Summary
本研究では、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)に感染した単球由来樹状細胞におけるオートファジーフラックスを妨害する阻害剤およびsiRNAベースの戦略を提示する。
Abstract
単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、未熟樹状細胞(iDC)と成熟樹状細胞(mDC)の両方でオートファジーを誘導するのに対し、自己ファジーフラックスはiDCでのみ観察されます。機械的な洞察を得るために、HSV-1誘発オートファジー回転を妨害する効率的な戦略を開発しました。阻害剤ベースの戦略は、HSV−1誘導オートファジーを調節するために、それが容易かつ迅速な方法であるので、第一選択を構成する。このような化合物の潜在的な非特異的なオフターゲット効果を回避するために、HSV-1感染時のiDCにおけるオートファジー回転を調節する代替siRNAベースの戦略を開発しました。実際、HSV-1感染前のFIP200特異的siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションは、FIP200タンパク質発現を棄却し、それによって自己形成フラックスを阻害する非常に特異的かつ成功した方法である。両方の提示された方法は、iDCにおけるHSV−1誘導オートファジー回転の効率的な阻害をもたらし、それによってsiRNAベースの技術はより標的特異的である。KIF1BおよびKIF2Aのタンパク質発現を選択的に沈黙させ、mDCにおけるHSV-1感染時の自動ファジーックターンオーバーを促進する追加のsiRNAベースのアプローチが開発された。結論として、siRNAエレクトロポレーションの技術は、選択的に異なるタンパク質の発現を棄却し、HSV-1感染に及ぼす影響を分析する有望な戦略を表す。
Introduction
ヒト単球由来樹状細胞(DC)の生成は、この重要な免疫細胞型の機能および生物学を研究するための適切なin vitroモデルを構成する。DCへの単球の単一化と同様に分離は、近年1、2で確立されている。αヘルペスウイルスヘルペス単純型ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるDCの感染は、DC生物学2、3、4、5、6のHSV-1媒介変調を研究するモデルシステムとして機能する。.これは、ヘルペスウイルスが強力な抗ウイルス免疫応答を減衰または阻害する方法を解明し、宿主7、8内の免疫特権ニッチにおける遅延を確立する方法を解明するために特に重要である。この点で、ヘルペスウイルスは、地理的領域9に従って最大90%の血清有病率に達する集団全体に広がっている非常に成功した病原体である。これを理解し、おそらく防ぐために、宿主の免疫系、特にDCなどの免疫細胞のHSV-1媒介変調に関するより多くの洞察が必要です。
HSV-1とのDCの相互作用に関する全く新しい観察は、最近、トゥーランら10によって発表されました。著者らは、HSV-1レプリケーションの達成はDCの成熟状態に厳密に依存することを実証した。iDCでは、HSV-1の完全な複製はオートファジー依存機構によって容易にされる。HSV1 は iDC と mDC の両方でオートファジーを誘導しますが、オートファジーフラックスは iDC でのみ観察されます。これは今度は、iDCの核ラミンの自動ファジーック分解を介してウイルスキャプシドの核出口を促進する。iDCとmDCにおけるこのHSV-1誘導劣化経路に関する機械的洞察を得るためには、オートファジーフラックスを調べるには、新しく効率的な戦略が不可欠です。
マクロオートファジー(オートファジー)は、リソソーム消化のための細胞内タンパク質または全オルガネラを標的とする十分に保存された多段階プロセスである。単純化的に、オートファジーは、(i)開始、(ii)膜核形成、(iii)小胞膨張、および(iv)オートファゴソーム-リソソーム融合相12に分けることができる。開始(i)の間、活性化ULK1/2キナーゼ複合体のような成分は、200kD(FIP200)の焦点接着キナーゼファミリー相互作用タンパク質を含み、beclin-1-Vps34-AMBRA1複合体を活性化するために重要である。続いて、膜核形成(ii)は、p6214などの分子によってマークされた細胞質貨物を巻き込む貪食形成13を開始する。小胞膨張およびオートファゴフォア成熟(iii)微小管関連タンパク質軽鎖3(LC3)-Iは、オートファゴソーム膜に挿入されるその脂質型LC3-IIに変換される。従って、LC3-Iから-IIへの変換速度は、成熟オートファゴソーム15、16の形成をミラー化することによってオートファジー誘導のための指標である。オートファゴソームリソソーム融合(iv)の際には、オートファジーカル貨物だけでなく、関連するp62およびLC3-IIタンパク質も分解を受ける(例えば、加水分解による)。したがって、p62およびLC3-IIの損失は、オートファジーフラックス17のマーカーとして機能する。オートファゴソームとリソソームの融合は、オートファジーターンオーバーに続き、細胞内リソソーム局在化に大きく依存する。これは、とりわけ、キネシンファミリーメンバーKIF1BおよびKIF2Aによって調節され、オートファゴソームリソソーム融合18に悪影響を及ぼすことが示された。興味深いことに、KIF1BおよびKIF2Aのタンパク質発現は、DC成熟時に誘導され、それによって完全なHSV-1複製10を妨げるHSV-1感染したmDCにおける非効率的な自己ファジーフラックスを担っている。
