizando el mismo instrumento Raman confocal (véase la Figura 3 complementaria). Figura 4 B indica que la mayoría de los espectros atípicos se eliminaron después de este proceso.
El PCA se realizó en el conjunto de datos Raman confocal preprocesado y el valor propio junto con el número de factores utilizados se trazan en la Figura 5. Según estudios previos12,19, el modelo debe incluir al menos tres componentes: agua, proteína y lípidos. Se observó una disminución significativa del valor propio para el factor 9, como se muestra en la Figura 5. Esta observación sugiere investigar modelos con el número de componentes principales que varía entre tres y ocho factores para su inclusión en el modelo MCR. Las cargas de MCR que contienen características espectroscópicas más consistentes con proteínas, agua y lípidos se muestran en la Figura 6.
Figura 1 . Ilustración de la marca de lesión y no lesión en el antebrazo. (A) Un área marcada de 3 cm x 4 cm en un lugar de lesión. (B) Un área marcada de 3 cm x 4 cm en un lugar sin lesiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ilustración de la recopilación de datos Raman confocal. (A) Instrumento Ramán confocal. (B) Colección Spectra en el antebrazo del sujeto humano. (C) Una captura de pantalla para determinar la posición de referencia para la recopilación de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Determinación de la superficie de la piel. (A) Integración del área proteica bajo cada espectro Raman. (B) Ajuste de la superficie de la piel en función de los puntos máximo y mínimo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Espectros de conjunto de datos Raman. (A) Espectros DeRamán confocal antes de la eliminación de los espectros atípicos. (B) Espectros DeRamán confocal tras la eliminación de los espectros atípicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Determinar el número de componentes del análisis de PCA. (A) Valor propio en una escala logarítmica trazada en función del número de componentes utilizados en el modelo PCA. (B) Diferencia en los valores propios entre los componentes 'n' y 'n + 1' Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Comparación de la forma de carga con los espectros de materiales de referencia correspondientes con tres a ocho componentes en el modelo MCR. (A) Proteína, (B) agua y (C) forma de factores lipídicos con tres a ocho componentes en el modelo MCR en comparación con bSA, agua y lípidos materiales de referencia, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Las tres cargas adicionales del modelo MCR de seis componentes no se utilizan en el modelo final. Estos tres componentes MCR están dominados por fluorescencia y artefactos de línea de base. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1. Ilustración de la determinación de la superficie de la piel donde el centro del foco láser toca la piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 2. Ilustración de la selección de tres componentes en el análisis PCA del software PLS_Toolbox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 3. Identificación del factor de carga dominado por la luz de la habitación superpuesta a un espectro de referencia de luz de habitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 4. Comparación de cargas del modelo MCR antes y después dela eliminación de los rayos cósmicos. (A), (B) y (C) son los factores que representan el agua, la proteína y los lípidos, respectivamente. Los factores de carga adicionales no utilizados en el modelo MCR final son d, e, y f. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 5. Espectros Raman de materiales lipídis típicos en estrato córneo. (A) Colesterol 3-sulfato de sodio y colesterol. (B) ácido oleico, palpético, palmitoleico y esteárico. (C) Escualeno. (D) N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, y D-Erythro-Dihyrosphingosine. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la recopilación de datos, como se describe en las secciones 2 y 3 del protocolo, cada perfil de profundidad se recopiló en un área con contacto entre la ventana del instrumento y la piel mediante la búsqueda de las áreas más oscuras de las imágenes microscópicas resaltadas en los círculos rojos en Figura 2C. Una vez localizadas estas áreas, fue fundamental iniciar el perfil de profundidad por encima de la superficie de la piel para determinar con precisión la ubicación de la superficie de la piel para el procedimiento de análisis de datos. La ubicación de la superficie de la piel se utilizó posteriormente para determinar la profundidad relativa de cada espectro en el perfil de profundidad correspondiente. Como se menciona en la sección 1 del protocolo, iniciar el perfil de profundidad 10 m por encima de la superficie de la piel produce cinco puntos de datos fuera de la piel. Esto permite determinar con éxito las ubicaciones de la intensidad máxima y mínima de la señal en ambos lados de la superficie de la piel. También es importante evitar las ubicaciones de medición que contienen marcas de pluma y áreas pigmentadas más altas como pecas, ya que estas áreas producen una señal de fondo de alta fluorescencia. La selección del tiempo de exposición es un equilibrio entre la calidad espectral y la duración de la medición. Un tiempo de exposición más largo mejora la señal a ruido y aumenta significativamente el tiempo de medición general. Sin embargo, a muchos sujetos les resulta difícil permanecer inmóviles durante largos períodos de tiempo. Esto es extremadamente difícil para los niños, por ejemplo. El aumento de la potencia del láser aumenta la señal-ruido. Sin embargo, demasiada energía puede dañar la piel debido a la absorción de la energía. No se pueden superar las exposiciones máximas admisibles, la potencia láser de 17 mW definida por la norma nacional china (GB 7247.1-2012) y el estándar internacional de seguridad láser (IEC 60285-1:2007; <20 mW para 671 nm y <30 mW para 785 nm). Otras precauciones de seguridad incluyen asegurarse de que cada sujeto está usando protección ocular antes de la adquisición de datos, que los sitios del cuerpo tienen un valor de ángulo de topología individual (ITA) superior a 40, y evitar áreas con alta pigmentación de la piel.
Para determinar la ubicación de la superficie de la piel, se integró el área bajo la proteína pico Raman (2.910-2.965 cm-1) para obtener el perfil de profundidad de la señal proteica. Los espectros de Raman se corrigieron primero en la línea de base utilizando el método de mínimos cuadrados ponderados automatizados de PLS_Toolbox antes de la integración de los picos. Los 26 puntos de datos de un perfil de profundidad se interpolaron a 260 puntos utilizando el método linspace para el vaue offset del instrumento (valor del eje X en la Figura 3A)y el método spline para el valor de intensidad correspondiente. Los datos resultantes se interpolaron en un polinomio de 20osa mediante las funciones polyfit y polyval en MATLAB y se determinaron los puntos máximo y mínimo de los datos interpolados. El valor de intensidad media se calculó dividiendo la suma de los valores máximo y mínimo por 2. La superficie de la piel se definió como la ubicación donde el valor de intensidad del perfil de profundidad interpolado era más cercano a la intensidad media. La ubicación exacta de la superficie de la piel no necesita coincidir con un punto de datos experimental. Este método sólo puede medir una profundidad limitada de la piel debido a la absorción y dispersión de la viga21. La recopilación de datos espectroscópicos por debajo de 50 m bajo la superficie de la piel puede requerir cambios significativos en los parámetros experimentales.
Como se describe en la sección 3 del protocolo, después de la eliminación de espectros atípicos con baja señal a ruido y alta contribución de las luces de la habitación, una pequeña fracción de espectros que contienen rayos cósmicos permaneció en el conjunto de datos. Una comparación de los espectros de carga generados antes y después de la eliminación de rayos cósmicos se muestra en la Figura Suplementaria 4. Una comparación de los espectros de carga mostrados en la Figura Suplementaria 4 indica que el impacto de un pequeño número de espectros con rayos cósmicos fue insignificante. Los tres factores que representaban el agua, la proteína y los lípidos eran idénticos, y las tres cargas adicionales asociadas con el ruido y los artefactos espectrales también eran muy similares. Esto podría atribuirse a una baja ocurrencia de rayos cósmicos en los espectros (0,25%) porque la ubicación de los rayos cósmicos en los espectros es aleatoria.
