Summary
Här presenterar vi ett protokoll för insamling av konfokala Raman-spektra från försökspersoner i kliniska studier kombinerat med chemometriska metoder för avlägsnande av spektral avvikare och efterföljande extraktion av viktiga funktioner.
Abstract
Utveckling av detta in vivo konfokala Raman spektroskopiska metod möjliggör direkt mätning av vatten, proteiner och lipider med djup upplösning hos försökspersoner. Denna information är mycket viktigt för hudrelaterade sjukdomar och karakterisera hudvård produktprestanda. Detta protokoll illustrerar en metod för konfokalmikroskopi Raman spectra Collection och den efterföljande analysen av spektraldata uppsättningen som utnyttjar kemometri. Målet med den här metoden är att etablera ett standardprotokoll för datainsamling och ge allmän vägledning för dataanalys. Förbehandling (t. ex. avlägsnande av avvikare Spectra) är ett kritiskt steg vid bearbetning av stora datamängder från kliniska studier. Som ett exempel ger vi vägledning baserat på tidigare kunskaper om en datauppsättning för att identifiera typer av extremvärden och utveckla specifika strategier för att ta bort dem. En huvudkomponent analys utförs och belastnings spektra jämförs med spektra från referensmaterial för att välja det antal komponenter som används i den slutliga MCR-analysen (multivariat Curve resolution). Den här metoden är lyckad för att extrahera meningsfull information från en stor spektraldata uppsättning.
Introduction
I kliniska studier, in vivo konfokal Raman spektroskopi har visat sin unika förmåga att bestämma stratum hornlagret tjocklek och vattenhalt1,2,3,4, och spåra inträngning av aktiva material appliceras topikalt på huden5,6. Som icke-invasiv metod detekterar konfokal Raman-spektroskopi molekylära signaler baserade på vibrationella lägen. Sålunda, märkning behövs inte7. In vivo konfokal Raman spektroskopi ger kemisk information med djup upplösning baserad på den konfokala karaktären av tekniken. Denna djup-beroendeinformation är mycket användbar för att studera effekterna av hudvårdsprodukter4,8, åldrande9,10, säsongsbetingade förändringar3, samt hudbarriär funktion sjukdomar, såsom atopisk dermatit11,12. Det finns en hel del information i hög frekvens regionen av konfokala Raman spektroskopi (2500-4000 cm-1), där vatten producerar distinkta toppar i regionen mellan 3250-3550 cm-1. Men de Raman toppar av proteiner och lipider, som är centrerad mellan cirka 2800-3000 cm-1, överlappar varandra eftersom signalerna huvudsakligen produceras från metylenblått (-CH2-) och metyl (-CH3) grupper13 . Denna överlappande information utgör en teknisk utmaning när man erhåller relativa mängder av enskilda molekylära arter. Peak fitting14,15 och selektiv topp position12,16 metoder har använts för att lösa denna utmaning. Det är dock svårt för dessa Single Peak-baserade metoder för att extrahera ren komponentinformation eftersom flera Raman toppar från samma komponent ändras samtidigt17. I vår senaste publikation18föreslogs en MCR-strategi för att belysa den rena komponentinformationen. Med denna metod har tre komponenter (vatten, proteiner och lipider) extraherats från en stor in vivo konfokal Raman spektroskopisk DataSet.
