İskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanması ve kendi kendine teslim edilen siRNA enjeksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için in vivo yöntemini tanımlıyoruz.
İskelet kası yaralanmadan sonra kendini yenilemek için muazzam bir kapasiteye sahiptir. Bu süreç esas olarak kas kök hücreleri tarafından tahrik edilir, ayrıca uydu hücreleri denir. Uydu hücreleri transkripsiyon faktörü Pax7 ifadesi ve istirahat iskelet kası bazal lamina altında konumları ile karakterizedir. Yaralanma üzerine, uydu hücreleri aktive olsun, ya yeni miyofiberler oluşturmak ya da hasarlı olanlar ile kaynaşmak için kendi kendine yenileme veya farklılaşma geçmesi. In vivo uydu hücrelerinin işlevselliği iskelet kasının kardiyotoksin bazlı yaralanma modeli kullanılarak araştırılabilir. İskelet kasının yenilenmesi sırasında bir genin işlevini incelemek için çoğunlukla transgenik fare modelleri kullanılmaktadır. Burada transgenik farelere alternatif bir yöntem salıyoruz, rejenerasyon sırasında uydu hücrelerindeki gen fonksiyonlarını araştırmak için, örneğin transgenik farelerin mevcut olmadığı durumlarda. Belirli bir iskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanmasını, diğer hücreler arasında uydu hücreleri tarafından alınan rejenerasyon kaslarına kendi kendine sağlayan bir siRNA enjeksiyonu ile birleştiriyoruz. Bu nedenle, transgenik farelere gerek kalmadan fizyolojik koşullar altında rejenerasyon sırasında uydu hücrelerindeki gen fonksiyonlarını analiz etmek için bir yöntem salıyoruz.
İskelet kası, toplam vücut ağırlığının yaklaşık %40’ını temsil eden ve gönüllü hareket sağlayan vücudun en büyük dokusudur. İskelet kasıdoku mimarisi esas olarak postmitotik oluşur, ölümcül farklılaşmış, multinükleozlu miyofenler yanı sıra periferik sinir sistemi çeşitli diğer hücreler, vasküler sistem, ve interstisyel hücreler1. Daha da önemlisi, iskelet kası yenilemek ve yaralanma veya hasar üzerine fonksiyon geri büyük bir kapasiteye sahiptir2. Bu süreç doku yerleşik kas kök hücreleri de uydu hücreleri3,4denir bağlıdır. Uydu hücreleri miyofiber ve bazal lamina arasında yer alır ve transkripsiyon faktörü Pax75,6,7ifadesi ile karakterizedir. Homeostatik koşullar altında, uydu hücreleri quiescent ama travmatik yaralanma nedeniyle aktive olsun, örneğin, eksantrik egzersiz yoluyla veya deneysel yılan zehri kardiyotoksin enjeksiyonu yoluyla6,8. Aktive edildikten sonra, Pax7 pozitif uydu hücreleri myod ve Myf5’i birlikte ifade eder, bu da kök hücreleri miyojenik farklılaşmaya adatır. Bağlılık faktörlerinin düzenlenmesine direnen uydu hücreleri, köklük potansiyellerini koruyacak ve kök hücre havuzunu gelecekteki talepler için doldurmak için bu niskene geri dönecektir. Miyojenik ata havuzunun genişlemesinden sonra transkripsiyonel ağlar, hücre döngüsü çıkışı ve terminal farklılaşmasını başlatmak için Miyojenin gibi farklılaşma faktörleri tarafından aktive edilir. Bu miyoprogenitorlar daha sonra birbirlerine veya miyonükleer etki alanının boyutunu korumak için miyoküleklei katkıda bulunan mevcut miyofiberler için sigorta. Miyofiberler Miyozin Ağır Zincir gibi terminal kas farklılaşma genlerini ifade eder. Son olarak, yeni oluşan miyofiberler büyümek ve iskelet kası fonksiyonel birimleri oluşturmak için olgun9,10.
İskelet kasının yenilenmesi kas hastalıkları veya yaşlanma dahil olmak üzere çeşitli koşullardan etkilenebilir11,12, hafif bozukluklar dan hayatı tehdit eden koşullara kadar, örneğin, Duchenne kas distrofisi13 , 14. Bu nedenle, rejeneratif tıp uydu hücre fonksiyonu 15 ,16hedefleyerek doğalrejeneratif güç kullanarak hasarlı veya arızalı iskelet kas dokusu geri amaçlamaktadır. İskelet kasının yenilenmesi sırasında endojen niş uydu hücrelerinin tam potansiyelini kullanmak için gereklidir. Deneysel yaklaşımlar miyofiberler17bitişik uydu hücrelerini izole etmek için mevcut olsa da, kendi çevresi ile uydu hücrelerinin hücresel ve sistemik etkileşimleri tam karmaşıklığı sadece in vivo recapitulated olabilir. Bu bağlamda, iskelet kas rejenerasyonu hakkında büyük bilgi fare yaralanma modelleri kullanılarak elde edilmiştir2,18.