La selección del número de componentes utilizados en el análisis MCR es crítica, ya que la interpretación de la forma de las cargas en términos de las especies moleculares correspondientes responsables de cada carga afecta significativamente tanto a la forma en que la puntuación correspondiente valores y el rendimiento general del método. Como se describe en la sección 4 del protocolo, PCA se realizó primero para investigar la evolución del valor propio asociada con el aumento del número de componentes. Esta investigación se utilizó para identificar el número de componentes que se deben utilizar en el siguiente análisis mcR. Trazar el valor propio en una escala logarítmica puede hacer que este proceso de identificación sea más fácil que examinar los valores propios sin procesar, como se muestra en la Figura 5A. Cada valor propio es una representación de la varianza que un componente puede capturar. Cuanto mayor sea el valor propio, mayor será la varianza que este componente pueda modelar en los espectros. Los valores propios con un tamaño similar deben seleccionarse o eliminarse juntos22. Siguiendo esta directriz, se consideraron dos, cinco y ocho componentes para el análisis MCR porque los componentes tres, cuatro y cinco producen valores propios de tamaño similar. También se observó una tendencia similar para los componentes seis, siete y ocho. Figura 5 B es una gráfica de la diferencia en los valores propios entre los componentes 'n' y 'n+1' que muestra la máxima local después de los componentes segundo, quinto y octavo. El conocimiento previo sobre la composición molecular de la piel combinado con el diseño del estudio soporta un mínimo de tres componentes necesarios para modelar los espectros Raman de alta frecuencia. Por lo tanto, se investigaron varios modelos MCR que contenían de tres a ocho componentes y las cargas se compararon con los espectros de los materiales de referencia para identificar los componentes clave necesarios para el modelo final.
La comparación de las cargas con los espectros De Raman de los materiales de referencia permite identificar y asignar fácilmente dos de los componentes finales de MCR a proteínas y agua porque dominan las cargas MCR para todos los modelos probados y coinciden con la referencia correspondiente espectros, que son agua BSA y DI. Sin embargo, las propiedades espectroscópicas esperadas de los lípidos en algunos de los componentes MCR eran una coincidencia más débil con el espectro de referencia de lípidos ilustrado en los modelos MCR que contienen tres y cuatro componentes. Además, se observaron picos de proteínaresidual (2.840-3.000 cm-1) en las cargas de agua MCR para todos los modelos probados por debajo de seis componentes. Sobre la base de estas observaciones, se utilizó un modelo MCR de seis componentes en el análisis final de MCR. Tres de los seis componentes fueron asignados al agua, la proteína y el lípido al hacer coincidir su espectro de carga con el espectro de referencia correspondiente. La interpretación y asignación del factor lipídico se basa en la comparación de la carga con los espectros de Raman de tres materiales representativos de ceramida, incluyendo N-behenoyl-D-erythro-sphingosine, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine, y D-Erythro-Dihyrosphingosine. También se examinaron los espectros Raman de otros materiales lipídicos en el estrato córneo. Estos materiales incluyen ácidos grasos (oleico, palpético, palmitoleico y ácido esteárico), colesterol (colesterol 3-sulfato de sodio y colesterol), y escualeno, como se muestra en la Figura Suplementaria 5. El factor lipídico utilizado en el modelo MCR final fue una fuerte coincidencia con los espectros de ceramida y consistente con otros materiales que contienen hidrocarburos de cadena larga. Los otros tres componentes MCR estaban dominados por la fluorescencia y los artefactos de línea base y sus valores de puntuación correspondientes no se utilizaron en ningún cálculo. Estos tres componentes se muestran en la Figura 7.
El enfoque de análisis general presentado en este manuscrito produce un método final con una especificidad y precisión mejoradas para medir los componentes clave de la piel en comparación con otros enfoques de un solo pico o de ajuste de pico. Esta metodología demuestra que los componentes críticos se pueden extraer de un conjunto de datos clínico que contiene una fracción relativamente pequeña de espectros malos. Los esfuerzos futuros se centran en la automatización de esta metodología en un paquete de software para mejorar su eficiencia y reducir la cantidad de experiencia técnica necesaria para el análisis. Se está desarrollando una metodología similar para los espectros de Raman recogidos en la región de las huellas dactilares (400-1.800 cm-1) utilizando una fuente láser de 785 nm en lugar del láser de 671 nm incorporado en el mismo instrumento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen en gran medida el apoyo financiero del departamento de atención analítica y de limpieza personal de la función corporativa. Queremos expresar nuestra gratitud a los directores asociados analíticos, Sra. Jasmine Wang y Dr. Robb Gardner, por su orientación y apoyo y a la Sra. Li Yang por su ayuda en la recopilación de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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