Utförandet av stora kliniska studier kan vara krävande för individer som samlar in vivo spektroskopiska data. I vissa fall, spektralförvärv kan kräva operativ utrustning för många timmar på en dag och studien kan sträcka sig upp till veckor eller månader. Under dessa förhållanden kan spektroskopiska data genereras av utrustnings operatörer som saknar teknisk expertis för att identifiera, utesluta och korrigera för alla källor till spektroskopiska artefakter. Den resulterande datamängden kan innehålla en liten del av spektroskopiska extremvärden som måste identifieras och uteslutas från data före analys. Denna uppsats illustrerar i detalj en kemometriska analys process för att "städa upp" en klinisk Raman dataset innan du analyserar data med MCR. För att framgångsrikt ta bort avvikare, typer av extremvärden och den potentiella orsaken till generering av avvikare Spectra måste identifieras. Sedan kan ett specifikt tillvägagångssätt utvecklas för att ta bort riktade avvikare. Detta kräver förkunskaper i datauppsättningen, inklusive en detaljerad förståelse för data generations processen och studiens utformning. I den här datauppsättningen är de flesta avvikare låga signal-till-brus-spektra och kommer primärt från 1) spektra som samlats in ovanför hudytan (6 208 av 30 862) och 2) starkt bidrag till spektrumet från fluorescerande rums ljus (67 av 30 862). Spektra som samlats över hudytan ger ett svagt Raman-svar, eftersom laser brännpunkten närmar sig hudytan och är mestadels i instrument fönstret under huden. Spektra med ett starkt bidrag från Lysrörs rum ljus genereras på grund av antingen instrument operatör fel eller ämne rörelse, som producerar ett tillstånd där den konfokala Raman Collection fönstret inte är helt täckt av försöks platsens kropps plats. Även om dessa typer av spektralartefakter kunde identifieras och åtgärdas under spektralförvärvet av en spektroskopisk expert vid tidpunkten för datainhämtningen, instruerades de utbildade instrument operatörerna som användes i denna studie att samla in alla data om inte en oåterkalleligt misslyckande observerades. Uppgiften att identifiera och utesluta extremvärden införlivas i dataanalys protokollet. Det protokoll som presenteras är utvecklat för att lösa denna utmaning. För att ta itu med de låga signal-till-brus-spektra ovanför hudytan måste placeringen av hudytan bestämmas först för att tillåta avlägsnande av spektra som samlats upp ovanför hudytan. Placeringen av hudytan definieras som det djup där Raman laser brännpunkt är hälften i huden och hälften ut ur huden som illustreras i kompletterande figur 1. Efter att ha avlägsnat låg signal-till-brus Spectra, en huvudsaklig komponent analys (PCA) genomförs för att extrahera faktorn domineras av fluorescerande rum ljus toppar. Dessa avvikare tas bort baserat på poängvärdet för motsvarande faktor.
Det här protokollet innehåller detaljerad information om hur sex huvudkomponenter bestäms i MCR-processen. Detta görs genom en PCA-analys följt av spektralform jämförelse mellan belastningar för modeller som genereras med olika antal huvudkomponenter. Även försöks processen för datainsamling av referensmaterial och de mänskliga ämnena förklaras i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella granskningskommittén för barnsjukhuset i Peking i enlighet med de etiska riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen 1975. Den genomfördes enligt ICH-riktlinjerna för god klinisk sed. Studien ägde rum från maj till juli 2015.
1. insamling av in vivo konfokalmikroskopi Raman-spektra från försökspersoner med atopisk dermatit
- Inkludera ämnen i enlighet med följande kriterier.
- Inkludera försökspersoner i åldrarna 4 – 18 år.
- Inkludera försökspersoner med mild till måttlig atopisk dermatit (poäng av 2 eller 3 enligt läkarens övergripande bedömning) med aktiva sjukdomssymtom på 5% – 30% av kroppsytan, med minst två lesioner på armarna.
- Inkludera ämnen som är i god hälsa, exklusive symtom som är direkt relaterade till annons sjukdomen.
- Inkludera ämnen som ger skriftligt informerat samtycke.
- Inkludera ämnen som har ett värde för individuell topologivinkel (ITA) som är högre än 40 på testplatsen.
- Utesluta ämnen som uppfyller något av följande kriterier.
- Utesluta försökspersoner som för närvarande deltar eller tidigare har deltagit i en klinisk studie på någon testanläggning inom de föregående 4 veckorna.
- Utesluta patienter med cancer eller som har diagnostiserats eller behandlats för cancer inom 5 år före studien.
- Utesluta diabetiska försökspersoner.
- Utesluta försökspersoner som har en immunologisk eller smittsam sjukdom som kan placera ämnet i riskzonen eller störa noggrannheten av studieresultaten (dvs., hepatit, tuberkulos, HIV, AIDS, lupus, eller reumatoid artrit).