Burada in vivo tibialis anterior kas kardiyotoksin kaynaklı hasar kök hücre aracılı rejenerasyon çalışması için özel bir deneysel fare yaralanma modeli tanıtmak. Kardiyotoksin, miyofik depolarizasyon ve nekroz neden olan bir yılan kaynaklı sitolitik toksin, tibialis ön kas içine enjekte edilir, hangi sırayla doku dejenerasyonu tetikler yenilenme. Akut rejenerasyon sırasında genlerin işlevini analiz etmek için, kendi kendine teslim siRNA’lar yaralanmadan sonra 3. Deneysel hayvanlar çeşitli zaman noktalarında kurban edilir ve tibialis ön kasları toplanır. Diseksiyon kasları dondurulmuş ve daha fazla kriyo-kesit için işlenir. İmmünofloresan mikroskopisi daha sonra rejenerasyon belirteçlerini analiz etmek için kullanılır. Bu yöntem, yabani tip fareler kullanarak iskelet kasının uydu hücresi tahrikli rejenerasyon sırasında tek bir genin işlevinin araştırılması için izin verir.
Burada transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan iskelet kasının yenilenmesi sırasında belirli bir genin işlevini araştırmak için bir yöntem salıyoruz. Bu yaralanma dan sonra gün 3 rejenerasyon iskelet kası içine kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonu ile kardiyotoksin indüklenen kas yaralanması kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Biz ayrıntılı kardiyotoksin ile kas yaralanması prosedürleri açıklanan, kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonu ve rejenerasyon ilerlemesini analiz etmek için hasat kasların işlenmesi. Yılan zehrinin iskelet kasına enjekte edilişini tüm kaslara etkili bir şekilde yaraladığını ve kendi kendine siRNA’ların diğer hücre tipleri arasındaki tüm uydu hücrelerinin yaklaşık %75’inde iskelet kasının yenilenmesi (Şekil 4, Şekil 5).
Özellikle dikkat tibialis anterior kasının homojen bir yaralanma üzerinde durulmalıdır yaralanma değişen derecelerde rejenerasyon sonucu etkisi ve bu yüzden de siRNA etkisi etkilenebilir beri. Ayrıca, tüm rejenerasyon alanı kendi kendine teslim siRNA enjekte edilmesi kritik öneme sahiptir. Rejenerasyon sürecinin analizi için, her zaman rejenerasyon iskelet kası benzer alanları karşılaştırmak için tavsiye edilir, bu nedenle, tibialis ön kası her zaman kas orta karın bölgesi karşılaştırmak için yarıya kesilmelidir. Kas analiz ederken, miyofiber bileşimi tibialis ön kas farklıdır ve bu nedenle farklı rejenere olabilir bu yana tüm kriyosection analiz edilmesi gerekir.
Uydu hücrelerinin işlevi bitişik izole tek miyofiberler kendi kültürü de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürler tarafından araştırılabilir17, transplantasyon ve indüklenen yaralanma sonrası iskelet kasırerererere analiz edilerek 18,19. İnvivo indüklenen yaralanma modeli, örneğin kardiyotoksin enjeksiyonu ile uydu hücrelerinin işlevini araştırmak, makrofajlar ve sistemik faktörlerin etkisinin araştırılması2. İskelet kası nın yaralanması çeşitli yollarla gerçekleştirilebilir, örneğin, eksantrik egzersiz, donma yaralanması, BaCl enjeksiyonu2 veya kardiyotoksin veya noteksi gibi yılan zehri enjeksiyonu18. Eksantrik egzersiz muhtemelen en fizyolojik yaralanma yöntemi iken, belirli bir kas yaralanması sadecesınırlıdır 20. Donma yaralanmaları, uydu hücrelerinin yaralanma bölgesine geçişi çalışmanın amacı olduğunda veya kasın sadece belirli bir kısmı yaralandığında uygulanabilir. Deneysel olarak donma yaralanmalarının dezavantajı, önceden soğutulmuş metal probu uygulamak için yapılması gereken açık cerrahidir. BaClenjeksiyonu 2 veya yılan zehirleri yaralanma en dramatik yöntemdir, bu nedenle en zorlu uydu hücresi fonksiyonu. Ayrıca, enjeksiyon minimal invaziv, cerrahi süresi, genel olarak, az beş dakika ve dikiş içermez, vb bu nedenle enfeksiyon riskini en aza indirmek.