オートファジーを調節する実験的試みは、この特定の経路19、20、21を誘導または阻害することが知られている化合物の使用を含む。本研究では、HSV-1感染iDCにおけるオートファジー回転を遮断する2つの阻害剤ベースの戦略について述べ上す。我々の実験で用いられる最初の化合物は、オートファジー22の開始段階におけるベクリン-1-Vps34-AMBRA1複合体分解を促進するために記載された特異的かつ強力なオートファジー阻害剤-1(スパウチン-1)である。本研究で用いられる第2の化合物は、後期オートファジー事象を遮断するV-ATPアーゼ阻害剤であるバフィロマイシン-A1(BA1)である(すなわち、オートファゴソーム-リソソーム融合ならびにオートリソソーム酸性化)23、24。HSV-1によるiDC感染前のこれら2つの阻害剤のいずれも使用するとオートファジーを強力に阻害するが、効率的なウイルス遺伝子発現を妨げない。したがって、HSV-1感染前のこの阻害剤ベースの戦略は、HSV-1誘導性自己ファジーフラックスを阻害する強力なツールを提供し、異なる細胞型やウイルスの多くに対して容易に膨張させることができ、オートファジーを誘発する可能性もある。
阻害剤ベースのアプローチの大きな欠点(すなわち、非特異的なオフターゲット効果)を克服するために、我々は(HSV-1感染した)iDCにおける自己ファジークフラックスを遮断するsiRNAベースの方法を開発した。siRNAエレクトロポレーションの技術は、異なるタンパク質(すなわち、オートファジー成分)の発現の選択的アブレーションを介して、強力な代替戦略を表す。我々の実験では、iDCをエレクトロポレーション装置I(材料表参照)とGerer et al.(2017)およびPrechtelら(2007)によって記載された改変プロトコルを用いてFIP200特異的siRNAで電気化し、中のオートファジーを阻害する。開始フェーズ25,26.この技術により、iDCにおけるFIP200発現を特異的にノックダウンすることができました。注目すべきことに、HSV-1感染は、効率的なウイルスタンパク質発現によってミラーリングされたこれらの電気合成iDCにおいて確立された。このsiRNAベースの技術は、独自の利点(すなわち、様々な異なるオートファジー成分が組み合わせてであっても)、その発現のアブレーションを特異的に標的にすることができるというユニークな利点を提供する。
本研究では、HSV-1感染mDCにおいてもオートファジーフラックスを誘導するsiRNAベースの方法についてさらに説明する。この場合、iDCは、エレクトロポレーション装置IIを用いてDC成熟前にKIF1BおよびKIF2Aを対象としたsiRNAで電気ポポー化した(材料表参照)。両方のタンパク質はDC成熟時にアップレギュレートされ、リソソーム10、18とオートファゴソームの融合を否定的に調節することが知られているので、HSV-1感染時にmDCのオートファジーフラックスを強く誘発するノックダウン。これにより、siRNAベースの技術により、mDCにおけるKIFタンパク質発現を妨害することでオートファジーターンオーバーを特異的に誘導することができ、iDCにおける発現レベルを模倣することができました。
要約すると、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを阻害する2つの異なる方法を提示する。第1の阻害剤ベースのアプローチは、オートファジー分解を妨害する簡単で安価で迅速な方法を構成するが、第2のsiRNAベースの技術は、より具体的で、阻害剤ベースの結果を支持し、検証するための非常に適切な方法である実験。また、2つのKIFタンパク質のsiRNA媒介性ノックダウンを介して、HSV-1感染mDCにおいても自己泳束を誘導する方法について説明する。
Protocol
単球由来DCは、健康なドナーの白血球化産物から生成された。このため、地方倫理委員会から肯定的な投票が得られた(参照番号4556)。本研究の実験は、「フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテット・エアランゲン=ニュルンベルク」の倫理委員会の勧告に従って行われた(参考番号4556)。すべての寄付者は、ヘルシンキ宣言に従って、書面によるインフォームド・コンセントを承認しました。
1. 未熟樹状細胞(iDC)及び成熟樹状細胞(mDC)の生成と取り扱い
- ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、前述の27のように白血縮系チャンバ(LRSC)から単離する。PBMCの凍結保存を避け、分離時に直接使用して、より高いDC収率を得ます。
- 前述の10、27に記載のT175細胞培養フラスコにおける異なる健康ドナーのPBMCからヒトDCを生成する。簡単に言えば、30mLのDC培地(L-グルタミンを含まないRPMI 1640、1%(v/v)AB-血清、100 U/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン、0.4 mM L-グルタミン、10mM HEPES)細胞を単細胞の浸着細胞1株当たりに使用する。1時間後、RPMI 1640を用いて非付着画分を洗い流す。800 U/mL GM-CSFおよび250 U/mL IL-4を補充した新鮮なDC培地を加え、3日間インキュベートする。
- 3日目のポスト付着で、GM-CSFとIL-4を含む新鮮なDC培地を5mL追加し、それぞれ400 U/mL、細胞培養フラスコあたり250 U/mLの最終濃度をDC分化にします。
- iDCを収穫するには、細胞培養フラスコの底部から緩やかに接着したiDCを軽く洗い、4日目に付着した後にすすすします。この手順を 2 回繰り返します。mDCの生成には、GM-CSF(最終濃度:40 U/mL)、IL-4(最終濃度:250 U/mL)、IL-6(最終濃度:1000 U/mL)、IL-1β(最終濃度:200U/mL)、TNF-α(最終濃度:10ng/)で構成される成熟カクテルを追加します。mL)、プロスタグランジンE2(PGE2;最終濃度:1μg/mL)。
- 6日後の付着後(サイトカインカクテルを用いた成熟誘導の2日後)、細胞培養フラスコの底部からmDCをリンスする。この手順を 2 回繰り返します。
注:未熟なDCと成熟したDCは、1細胞培養フラスコ内の同一のドナーから順次生成することができる。これを行うには、(i)iDCの適切な数を分離し、(ii)ステップ1.2.2に記載されたサイトカインカクテルを使用してフラスコ内の残りの細胞の成熟を誘導する。
- それぞれの細胞培養培地のiDCまたはmDCを50mLチューブに移します。300 x gで5分間遠心分離を介して細胞を収穫します。
- 細胞培養フラスコあたり5~10 mLのRPMI 1640でDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)します。それぞれのDCサスペンションを1本のチューブに組み合わせます。
- 棚卸室または別の方法を使用してセル番号を定義します。iDC を取り扱う際の温度変化を避け、フェノールトの変化のリスクを軽減します。
2. フェノチピック成熟状態を監視するフローサイトメトリック解析
- iDC または mDC (0.5 x 106)をステップ 1.3.1 から 1.5 mL チューブに転送します。3390 x gで遠心分離を介して細胞を1.5分間収穫し、FACS緩衝液(2%胎児子牛血清(FCS)を補充したPBS)で細胞を一度洗浄します。
- 定義された表面分子に対する特異的フルオロクロム標識抗体を含む抗体染色溶液(FACSバッファー)の100μLで細胞を再中断する。
- 以下の抗体を使用して、純度(CD3-FITC、CD14-PE)およびDC(CD80-PacBlue/-PE-Cy5、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7)の成熟状態を検証します。
- コントロールとして100°LのFACSバッファに染色されていないサンプルを1つ用意します。
- 暗闇の中で細胞を氷の上に30分間染めます。
- その後、FACS緩衝液1mLで細胞を2回洗浄し、3390 x gで1.5分間遠心分離機を洗浄する。
- 最後に、2%PFAを補完したFACS緩衝液の200μLで細胞を再サスペンドし、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。固定細胞は、2日間まで暗闇の中で4°Cで保存することができます。
3. 単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)によるDCの感染手順と、スパウチン-1またはバフィロマイシン-A1を介したHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉
注:本研究で使用した株HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43(HSV-1 EGFP)は、実験室株HSV-1株17+から得られた。HSV-1 EGFP株は、CMVプロモーターの制御下でUL43遺伝子遺伝子座に挿入された増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する。EGFPはHSV-1感染のマーカーとして機能する。さらに、株HSV1-RFPVP26は、DC感染研究に使用された(前述のトゥーランら、2019年参照)。このウイルスは、カプシド表面タンパク質VP26をモノマー赤色蛍光タンパク質(mRFP)に融合して発現する。
- iDC または mDC (2 x 106)をステップ 1.3 から 2 mL チューブに転送します。その後、3390 x gの細胞を1.5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- 感染培地(RPMI 1640 20 mM HEPESを添加)で細胞を穏やかに再中断します。
- オートファゴソーム・リソソーム分解経路を阻害するには、感染前にスプーチン-1またはバフィロマイシン-A1 1時間でDCを前処理する。感染媒体に10μMスパウチン-1または1μM BA1、またはDMSOを未処理のコントロールとして追加します。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。
- 感染研究では、2の感染の多重度(MOI)でHSV-1ビリオンで細胞を接種します。MNT緩衝液のそれぞれの体積(30mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、100 mM NaCl、20 mMトリス)をモックコントロールとして加えます。300rpmで300rpmで1時間揺れる加熱ブロック内の細胞をインキュベートする。
- 1時間後感染(hpi)、3390 x gで細胞を1.5分集め、GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mL、および10μMスパウチン-1、1μM BA1、またはDMSOを含むDC培地中の細胞を穏やかに再サスペンドします。種子模擬処理およびHSV-1感染細胞を最終濃度1x 106/mLで6ウェルプレートに入れた。
- 16~24 hpiで、すすす(mDC)またはセルスクレーパー(iDC)を使用して細胞を収穫します。細胞を1.5 mLのセーフロックチューブに移します。
- 3390 x gで1.5分間遠心分離で細胞を採取し、1mLのPBSを加えてペレットを1回洗浄します。
- 2x Roti-Loadの29°L、1μL 100 mM MgCl2および12.5 U/mLベンゾマーゼを含むリシスミックス中の細胞を激しく再サスペンドします。
- ベンゾラーゼを用いた細胞リシスおよびDNA消化の場合、サンプルを37°Cで10分間インキュベートします。その後、タンパク質を95°Cで10分間変性する。
- SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実行して、LC3BI/II、p62、ICP0/5、およびGAPDHのタンパク質レベルを検証します。
4. FIP200-siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションによるHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉
注:siRNAエレクトロポレーションの本プロトコルは、Prechtelら(2007)およびGererら(2017)から改変された。
- iDC (12 x 106) を 3.5 日目に 50 mL チューブに転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。並行して、フローサイトメトリック分析を実行して、ステップ 2(CD80-PacBlue の代わりにライフ/デッドバイオレットを使用)の説明に従って成熟状態を監視します。
- フェノールレッドなしでOptiMEMの5 mLでiDCを軽く洗浄し、細胞を300 x gで5分間遠心分離します。細胞を氷の上に置き、温度変化を避けてください。迅速に移動し、フェノールレッドなしでOptiMEMのiDCの長い潜伏期間を避けてください。
- FIP200特異的siRNAの75pmolまたはスクランブルsiRNAの75 pmolのいずれかをコントロールとして、4mmの電気キュベットに移し、細胞懸濁液の100μL(6x106細胞)を加える。エレクトロポレーション装置Iを用いて直接パルスiDC、以下の設定を適用する:500V/1ms。
- 実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。試料を電気分解する前に、テストパルスを行います。
- エレクトロポレーション後、新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mLとIL-4の250 U/mLを補足)でiDCを6ウェルプレートに直接移します。細胞を1 x 106/mLの最終濃度で播種し、インキュベーターに入れ子にします。エレクトロキュベットから細胞をすすり抜けないでください。
- 48時間後、まず電気ポレーションされたiDCの形態を顕微鏡で調べる。次いで、細胞スクラップを用いて細胞を収穫し、15mLチューブに移す。0.01%EDTAを補充した1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに溶液を転写します。
- 続いて、次のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6 x 10 6 iDCを分割する。
- 0.5 x 106細胞を使用して、ステップ2で説明したように成熟状態および細胞生存率を評価する。CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。
- ウェスタンブロット解析には1 x 106セルを使用して、FIP200固有のノックダウン効率を検証します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を移し、収穫します。
- HSV-1感染実験には残りの細胞(4.5 x 106)を使用してください。実験条件ごとに、2.25 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。
- 20 hpiで、細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、ステップ3.4で説明したようにウェスタンブロット分析のために細胞溶解物を調製する。
5. KIF1B/2A-siRNAエレクトロポレーションを用いたHSV-1感染mDCにおけるオートファゴソーム-リソソーム経路の変調
- 4日目にiDC(24 x 106)を50 mLチューブにポスト付着して転送します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- PBSの8mLでiDCを穏やかに再サスペンド(=洗浄)し、3x 106/mLの最終細胞濃度を調整する。3 x 106細胞を1.5mLチューブに移し、3390 x gで1.5分間収穫します。
- サプリメントミックスを含むバッファP3の100μLでiDCを再サスペンド(メーカーの指示に従い、エレクトロポレーションキット装置II)と(i)KIF1B特異的siRNAの75 pmol、(ii)KIF2A特異的siRNAの75 pmol、または(iii)両方。(iv)スクランブルsiRNAの各量を対照として用いる。siRNA条件ごとに2本のチューブ(6 x 106細胞)を準備し、懸濁液を別々のエレクトロキュベットに移します。エレクトロポレーション装置IIを用いてパルス「EH-100」を印加する直接パルスiDC。
- 実験手順の前に、メーカーの指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、アリコートし、-20°Cで保存します。エレクトロポレーションにこれらのsiRNAを使用する場合は、解凍し、氷の上に保ちます。氷の上にiDCを置き、温度変化を避けないでください。迅速に移動し、PBSまたはバッファP3内のiDCの長いインキュベーションを避けてください。
- エレクトロポレーション直後に、500 μL の事前温め RPMI 1640 をエレクトロキュベットに追加します。インキュベーターで細胞を5~10分間インキュベートし、iDCを新鮮な事前温めDC培地(GM-CSFの40 U/mL、IL-4の250 U/mLを補充)で6ウェルプレートに移します。それぞれの条件を1つのウェルに結合し、1·106/mLの最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れ子にします。
- インキュベーション後4時間、ステップ1.2.2に記載のサイトカインを含む成熟カクテルを加える。
注:エレクトロポレーション後2日のフローサイトメトリック解析の制御として、非エレクトロポレーションドDC(1 x 106)から1つのサンプルを準備します。制御細胞を電気ポレーションされたサンプルと同様に扱います。 - エレクトロポレーション後2日間、懸濁液により細胞を収穫し、15mLチューブに移す。1 mLのPBSで井戸をすすいで、それぞれのチューブに懸濁液を移します。以下のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6·10 6 DCを分割します。
- 0.25 x 106 DC(電気ポレーションおよび非エレクトロポレーション)を使用して、ステップ 2 で説明したように成熟状態とセルの生存率を確認します。CD80-PE-Cy5、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7、ライフ/デッドバイオレットの抗体を使用してください。
- ウェスタンブロット解析には0.75 x 106セルを使用して、KIF1B/2A特異的ノックダウン効率を評価します。3390 x gで1.5分間遠心分離して1.5 mLのセーフロックチューブに細胞を集め、ステップ3.4の説明に従って細胞溶解物を準備し、ウェスタンブロット分析を行います。
- 各siRNA状態から残りの細胞(5 x 106)を使用し、HSV-1感染実験を行います。実験条件ごとに、2.5 x 106 iDC を 2 mL チューブに転送し、2 の MOI で HSV-1 に感染させるか、MNT バッファをモック コントロールとして追加します。ステップ3.3の説明に従って感染を実行する。
- 20時間後の感染では、懸濁液によって細胞を採取し、ウェスタンブロット分析のために細胞溶解液を調製し、ステップ3.4で上述したようにHSV-1誘発オートファジー回転の誘導を検証する。
Representative Results
本稿では、樹状細胞におけるHSV-1誘導オートファジーを妨害する方法について説明する。これには、フローサイトメトリーによってフェノ典型的に分析されたヒト単球由来iDCおよびmDCの生成が含まれる(図1)。4日目のポスト遵守では、DCはCD80、CCR7、およびCD83の弱い発現と、高いCD11cおよび中間MHCII発現を特徴とする未熟な表現型を示す。CD3およびCD14シグナルが欠落しているため、T細胞および単球汚染を排除することができる。6日目のポスト付着(すなわち、成熟の2日目の誘導)において、DCはCD80、CCR7、CD83、およびMHC-II表面発現の有意な増加によって反映される成熟した表現型を示す。eGFP発現HSV-1株(図2)による感染により、iDC(図2A上部パネル)またはmDC(図2下パネル、図2B)の感染がほぼ完全に発生します。蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって分析される強いGFPシグナル。
最近のレポートで示されているように、HSV-1はiDCとmDCの両方でオートファジーを誘導しますが、iDCではオートファジー回転率が10回しか発生しません。最初のアプローチでは、iDC と mDC を spautin-1 (図 3A) で処理し、オートファジーの開始をブロックするか、バフィロマイシン-A1 (BA1;図3B)−最終的なオートファゴソームリソソーム融合を阻害する。スプーチン-1およびBA1がない場合のiDCのHSV-1感染では、オートファジーフラックスはそれぞれp62およびLC3B発現の低下によってミラーリングされる。対照的に、スパウチン-1がない場合のmDCのHSV-1感染はp62発現に影響を与えないが、スパウチン-1およびBA1治療はLC3B-IIの蓄積を誘発する。これはオートファジーの誘導を反映しているが、mDCにおけるオートファジー回転率の失敗である。iDCでは、スプーチン-1前処理は、開始段階でオートファジーの阻害に起因するHSV-1感染時のp62のオートファジー分解を強く回復する。BA1による前処理の際、モックおよびHSV-1感染iDCはLC3B-IIタンパク質レベルの強い蓄積を示し、後期オートファゴソーム-リソソーム融合を遮断することによってオートファジーックターンオーバーの阻害に成功したことを示す。これと一致して、mDCのスプーチン-1およびBA1前処理はまた安定したp62およびLC3B-IIタンパク質レベルの増加をもたらす。
オートファジーフラックスを損なう第2の方法では、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを遮断する能力について、FIP200を標的とするsiRNAエレクトロポレーションを検討する。図4Aに示すように、iDC48時間後エレクトロポレーションにおいて、FIP200タンパク質レベルが強く低下し、対照siRNAと比較して検出された。この時点で、iDCは細胞死の兆候を示しておらず(図4B)、未熟な表現型を維持している(図4C)。HSV-1によるFIP200沈黙iDCの感染は、対照siRNA処理型の対応と比較してオートファジーフラックスの強い減少を明らかにする(図4D)。これは、FIP200がHSV-1感染iDCで沈黙している場合、LC3Bのタンパク質レベルとp62の増加を伴う。
逆の試みとして、HsV-1感染mDCにおいても、KIF1BおよびKIF2Aタンパク質発現のsiRNA媒介アブレーションがオートファゴソーム・リソソーム回転を可能にするかどうかを検討した。したがって、iDCは、これらのタンパク質の一方または両方を標的とする特定のsiRNAを用いて電気合成し、その後細胞を成熟させた(図5)。エレクトロポレーション後2日間、mDCは、特定のsiRNAを使用した場合のKIF1Bおよび/またはKIF2Aタンパク質発現の強力な低下を示す(図5A)。この方法は、顕著な細胞死(図5B)にも、彼らのフェノチピック成熟状態の変化にもつながりませんでした(図5C)。オートファゴソーム・リソソーム分解時のKIF1BおよびKIF2Aの重要性を支持し、HSV-1感染前の枯渇はmDCにおけるオートファジーフラックスの増加を促進する。これは、それぞれの制御条件とは対照的に、残留p62タンパク質レベルの低下によって反映される(図5D)。
図1:フローサイトメトリーを用いたヒト単球由来iDCおよびmDCのフェノチピック特性評価DCを生成し、その純度を検証するために特定の抗体で染色した:(A)CD3はT細胞汚染を排除し、(B)CD14は単球による汚染を除外し、(C)CD11cはDCのマーカーとして。彼らの表色成熟状態を評価するために、以下の抗体を用いた:(D)CD80、(E)CCR7、(F)CD83、および(G)MHCII。これらの分子はmDC上で高度に発現しているため、未熟なDC表現型と成熟したDC表現型との間の判別を可能にする。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HSV-1に感染したiDCおよびmDCの顕微鏡およびフローサイトメトリック解析iDCおよびmDCは、GFP信号に基づいて感染速度の定量を可能にするために、EGFP(HSV-1 EGFP)を発現するHSV-1株に感染した。(A)GFP陽性HSV-1感染型iDCおよびmDCの顕微鏡分析は、2のMOIで感染し、24hpiで感染していない対応と比較した。感染細胞を可視化するために、GFP蛍光をモニタリングした。スケールバーは、感染動態中のモックまたはHSV-1感染mDCの400μm(B)フローサイトメトリック測定を表します。上部パネル(黒い裏地のヒストグラム)は模擬状態を示し、下部パネル(黒塗りヒストグラム)は、示されたタイムポイントが感染後にHSV-1感染細胞を示す。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スプーチン-1およびbアフィロマイシン-A1は、HSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスを調節する。iDCおよびmDCは、感染前に1時間(A)スパウチン-1または(B)バフィロマイシン-A1(BA1)で治療した。その後、2のMOIを用いて模擬またはHSV-1感染(HSV1-RFPVP26)を細胞化した。16〜18時間後、DCを採取し、タンパク質溶解剤をウェスタンブロッティングに供し、オートファジーマーカーとしてp62またはLC3B-I/-IIの発現を決定し、感染制御としてICP0、およびGAPDHをローディング制御として決定した。LC3B-IおよびLC3B-IIタンパク質レベルを定量し、Bio1D(光学密度)を用いて参照タンパク質GAPDHに正規化した。正規化LC3B-I信号に対する正規化LC3B-IIの比率を示す。この図は、JCBに掲載された©2019 Turanらから改変され、適応されています。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:FIP200-siRNAエレクトロポレーションにおけるHSV-1感染iDCにおけるオートファジーフラックスの解析iDCをエレクトロポレーション装置I.(A)DCを用いて制御siRNAまたはFIP200特異的siRNAで電気ポポー化し、FIP200ノックダウン48hポストエレクトロポレーションの効率について分析し、ウェスタンブロット分析を行った。(B)細胞生存率ならびに(C)成熟状態は、水性サイトメトリーによるエレクトロポレーション(水色ヒストグラム)および48時間ポスト(濃い青色および灰色のヒストグラム)エレクトロポレーションの前に分析した。3つの異なるドナーの中央値が示されます。FIP200および未熟表現型の効率的なノックダウンを確認した後、細胞は2のMOIを用いてHSV-1感染(HSV-1 EGFP)を行った。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。(D)20時間後感染時に、細胞を自己戦マーカーとしてLC3B-I/-IIおよびp62の発現を決定するためにウェスタンブロット分析を行った。ICP5は感染制御として検出され、GAPDHは負荷制御として検出された。パネルAおよびDは、JCBで最初に公開された©2019トゥーランらから改変され、適応されています。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:KIF1Bおよび/またはKIF2AのsiRNA媒介アブレーションは、HSV-1感染したmDCにおけるオートファジー回転を調節する。iDCをKIF1B特異的および/またはKIF2A特異的siRNAと電気化し、ならびに制御siRNAを、エレクトロポレーション装置IIを用いた。4hポストエレクトロポレーションでは、成熟カクテルの添加を介して成熟を誘導した。48時間後のエレクトロポレーションで、DCは、ウェスタンブロッティングによるKIFノックダウンの効率、(B)細胞生存率、およびフローサイトメトリック分析を用いた(C)表現型成熟状態(2つの異なる)に関して分析した。ドナーが表示されます)。「w/o EP」はエレクトロポレーションなしで、成熟の誘導後を意味します。「ポストコントロールEP」は、制御siRNAを用いたポストエレクトロポレーションを意味する。「ポストKIF1B、KIF2A、KIF1B/2A EP」は、KIF1Bおよび/またはKIF2A特異的siRNAを用いたポストエレクトロポレーションを意味する。KIF1Bおよび/またはKIF2Aおよび成熟表現型の効率的なノックダウンを確認した後、細胞は2のMOIを用いてHSV-1感染(HSV-1 EGFP)を行った。データはFCSエクスプレス5.0を用いて分析した。(D)細胞をウェスタンブロット分析20時間ポスト感染に供し、オートファジーマーカーとしてp62の発現を評価した。ICP5は感染制御として、GAPDHは負荷制御として使用された。図A及びDは、JCBに掲載された©2019トゥーランらから改変・改変された。https://doi.org/10.1083/jcb.20180115110.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本プロトコルの範囲は、(i)ヒト単球由来iDCおよびmDCの取り扱い、(ii)HSV-1への感染、(iii)オートファジーを阻害することが知られている化合物による治療、および(iv)2つを用いたsiRNAによるエレクトロポレーションを含む異なる技術的な設定。本プロトコルを用いて、自動ファジーフラックスは、HSV-1感染iDCで遮断されるか、またはHSV-1感染したmDCに誘導され得る。
DC、特にiDCは非常に脆弱な細胞であるため、これらの細胞を操作するにはかなりデリケートなステップが必要です。DC生成では、より高い細胞収率を得るために、新鮮に分離されたPBMCを使用し、その凍結保存を避けることをお勧めします。さらに、その後の栽培を含む実験中にiDCを取り扱う場合は、過酷な温度変化や長時間の温度変化を防ぎます。さもなければ、iDCは表現型の変化を起こす可能性があるため、フローサイトメトリーによって未熟な表現型を検証する必要があります。iDC には、成熟した対応するマーカーとは対照的に、CD80、CD83、CD8628、29などの明確なマーカーがないことに注意してください。HSV-1を使用したiDCおよびmDCの感染は、確立された方法2、3、4、5、6、10である。私たちは、1または2のMOIが使用されている場合、DCがHSV-1感染の影響を非常に受けやすいことを示しました(図2)。私たちの手では、感染媒体の体積を低レベル(250-350°Lの1-3 x 106細胞)に保つことは、感染効率の向上につながります。
所定の明確な細胞経路を妨害する古典的なアプローチは、特定の化合物の使用です。オートファジーの様々な異なるモジュレーター、すなわち活性化剤ならびに阻害剤は、現在30で利用可能である。DCにおけるHSV-1誘導オートファジーに関しては、トゥランら(2019)最近、iDC10におけるオートファジー回転率に対するスプーチン-1およびバフィロマイシン-A1(BA1)の阻害効果を示した。オートファジー阻害のためのこの技術は、感染率もDC(特にiDC)の成熟状態も損なわれていないので、その後のHSV-1感染との組み合わせに適している。将来のアプリケーションでは、この阻害剤ベースのアプローチは、他の感染剤、飢餓などのストレス状態、ならびに異なる細胞タイプと組み合わせて適用することもできる。しかしながら、阻害剤を使用する場合、細胞生存率に重大な影響を及ぼすことなく、効率的なオートファジー阻害に適した濃度を決定する際に制限が生じる。阻害剤を使用する際の主な制限は、しかし、潜在的なオフターゲットまたは副作用の発生であり、誤解を招く結果31、32につながる可能性がある。
オートファジーを妨害する第2のアプローチは、本プロトコルでカバーされ、siRNA33、34、35を用いた具体的なノックダウンである。一方、エレクトロポレーション装置Iを用いてFIP200の発現を特異的に棄却し、iDCにおけるHSV-1誘導オートファジー回転を抑制した。一方、エレクトロポレーション装置IIを用いて2つの異なるKIFタンパク質(すなわち、KIF1BおよびKIF2A)を無音化し、HSV-1感染mDCにおけるオートファジーフラックスを容易にした。どちらのエレクトロポレーションプロトコルも、iDCのFIP200とほぼ完全なアブレーション、およびmDCのKIF1B/KIF2Aをほぼ完全にアブレーションし、ウェスタンブロット分析を介して検証された(図4A、図5A)。DCの生存率に影響を与えないエレクトロポレーション装置Iとは対照的に、エレクトロポレーション装置IIを用いたmDCのエレクトロポレーションは、死細胞の割合がわずかに高くなる(図4B、図5B).したがって、将来のアプリケーションでは、エレクトロポレーション装置は、iDCとmDCの両方に優先的に使用されるべきです。驚くべきことに、siRNAベースの技術は、オートファジーフラックスを調節するために、iDCまたはmDCのいずれかの後続のHSV-1感染と互換性がある。さらに、iDCの未熟な表現型もmDCの成熟表現型も、ポストエレクトロポレーションの後に変化しない。
FIP200特異的siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションは、HSV-1感染時の自動羽束の阻害と同様に、遺伝子ノックダウンのための効率的かつ高度に特異的な方法である。FIP200の特定のサイレンシングに加えて、このプロトコルは、オートファジーカスケード中に異なるステップで参加し、他のオートファジーコンポーネントを無音に適合させることができます。しかしながら、オートファジーの効率的なsiRNA媒介阻害のための適切な標的を同定することは、懸念のいくつかの側面を含む。第一に、オートファジー関連遺伝子(ATG)のノックダウン効率は、必ずしもオートファジーの効率的な阻害と正に相関するものではなく、36で沈黙している特異的ATGタンパク質に大きく依存する。第二に、異なるATGタンパク質は、オートファジーとは異なる経路にさらに関与しており、したがって、そのアブレーションはまた、副作用につながる可能性があります37,38,39.第三に、異なるATGは、冗長な機能を有し得、したがって、1つの成分のノックダウンは、オートファジーを阻害するのに十分ではないかもしれない(例えば、beclin-1およびbeclin-2)40。
また、DCのエレクトロポレーション装置I系エレクトロポレーションプロトコルもmRNAに適しており、PBMC25などの様々な追加の一次セルタイプに用いることができる。したがって、このシステムは、異なる一次細胞型に異なるRNA種を提供するための一般的な戦略を提供します。結論として、iDCの後続のHSV-1感染と組み合わせた阻害剤またはsiRNAベースのアプローチを用いて、オートファジーフラックスを阻害する2つのプロトコルを提示する。さらに、HSV-1感染時にmDCに自己ファジーフラックスを誘導するsiRNAエレクトロポレーションアプローチについて説明する。
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、ASに授与されたプロジェクトSTE 432/11-1を通じてドイツ研究評議会(DFG)によって支援され、LGに付与されたプロジェクト18-12-21-1を介して医学部(フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテット・エアランゲン・ニュルンベルク)からELANプログラムによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
| AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
| ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
| Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
| anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
| anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
| BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
| Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
| CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
| CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
| CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
| CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
| CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
| CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
| CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
| EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
| FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
| GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
| Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
| GM-CSF (4x104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
| HLA?DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
| HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
| ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
| ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
| IL-1β (0.1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
| IL-4 (1x106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
| IL-6 (1x106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
| KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
| KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
| LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
| L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
| Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
| Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
| Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
| N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
| Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
| Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
| p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
| Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
| PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
| PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
| Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
| Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
| RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
| Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
| Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
| RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
| Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
| TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
| Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
| Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
| Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
| Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
| WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |
References
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