- Utesluta ämnen som har hudåkommor som kan störa instrumentella mätningar eller kommer att förhindra en tydlig bedömning av huden endast till atopisk dermatit. Exempel är extremt torr hud, skadad hud, nedskärningar, repor, solbränna, födelsemärken, tatueringar, omfattande ärrbildning, hudutslag, överdriven hårväxt, eller akne.
- Utesluta ämnen som använder orala immunsuppressiva läkemedel, antibiotika, eller andra systemiska terapier inom den senaste månaden, med undantag för mindre lugnande medel.
- Utesluta försökspersoner med andra sjukdomstillstånd som, enligt prövarens åsikt, utesluter dem från studiens deltagande.
- Utesluta försökspersoner med högre pigmentering i testområdet.
- Märk lesion området av atopisk dermatit studien deltagaren och markera med en 3 cm x 4 cm område på eller nära lesion platsen som visas i figur 1a.
- Märk det icke-lesionsområde med samma markör på motsvarande kropps plats (t. ex. vänster underarm kontra höger underarm) som visas i figur 1B.
- Placera den markerade kropps platsen i nära kontakt med fönstret på det in vivo konfokalmikroskopi Raman-instrument som visas i figur 2A och figur 2B. Täck hela fönstret för att undvika effekterna av rumsbelysning på kroppen platsen.
- Utför Raman-datainsamlingen.
Anmärkning: instrumentet har en spektralupplösning på 2 cm-1 och 50x mikroskopi mål (NA = 0,9 Oil Immersion), med en 671 nm Laser med en effekt på 17 MW. Våglängd kalibreras med hjälp av spektrumet av en inbyggd Neon-argon lampa. Intensiteten kalibrering görs genom att mäta spektrumet av en NIST (National Institute of Standards) glas kalibrerings standard.- Flytta fokus tills ett spektrum som illustreras i figur 2C observeras och flytta sedan fokus bort från hudens yta 10 μm.
- Starta datainsamlingen för 26 steg med en steg storlek på 2 μm i frekvensområdet 2 510 cm-1– 4 000 cm-1 . Använd en exponeringstid på 1 s och mät åtta replikat för varje område som varar ~ 10 – 15 min totalt.
2. insamling av konfokala Raman-spektra från referensmaterial
- Placera referensmaterialen, de viktigaste komponenterna i human hud stratum hornlagret19, på fönstret för det konfokala Raman-instrumentet (se tabell över material: bovint serumalbumin (BSA), avjoniserat vatten (di-vatten), ceramid, kolesterol, fri fettsyror och skvalen).
- Samla referensmaterialets Raman-spektra i följd från utsidan av materialet till material centret med samma insamlings parametrar som beskrivits ovan.
- Integrera området under varje Raman-spektra mellan intervallet 2510 – 4000 cm-1 och identifiera de tre högsta värde punkterna i dessa 26 mätningar. I genomsnitt Raman spectra från dessa tre punkter för att få den slutliga referensmaterial spektra.
3. avlägsnande av avvikare spektra genom kemometrics analys
- Bestäm hudens yta och ta bort out-of-Skin Spectra.
- Ändra filtillägget från '. Ric ' till '. mat ' och ladda. mat filen till MATLAB mjukvaruplattform.
- Korrigera originalplanen med baslinjen (automatiskt viktade minsta kvadraterna) genom att högerklicka på den importerade datamängden under analysera | Andra verktyg | Förbehandling i PLS_Toolbox programvara med standardinställningen.
- Summera värdena mellan 2910 – 2965 cm-1 för att erhålla intensitetsvärden under varje Raman-spektrum från de 26 stegen i följd som visas i figur 3A via funktionen Summa i MATLAB.
- Interpolera instrumentets offsetvärde (värdet i X-axeln i figur 3B) från 26 – 260 med hjälp av LINSPACE -funktionen i MATLAB.
- Interpolera intensitetsvärdet från 26 till 260 med hjälp av spline -metoden i MATLAB och utnyttja de nyligen genererade positions värdena för 260.
- Använd MATLAB: s polyfit -och polyval -funktioner för att få den nya uppsättningen intensitetsvärden med 260 punkter. Använd först 260 position och intensitetsvärden som X-och Y-ingångar för polyfit -funktionen. Ställ in gradvärdet till 20. Använd sedan de utgående koefficienterna och 260 utökade positionsvärden som indata för polyval för att få de slutliga 260 intensitetsvärdena.
- Använd MATLAB: s Max -och min -funktioner för att identifiera max-och minimipoängen från de nyligen interpolerade 260 intensitetsvärdena.
- Beräkna medelintensitetsvärdet genom att dividera summan av det högsta och lägsta intensitetsvärdet med två.
- Identifiera intensitetsvärdet från 260 intensitetsvärden (beräknat från steg 3.1.6) som ligger närmast medelintensitetsvärdet och ange dess motsvarande positionsvärde som hudyta. Ställ in detta positionsvärde som nollpunkten i X-axeln enligt illustrationen i figur 3B.
- Ändra alla andra positionsvärden enligt nollpunkten och den kända stegstorleken på 2 μm.
- Ta bort alla de spektra som samlats ovanför hudytan enligt deras positionsvärde.
- Importera resten av data till PLS_Toolbox att skapa en datauppsättning och byta namn på den "RamanData. mat".
- Ta bort avvikare Spectra med rums ljuseffekten.
- Ladda Raman spectra dataset (RamanData. mat) efter avlägsnande av out-of-Skin Spectra och genomföra PCA analys.
- Ladda datauppsättningen i PLS_Toolbox programvaran under MATLAB-plattformen och högerklicka på datauppsättningen för att välja analysera | PCA.
- Välj normalisera som förbehandlingsmetod och välj ingen för korsvalidering.
- Använd de tre komponenterna för PCA-sönderdelnings analysen som visas i kompletterande figur 2.
- Ta bort locket på in vivo Raman-instrumentets samlings fönster och samla in ljus spektra för rum i hög frekvens regionen med samma parametrar som används för datainsamlingen för referensmaterial.
- Identifiera rums ljuseffekt faktorn genom jämförelse med de ljusa bakgrunds spektra i rum som visas i tilläggs figur 3.
- Ta bort spektra med ett betydligt högre motsvarande poängvärde än normalt (mer än 99,8% av Poängvärdena för hela datamängden, som är 0,16 i denna studie).
4. Val av antal komponenter i MCR-sönderdelnings analys
- Korrigera Raman spectra baseline enligt samma metod som beskrivs ovan (avsnitt 3.1.2).
- Utför PCA-analysen på den förbehandlade datamängden enligt beskrivningen ovan (avsnitt 3,2) förutom att välja "pqn" – "Mean Center" i stället för "normalisera", och rita upp egenvärden i logaritmisk skala tillsammans med antalet komponenter (20) som standardnummer i nedbrytnings analysen genom att klicka på knappen Välj komponenter och välj log (Eigenvalues) som Y-värde. Välj tre till åtta som nummer på de komponenter som används för MCR-analysen.
- Utföra MCR-analys.
- Ladda datauppsättningen till programvaran MCR_main20 via knappen data markering .
- Välj antal komponenter (tre till åtta) genom att klicka på knappen bestämning av antal komponenter .
- Klicka på knappen ren under fliken Ursprunglig uppskattning , Välj koncentration under riktningen för fliken variabel markering och klicka på knappen gör .
- Klicka på OK och sedan på knappen Fortsätt till nästa sida.
- Klicka på Fortsätt på nästa sida och välj sedan fnnls och 6 under flikarna implementering och Nr. av arter med icke-negativitetsprofiler . Klicka på knappen Fortsätt .
- Välj samma parametrar som avsnitt 4.3.5 för den här sidan och klicka på Fortsätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna kliniska studie insamlades in vivo konfokalmikroskopi Raman spectra från 28 försökspersoner från 4 – 18 år. Sammanlagt 30 862 Raman spectra samlades in med datainsamlings protokollet som nämns ovan. Denna stora spektrala dataset innehåller 20% spektrala extremvärden som visas i figur 4A. Det låga signal-till-brus avvikare spektrat avlägsnades efter bestämning av hudytan, följt av PCA för att identifiera spektra med rum ljusfunktioner. Den tredje faktorn i denna PCA-modell är identifierade ljus toppar i rummet. Detta bekräftas genom jämförelse av belastnings spektra av faktor 3 med ett spektrum av lysrörsljus som samlats in separat på försöks platsen med hjälp av samma konfokala Raman-instrument (se kompletterande figur 3). Figur 4 B indikerar att de flesta av avvikare spektra togs bort efter denna process.
PCA utfördes på den förbehandlade konfokalmikroskopi Raman datauppsättningen och egen värdes tillsammans med antalet faktorer som används är plottas i figur 5. Enligt tidigare studier12,19, bör modellen innehålla minst tre komponenter: vatten, protein, och lipid. En signifikant minskning av egen värdes observerades för faktor 9 som visas i figur 5. Denna observation föreslår att man undersöker modeller med antalet huvudkomponenter som varierar mellan tre och åtta faktorer för införande i MCR-modellen. MCR-laster som innehåller spektroskopiska egenskaper som är mest överensstämmande med protein, vatten och lipid visas i figur 6.
Figur 1 . Illustration av lesion och icke-lesion märke på underarm. A) ett3 cm x 4 cm markerat område på en lesionsplats. B) ett 3 cm x 4 cm markerat område på en icke-lesionsplats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Illustration av den konfokala Raman datainsamling. A) konfokala Raman-instrument. (B) spektra samling på under armen av mänskligt ämne. C) en skärmdump av referenspositionen för uppgiftsinsamling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Bestämning av hudytan. A) integrering av protein området under varje Raman-spektrum. B) inställning av hudytan baserat på högsta och lägsta poäng. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Raman dataset Spectra. A) konfokala Raman-spektra innan uttagning av avvikare-spektrat. B) konfokala Raman-spektra efter avlägsnande av avvikare-spektrat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Bestämning av antal komponenter från PCA-analys. A)eigenvalue på en logaritmisk skala som ritas som en funktion av antalet komponenter som används i PCA-modellen. B) skillnader i egenvärden mellan "n" och "n + 1"-komponenterna Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Jämförelse av lastnings formen med motsvarande referensmaterialspektra med tre till åtta komponenter i MCR-modell. A) proteiner, (B) vatten och (C) lipidfaktorers form med tre till åtta komponenter i MCR-modellen jämfört med BSA-, vatten-respektive lipidreferensmaterial-spektra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . De ytterligare tre belastningar från sex komponent MCR-modellen som inte används i den slutliga modellen. Dessa tre MCR-komponenter domineras av fluorescens och baslinje artefakter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Illustration av bestämning av hudytan där mitten av laser fokus vidrör huden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2. Illustration av urvalet av tre komponenter i PLS_Toolbox Software PCA-analysen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3. Identifiering av belastningsfaktorn som domineras av rums ljus ovanpå ett referens spektrum av rums ljus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4. Jämförelse av belastningar från MCR-modellen före och efter avlägsnande av kosmisk strålning. (A), (B), och (C) är de faktorer som representerar vatten, protein, och lipid, respektive. De ytterligare belastningsfaktorer som inte används i den slutliga MCR-modellen är d, e och f. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 5. Raman spektra av typiska lipidmaterial i stratum hornlagret. (A) kolesterol 3-sulfat natrium och kolesterol. BOleic, Palmitic, palmitoleic och stearinsyra. CSqualene. D-behenoyl-d-erythro-Sphingosin, n-Lignoceroyl-d-erythro-sphinganine och D-Erythro-Dihyrosphingosine. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under datainsamlingen, som beskrivs i avsnitt 2 och 3 i protokollet, samlades varje djup profil i ett område med kontakt mellan instrument fönstret och huden genom att hitta de mörkare områdena från de mikroskopiska bilderna som belystes i de röda cirklarna i Figur 2C. När dessa områden var placerade var det viktigt att starta djup profilen ovanför hudytan för att exakt bestämma placeringen av hudytan för dataanalys proceduren. Placeringen av hudytan användes därefter för att bestämma det relativa djupet för varje spektrum i motsvarande djup profil. Som nämnts i avsnitt 1 i protokollet, ger start av djup profilen 10 μm ovanför hudytan fem datapunkter utanför huden. Detta gör det möjligt att framgångsrikt bestämma platserna för den maximala och minsta signalintensiteten på båda sidor av hudytan. Det är också viktigt att undvika att mäta platser som innehåller pennmarkeringar och högre pigmenterade områden som fräknar, eftersom dessa områden ger en hög fluorescens bakgrunds signal. Valet av exponeringstid är en avvägning mellan spektralkvalitet och Mät längd. Längre exponeringstid förbättrar signal-till-brus och avsevärt ökar den totala Mät tiden. Men många ämnen tycker att det är utmanande att förbli orörlig under längre tidsperioder. Det är till exempel oerhört utmanande för barn. Ökande lasereffekt ökar signalen till brus. Men för mycket makt kan skada huden på grund av absorptionen av energin. De största tillåtna exponeringarna, 17 mW lasereffekt enligt definitionen i den kinesiska nationella standarden (GB 7247.1-2012) och den internationella laser säkerhetsstandarden (IEC 60285-1:2007, < 20 mW för 671 nm och < 30 mW för 785 nm), får inte överskridas. Andra säkerhetsåtgärder inkluderar att se till att varje ämne är klädd i ögonskydd före datainsamling, att kropps platser har en individuell topologi vinkel (ITA) värde högre än 40, och undvika områden med hög hudpigmentering.
För att bestämma placeringen av hudytan, området under proteinet Raman Peak (2910-2965 cm-1) integrerades för att få djup profilen av protein signalen. Raman spectra var första baseline-korrigerad med hjälp av den automatiserade vägda minsta kvadratiska metoden från PLS_Toolbox före integrationen av topparna. De 26 datapunkterna från en djup profil interpolerades till 260 punkter med hjälp av linspace -metoden för instrument offset vaue (X-axelvärdet i figur 3A) och spline -metoden för motsvarande intensitetsvärde. De resulterande uppgifterna interpolerades på en 20: e beställning polynom med hjälp av polyfit och polyval funktioner i MATLAB och den högsta och lägsta poäng av interpolerade data fastställdes. Medelintensitetsvärdet beräknades genom att dividera summan av maximi-och minimivärdena med 2. Hudytan definierades som den plats där intensitetsvärdet från den interpolerade djup profilen var närmast Medelintensiteten. Den exakta placeringen av hudytan behöver inte sammanfalla med en experimentell datapunkt. Denna metod kan endast mäta ett begränsat djup av huden på grund av absorption och spridning av strålen21. Samla in spektroskopiska data under ~ 50 μm under hudytan kan kräva betydande förändringar av de experimentella parametrarna.
Som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet, efter avlägsnande av avvikare Spectra med låg signal-till-brus och höga bidrag från rummet ljus, förblev en liten del av spektra som innehåller kosmisk strålning i datamängden. En jämförelse av de inläsnings spektra som genererats före och efter avlägsnande av kosmisk strålning visas i kompletterande figur 4. En jämförelse av belastnings spektra som visas i kompletterande figur 4 indikerar att effekten av ett litet antal spektra med kosmisk strålning var försumbar. De tre faktorerna som representerar vatten, protein och lipid var identiska, och de ytterligare tre belastningar som är förknippade med buller och spektralartefakter var också mycket lika. Detta kan tillskrivas en låg förekomst av kosmisk strålning i spektra (~ 0,25%) eftersom placeringen av kosmiska strålar i spektra är slumpmässiga.
Valet av nummer på de komponenter som används i MCR-analysen är kritiskt, eftersom tolkningen av loadings form i termer av motsvarande molekylära arter som ansvarar för varje lastning väsentligt påverkar både hur motsvarande Poäng värden används och övergripande metod prestanda. Enligt beskrivningen i avsnitt 4 i protokollet utfördes PCA först för att undersöka den egen värdes evolution som är förknippad med ökningen av antalet komponenter. Denna undersökning användes för att identifiera antalet komponenter som bör användas i följande MCR-analys. Plottning av egen värdes på en logaritmisk skala kan göra denna identifieringsprocess enklare än att undersöka de råa egenvärden, som visas i figur 5a. Varje egen värdes är en representation av variansen som en komponent kan fånga. Ju större eigenvalue, desto mer varians denna komponent kan modellera i spektra. Eigenvalues med liknande storlek bör väljas eller elimineras tillsammans22. Efter denna riktlinje övervägdes två, fem och åtta komponenter för MCR-analysen eftersom komponenterna tre, fyra och fem producerar egenvärden liknande i storlek. En liknande trend observerades också för komponenterna sex, sju och åtta. Figur 5 B är en sammansvärjning av skillnaden i egenvärden mellan "n" och "n + 1"-komponenter som visar lokala Maxima efter de andra, femte och åttonde komponenterna. Förkunskaper om den molekylära sammansättningen av huden kombinerat med studiens utformning stöder minst tre komponenter som krävs för att modellera den höga frekvensen Raman spectra. Därför har flera MCR-modeller som innehåller tre till åtta komponenter undersökts och belastningarna jämfördes med spektra från referensmaterial för att identifiera de nyckelkomponenter som krävs för den slutliga modellen.
Jämförelse av belastningar med Raman-spektra från referensmaterial gör det lätt att identifiera och tilldela två av de sista MCR-komponenterna till protein och vatten eftersom de dominerar MCR-belastningarna för alla testade modeller och matchar motsvarande referens spektra, som är BSA och DI vatten. De förväntade spektroskopiska egenskaperna hos lipider i vissa av MCR-komponenterna var dock en svagare matchning till lipidreferenspektrat som illustreras i MCR-modeller som innehåller tre och fyra komponenter. Dessutom observerades kvarvarande protein toppar (2840 – 3000 cm-1) i MCR-vattenbelastningarna för alla modeller testade under sex komponenter. Baserat på dessa observationer användes en sexkomponentmcr-modell i den slutliga MCR-analysen. Tre av de sex komponenterna tilldelades vatten, protein och lipid genom att matcha deras laddnings spektrum med motsvarande referens spektrum. Tolkningen och tilldelningen av lipidfaktorn baseras på en jämförelse mellan lastningen och Raman-spektrat av tre representativa ceramid-material, inklusive N-behenoyl-D-erythro-sphingosin, N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine och D-Erythro-Dihyrosphingosine. Raman-spektrat av andra lipidmaterial i stratum hornlagret undersöktes också. Dessa material inkluderar fettsyror (oljesyra, Palmitic, palmitoleic, och stearinsyra), kolesterol (kolesterol 3-sulfat natrium och kolesterol), och Squalene, som visas i kompletterande figur 5. Lipidfaktorn som användes i den slutliga MCR-modellen var en stark matchning till Ceramide Spectra och överensstämde med andra material som innehåller långkedjiga kolväten. De övriga tre MCR-komponenterna dominerades av fluorescens och baslinje artefakter och deras motsvarande poängvärden användes inte i några beräkningar. Dessa tre komponenter visas i figur 7.
Den övergripande analysmetod som presenteras i detta manuskript ger en slutlig metod med förbättrad specificitet och noggrannhet för att mäta de viktigaste komponenterna i huden jämfört med andra Single Peak eller Peak-fitting metoder. Denna metod visar att kritiska komponenter kan extraheras från en klinisk datauppsättning som innehåller en relativt liten bråkdel av dåliga spektra. Framtida insatser är inriktade på automatisering av denna metodik i ett programpaket för att förbättra dess effektivitet och minska den mängd teknisk expertis som krävs för analysen. Liknande metodik utvecklas för Raman spectra som samlats i fingeravtrycks regionen (400 – 1800 cm-1) med hjälp av en 785 nm laserkälla i stället för 671 nm-lasern som ingår i samma instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner starkt det ekonomiska stödet från Corporate funktion analytisk och personlig rensning vårdavdelning. Vi vill uttrycka vår tacksamhet till analytiska biträdande direktörer MS Jasmine Wang och Dr Robb Gardner för deras vägledning och stöd och MS Li Yang för hennes hjälp med datainsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth - scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , Springer. Berlin Heidelberg. (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients' stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , Erasmus MC: University Medical Center. Rotterdam. (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