Kas yaralanması çoğunlukla gen fonksiyonlarının kaybı fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için kullanılır, örneğin, Pax7 kaybı7,21. Özellikle yaşlı fareler bilimsel sorunun odak noktası ise, transgenik farelerin üretimi veya kullanımı genellikle mümkün değildir. Belirli bir geni hedefleyen kendi kendine teslim eden siRNA enjeksiyonu bu durumlarda uygulanabilir bir alternatiftir ve başarıyla kullanılmıştır22. Kısacası, farelerin tibialis anterior kası kardiyotoksin enjeksiyonu ile yaralandı ve fibronektin karşı yönlendirilen kendi kendine teslim siRNA’lar (FN) yaralanma dan sonra 3. Kaslar yaralanmadan 10 gün sonra incelendi ve siFN ile karıştırılmış siRNA kontrol koşullarında uydu hücre sayılarında önemli bir azalma gözlendi. SiRNA enjeksiyonundan 2 gün sonra tüm kas lysatlarında nakavt verimi kantitatif Real Time PCR ile belirlendi, ekspresyon düzeylerinde %58’lik bir azalma sağlandı ve doğum ve nakavt veriminin fonksiyonel için yeterli olduğu öne sürüldü. analizler22. Nakavt verimliliğini test etmek için alternatifler ya immünoblot ya da hedef gen karşı yönlendirilen antikorlar ile immünorfloresan analizleri vardır. In vivo enjeksiyonlar için kullanılan siRNA’nın etkinliği ve özgüllüğü, örneğin izole uydu hücrelerinde veya primer miyoblastlarda verimlilik test edilerek farelere enjekte edilmeden önce belirlenmelidir. Tek bir siRNA’ya karşı 4 farklı siRNA’dan oluşan akıllı bir havuzun kullanımı nakavt ın verimliliğini artırırken, aynı zamanda spesifik olmayan hedefleme riskini de artırır. Kullanılan tüm siRNA dizilerinin özgüllüğü, hedef dışı etkileri önlemek için hücre kültüründe test edilmelidir. Bir kontrol olarak, bir hedefolmayan şifreli siRNA tek başına bir siRNA enjeksiyonu enjeksiyon nedeniyle rejenerasyon sürecini etkileyebilir ve bu nedenle, kas ek hasar kullanılmalıdır. SiRNA enjekte zaman noktası bilimsel soruya ve hedef genin ifade profiline bağlıdır. Genellikle, kardiyotoksin yaralanması ndan sonra 3. Kardiyotoksin enjeksiyon hacmi oldukça yüksek olduğundan ve kas içine ek çözümler enjekte etmeden önce sıvı reabsorbsiyon yer almalıdır ilk siRNA enjeksiyonu için zaman noktası kardiyotoksin yaralanması ndan sonra en az 48 saat olmamalıdır. Genel olarak, siRNA’ların birden fazla enjeksiyonu veya farklı siRNA’ların bir kombinasyonu mümkündür, ancak yenileyici kas içine yapılan her enjeksiyonun ek hasara yol açtığını göz önünde bulundurmak gerekir.
Açıklanan yöntemin bir sınırlaması, gözlenen etkinin sadece uydu hücrelerindeki hedef genin yıkılmasına bağlı olmaması, bağışıklık hücreleri veya fibro-adipojenik progenitor hücreler gibi diğer hücre tiplerine atfedilmesi dir. Bu nedenle, bu deneyleri saf uydu hücrelerinin popülasyonunu araştıran deneylerle birleştirmek gerekir. Bir ya yüzen miyofiber kültürleri kullanarak deneyler yapabilir, uydu hücreleri komşu miyofiberler üzerinde kültürlü nerede ya da izole uydu hücreleri kullanarak transplantasyon deneyleri yapmak17.
Kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonuna alternatif olarak, bilimsel soruya bağlı olarak, yapIlebilen küçük molekül inhibitörleri veya rekombinant proteinlerin enjeksiyonudur. Örneğin, ekstrasellüler matriks protein fibronektin veya JAK / STAT sinyal küçük molekül inhibitörleri enjeksiyonu başarıyla yaşlı fareler de yapılmıştır15,16. İskelet kasının yenilenmesi sırasında belirli bir hücre tipinde belirli bir gen fonksiyonunun analizi, örneğin uydu hücrelerinde, indükleyici bir genetik fare modeli nin kullanılması yla mümkündür. Kendi kendine teslim siRNA enjeksiyonları, rekombinant proteinler veya küçük molekül inhibitörleri iskelet kası rejenerasyon birden fazla hücre tipleri etkileyebilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |