Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التصوير النانوسكوبي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع البدني والنظائري

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/60195
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

Summary

التصوير بالنانو لعينات الأنسجة السريرية يمكن أن يحسن فهم مسببات الأمراض. علم أمراض التوسع (ExPath) هو نسخة من الفحص المجهري التوسع (ExM)، المعدلة للتوافق مع عينات الأنسجة السريرية القياسية، لاستكشاف التكوين نانوي النطاق من الجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر الانعراج التقليدية محدودة.

Abstract

في علم الأمراض الحديثة، المجهرية البصرية يلعب دورا هاما في تشخيص المرض من خلال الكشف عن الهياكل المجهرية للعينات السريرية. ومع ذلك، فإن الحد الأساسي للانعراج البدني يمنع استجواب التشريح النانومتري والتغيرات المرضية الدقيقة عند استخدام نهج التصوير البصري التقليدية. هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط وغير مكلفة، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)، للتصوير البصري نانوالنطاق من الأنواع الشائعة من عينات الأنسجة الأولية السريرية، بما في ذلك كل من البارافين الثابتة المجمدة أو الرسمية الثابتة جزءا لا يتجزأ من (FFPE) المقاطع. هذه الطريقة تتحايل على حد الانعراج البصري عن طريق تحويل عينات الأنسجة كيميائيا إلى هجين الأنسجة هيدروجيل وتوسيعها جسديا متساوي استوائي عبر جداول متعددة في المياه النقية. بسبب التوسع، يتم فصل جزيئات غير قابلة للحل سابقا، وبالتالي يمكن ملاحظتها باستخدام المجهر البصري التقليدي.

Introduction

التحقيق في التنظيم الجزيئي للأنسجة في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) يمكن أن توفر فهما جديدا للوظائف البيولوجية وتطوير الأمراض. ومع ذلك، فإن هذه البيئات النانومترية تتجاوز قدرات الدقة للمجاهر الانعراج التقليدية المحدودة (200-300 نانومتر)، حيث يتم تعريف الحد الأدنى من المسافة القابلة للحل، d بواسطة d αי/NA. هنا هو الطول الموجي للضوء وNA هو الفتحة العددية (NA) من نظام التصوير. في الآونة الأخيرة، أصبح التصور المباشر للجزيئات ذات العلامات الفلورية ممكناً من خلال تقنيات التصوير فائقة الدقة المطورة حديثاً1و2و3،بما في ذلك استنفاد الانبعاثات المحفز (STED)، التصوير المنشط التعريب المجهري (PALM)، الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM)، والفحص المجهري للإضاءة المنظمة (SIM). على الرغم من أن تقنيات التصوير هذه قد أحدثت ثورة في فهم الوظيفة البيولوجية على النطاق النانوي، إلا أنها تعتمد في كثير من الأحيان على معدات باهظة الثمن و/أو متخصصة وخطوات معالجة الصور، يمكن أن يكون لها وقت اقتناء أبطأ مقارنة بـ التصوير البصري التقليدي، تتطلب الفلوروفورس مع خصائص محددة (مثل القدرة على تبديل الصور و / أو ارتفاع استقرار الصورة). وبالإضافة إلى ذلك، لا يزال من الصعب إجراء التصوير ثلاثي الأبعاد فائق الدقة على عينات الأنسجة.

توسيع المجهرية (ExM)، التي أدخلت لأول مرة في عام 20154،ويوفر وسيلة بديلة للتصوير الميزات نانوية (<70 نانومتر) عن طريق توسيع جسديا العينات المحفوظة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل متعدد الكهرباء قابل للتضخم. هنا، يتم تثبيت الجزيئات الحيوية الرئيسية و/أو التسميات في الموقع إلى شبكة بوليمر يمكن توسيعها بالتساوي الموضعي بعد المعالجة الكيميائية. ولأن التوسع المادي يزيد من الدقة الفعالة الكاملة، يمكن عندئذ حل جزيئات الاهتمام باستخدام أنظمة التصوير التقليدية المحدودة الانعراج. منذ نشر البروتوكول الأصلي، حيث تم تثبيت التسميات الفلورية توليفها مخصصة لشبكة البوليمر4،وقد استخدمت استراتيجيات جديدة لإرساء البروتينات مباشرة (الاحتفاظ بالبروتين ExM، أو proExM)5، 6،7،8،9 وRNA9،10،11،12 إلى هيدروجيل، وزيادة التكبير البدني من خلال التكراري التوسع13 أو تكييف هلام الكيمياء8،14،15.

هنا نقدم نسخة مكيفة من proExM، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)16، والتي تم تحسينها لصيغ علم الأمراض السريرية. يحول البروتوكول العينات السريرية، بما في ذلك البارافين الممزوج بالقطع ى الشكل (FFPE)، والهيماتوكسيلين وإيوسين (H&E) الملون، وعينات الأنسجة البشرية المجمدة الطازجة المثبتة على الشرائح الزجاجية، إلى حالة متوافقة مع ExM. ثم يتم تثبيت البروتينات إلى هيدروجيل ويتم تنفيذ التجانس الميكانيكية (الشكل 1)16. مع التوسع الخطي 4 أضعاف من العينات، يمكن الحصول على صور فائقة الدقة متعددة الألوان (~ 70 نانومتر) باستخدام المجهر البؤري التقليدي وجود فقط قرار ~ 300 نانومتر، ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من تقنيات التصوير فائقة الدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف والحلول للأسهم

  1. إعداد مكونات الحل الهلامي.
    ملاحظة:     يتم إعطاء تركيزات الحل في g/mL (ث/ v في المائة).
    1. جعل حلول الأسهم التالية: 38٪ (ث / الخامس) أكريليت الصوديوم (SA)، 50٪ (ث / الخامس) أكريلاميد (AA)، 2٪ (ث / ف) N، N′-ميثيلين بياكريلاميد (بيس)، و 29.2٪ (ث / الخامس) كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم). إذابة المركبات في الماء منزوع الأيونات مضاعف (ddH2O). (أ) استخدام الكميات الواردة في الجدول 1 كمرجع؛ يمكن توسيع نطاق الحلول المعدة أو خفض حجمها حسب الحاجة. على سبيل المثال، لجعل 10 مل من حل SA 38٪ (ث / v)، إضافة 1.9 غرام SA إلى اسطوانة 10 مل تخرج وإضافة ddH2O إلى وحدة تخزين 5 مل.
    2. إعداد 9.4 مل من محلول مونومر بتركيز 1.06 x كما هو مبين في الجدول 1.
      ملاحظة: وهذا سيؤدي إلى تركيز 1X بعد إضافة البادئ, مسرع, والمانع. يمكن تخزين مخزون مونومر عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر، أو عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    3. إعداد حلول الأسهم التالية بشكل منفصل في ddH2O: 0.5٪ (ث / v) من المانع 4-هيدروكسي-2،2،6،6-tetramethylpiperidin-1-أوكسيل (4HT)، الذي يمنع الهلام لتمكين انتشار محلول الهلام في الأنسجة، 10٪ (V / V) من البادئ رباعي ميثيل الإيثيلينديامين (TEMED)، الذي يسرع توليد الجذر من قبل كبريتات الأمونيوم (APS)، و 10٪ (ث / الخامس) APS الذي يبدأ عملية الهلام.
      ملاحظة: يمكن إعداد حلول الأسهم من 4HT وTEMED في aliquots 1 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. وقد تبين أن وكالة الأنباء الجزائرية تفقد فعاليتها بعد التخزين الطويل الأجل، وهي أفضل من إعدادها بكميات صغيرة (<0.1 مل) مباشرة قبل الهلام.
  2. إعداد المخزن المؤقت للهضم (50 m Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] nonionic السطحي, 0.8 M NaCl) عن طريق الجمع بين 25 مل من 1 M Tris pH 8 (3.03 غرام من قاعدة تريس في 25 مل من DDH2O)، 25 مل من EDTA (0.5 M PH 8) ، 2.25 غرام من السطحي غير الأيونية، و 23.38 غرام من حمض الكلى. إضافة ddH2O لحجم إجمالي قدره 500 مل.
    ملاحظة: يمكن توسيع نطاق الحل صعودا أو خفضا حسب الحاجة وتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية. سيتم إضافة بروتين K (ProK) مباشرة قبل خطوة الهضم.
  3. إعداد 20 مل محلول سيترات الصوديوم عن طريق الجمع بين 2.941 غرام من ثنائي الهيدرات ثلاثي ة سيترات الصوديوم مع 500 مل من ddH2O وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 في درجة حرارة الغرفة (RT). قياس حجم المخزون حسب الحاجة.
  4. إعداد حل الأسهم من 6-(أكريلويل) حمض الهكانويك، استر succinimidyl (أكريلويل-X، SE. AcX)، مجمع الإرساء. حل AcX في 500 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي الميثيل اللامائية (DMSO) لتركيز نهائي قدره 10 ملغم/مل.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحل في بيئة مجففة عند -20 درجة مئوية في 20 ميكرولتر aliquots.
  5. إذا لم يكن استخدام المخازن المؤقتة المتوفرة تجارياً لتلطيخ المناعة، قم بإعداد المخزن المؤقت حظر. استخدام حاجز حظر من 5٪ (V / V) المصل الحيواني العادي و 0.1٪ (ث / الخامس) السطحي غير الأيونية في 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) وحدد المصل على أساس الحيوان المضيف للأجسام المضادة الثانوية. على سبيل المثال، لإعداد 500 مل حجب العازلة للأجسام المضادة التي أثيرت في الماعز، والجمع بين 25 مل من مصل الماعز، 0.45 غرام من السطحي غير الأيونية، و 1X PBS إلى حجم 500 مل.

2. إعداد الشرائح الأنسجة السريرية المؤرشفة والمعدة حديثا لExPath

  1. تحويل الأنسجة إلى تنسيق متوافق مع ExPath. اختر إحدى الخطوات الأربع التالية (2.1.1−2.1.4) استنادًا إلى كيفية إعداد العينة: شرائح FFPE، أو شرائح FFPE الملطخة، أو شرائح الأنسجة المجمدة غير الثابتة أو الثابتة في محلول درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
    ملاحظة:     تستند هذه على خطوات الاسترداد القياسية لنماذج علم الأمراض ولا خاصة ببروتوكول ExPath.
    1. عينات سريرية من FFPE
      1. إعداد 30 مل من الإيثانول 95٪، 70٪ الإيثانول، و 50٪ الإيثانول. قياس 30 مل من الزيلين، 100٪ الإيثانول، وddH2O.
      2. ضع الشريحة مع العينة في مخروطية 50 مل باستخدام ملقط وإضافة 15 مل من الزيلين. قم بغطاء الأنبوب وضعه أفقياً على شاكر مداري عند حوالي 60 دورة في الدقيقة واحتضن في RT لمدة 3 دقائق لكل حل. كرر مع الزيلين 15 مل المتبقية.
      3. كرر الخطوة 2.1.1.2 مع الإيثانول 100٪، 95٪ الإيثانول، 70٪ الإيثانول، 50٪ الإيثانول، وddH2O بدلا من إكسيلين.
    2. شرائح دائمة ملطخة ومثبتة
      1. ضع الشريحة في طبق بيتري 100 مم وغطيه بالزيلين. قم بإزالة غطاء الغلاف بعناية باستخدام شفرة الحلاقة. إذا لم تتم إزالة غطاء الغلاف بسهولة، أعد الشريحة إلى الزيلين حتى تُخفّف زلة الغلاف.
      2. معالجة استخدام الخطوات لعينات FFPE (الخطوات 2.1.1.1--2.1.1.3).
        ملاحظة: في حالة الشرائح الملطخة H & E، يتم القضاء على البقع أثناء عملية التوسع.
    3. شرائح الأنسجة المجمدة غير الثابتة في حل OCT
      1. إصلاح الأنسجة في الأسيتون في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      2. غسل العينات مع 1X PBS الحل 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.
    4. ثابتة سابقا، والشرائح الأنسجة السريرية المجمدة
      1. احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في RT لإذابة الحل OCT.
      2. غسل العينة مع 1X PBS الحل 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
  2. إجراء المعالجة الحرارية لاسترجاع مستضد على جميع العينات بعد تحويل الشكل.
    1. أضف محلول سيترات بسعة 20 مليون متر (درجة الحموضة 8 في RT) في حاوية مقاومة للحرارة، مثل وعاء تلطيخ الشرائح.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك حل كاف لتغطية الأنسجة التي شنت على الشريحة (50 مل لجرة الشريحة القياسية تلطيخ).
    2. قم بتسخين محلول السيترات إلى 100 درجة مئوية في الميكروويف ووضع الشريحة في الحل. نقل الحاوية على الفور إلى غرفة الحضانة وحضانة في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن وضع الشرائح في أطباق بيتري وتغطيها في 1X PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  3. وصمة عار العينة باستخدام الفلورة المناعية القياسية (IF) / الكيمياء المناعية (IHC) تلطيخ بروتوكولات.
    ملاحظة:     تعتمد تركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية المحددة وفترات تلطيخ على التركيزات التي تقترحها الشركة المصنعة أو عن طريق التحسين لتجربة محددة.
    1. استخدم قلمًا كارهيًا لرسم حد حول قسم (أقسام) الأنسجة على الشريحة لتقليل حجم الحل اللازم لتغطية الأنسجة. ضع الشريحة في طبق كبير بما يكفي لتناسب الشريحة. للحصول على شريحة قياسية مقاس 3 بوصات، استخدم طبق بيتري مقاس 100 مم.
      ملاحظة: القلم الكاره للماء لا تتداخل مع البلمرة من العينة ولا عملية الهضم.
    2. احتضان الأنسجة مع حظر العازلة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 2 ح في RT، أو 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحد من الربط غير محدد.
    3. تخفيف الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز المطلوب في الكمية المناسبة من المخزن المؤقت حظر أعدت (أو غيرها من المخزن المؤقت تلطيخ المفضل). احتضان الأنسجة مع الحل الأساسي للجسم المضاد لمدة لا تقل عن 3 ح في RT أو 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب وضع العينات في حاوية رطبة (مثل طبق بيتري مع مسح رطب) لمنع الأنسجة من الجفاف. عادة، تم تخفيف الأجسام المضادة إلى 1:100-1:500 في 200-500 درجة مئوية من المخزن المؤقت، اعتمادا على حجم الأنسجة والأجسام المضادة المستخدمة.
    4. غسل الأنسجة مع العازلة حجب أعدت (أو غيرها من العازلة الغسيل المفضل) 3 مرات لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (و 300 nM 4′,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] إذا رغبت في ذلك), في العازلة حجب أعدت (أو غيرها من العازلة تلطيخ المفضلة) إلى تركيز ما يقرب من 10 ميكروغرام / مل. حضانة الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة على الأقل في RT أو 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ويمكن تعديل التوقيت اعتمادا على الأجسام المضادة المستخدمة وسمك الأنسجة. الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الأصباغ السيانين (Cy3، Cy5، اليكسا 647) غير متوافقة مع بروتوكول ExM عند تطبيقها قبل البلمرة. وتشمل الأصباغ المقترحة اليكسا 488 (الأخضر)، اليكسا 546 (البرتقالي / الأحمر)، وأتو 647N أو CF633 (أحمر الأقصى). يجب إعادة تطبيق DAPI بعد التوسع، كما يتم غسلها بعيداً أثناء عملية التوسع.
    6. غسل الأنسجة مع العازلة حجب أعدت (أو غيرها من العازلة الغسيل المفضل) 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن وضع الشرائح في أطباق بيتري وتغطيها في 1X PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    7. قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر المجال الواسع التقليدي أو المجهر البؤري أو نظام التصوير الآخر المفضل.
      ملاحظة: وهذه الخطوة مطلوبة لتحديد الطول البيولوجي باستخدام عامل التوسيع عن طريق مقارنة الصور قبل وبعد التوسع. ولتيسير التصوير بعد التوسع، ينبغي اختيار مناطق ذات أهمية يسهل تحديدها وجمع الصور عند التكبير المنخفض والعالي على حد سواء.

3. في الموقع البلمرة من العينات

  1. احتضان العينة في حل ترسيخ.
    1. إعداد محلول الإرساء (عادة 250 درجة مئوية يكفي لتغطية قسم الأنسجة) عن طريق تخفيف محلول مخزون AcX في 1X PBS إلى تركيز 0.03 ملغ /مل للعينات الثابتة مع المثبتات غير ألدهيد أو 0.1 ملغ / مل للعينات الثابتة مع المثبتات الألدهيد ، والتي لديها عدد أقل من الأمينات الحرة المتاحة للرد مع AcX.
    2. ضع الشريحة في طبق بيتري 100 مم وماصة الحل الإرساء على الأنسجة. حضانة لمدة 3 ساعات على الأقل في RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. احتضان العينات في حل الهلام.
    1. إعداد ما لا يقل عن 100 أضعاف حجم الزائدة من حل الهلام. لكل 200 μL، الجمع بين ما يلي، من أجل: 188 ميكرولتر من محلول مونومر، 4 ميكرولتر من 0.5٪ 4HT حل الأسهم (1:50 تخفيف، التركيز النهائي: 0.01٪)، 4 ميكرولتر من 10٪ TEMED حل الأسهم (1:50 تخفيف، التركيز النهائي 0.2٪)، و 4 ميكرولتر من 10٪ APS حل الأسهم (1:50 التخفيف، التركيز النهائي 0.2٪.
      ملاحظة: يجب أن يتم حل الهلام مباشرة قبل الاستخدام. وينبغي الاحتفاظ بالحل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، وينبغي إضافة حل وكالة الأنباء الجزائرية في نهاية المباراة، لمنع الهلام المبكر.
    2. إزالة الحل الزائد من قسم الأنسجة ووضع الشريحة في طبق بيتري 100 ملم. إضافة الطازجة، حل الهلام الباردة للعينة واحتضان الخليط على الأنسجة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية، للسماح بنشر الحل في الأنسجة.
  3. بناء غرفة على الشريحة حول العينة(الشكل 2A) دون إزعاج الحل الهلام.
    1. جعل الفواصل لغرفة الهلام عن طريق قطع رقيقة من الزجاج غطاء باستخدام سكين الماس.
      ملاحظة: لتسهيل توسيع وظيفة التصوير، يجب أن تكون الفواصل قريبة في سمك عينة الأنسجة للحد من كمية هلام فارغة فوق الأنسجة. يمكن استخدام الزجاج رقم 1.5 للعينات السريرية القياسية (5-10 درجة مئوية). يمكن أن تكون مكدسة تغطية القطع الزجاجية لعينات أكثر سمكا.
    2. تأمين الفواصل على جانبي الأنسجة باستخدام قطرات من الماء (~ 10 درجة مئوية).
    3. وضع بعناية غطاء الزجاج غطاء على الشريحة، والتأكد من تجنب محاصرة فقاعات الهواء على الأنسجة(الشكل 2B).
  4. احتضان العينة في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة (مثل طبق بيتري مغلقة مع مسح رطب) لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن تخزين غرفة الشريحة داخل طبق بيتري مختومة في 4 درجة مئوية.

4. عينة الهضم

  1. إزالة غطاء من غرفة الهلام عن طريق انزلاق بلطف شفرة الحلاقة تحت غطاء ورفع ببطء غطاء قبالة سطح هلام. تقليم هلام فارغة حول الأنسجة لتقليل حجم. قطع هلام بشكل غير متماثل لتتبع اتجاه هلام بعد التجانس، منذ العينة سوف تصبح شفافة.
    1. تخفيف بروك من قبل 1:200 في المخزن المؤقت الهضم (التركيز النهائي 4 U / mL) قبل الاستخدام. إعداد ما يكفي من الحل لغمر تماما هلام. بئر واحد من لوحة ثقافة الخلية البلاستيكية أربعة جيدا يتطلب ما لا يقل عن 3 مل لكل بئر.
    2. احتضان العينة في حاوية مغلقة تحتوي على المخزن المؤقت الهضم لمدة 3 ساعة عند 60 درجة مئوية. إذا كانت العينة لا تنفصل عن الشريحة أثناء الهضم، استخدم شفرة حلاقة لإزالة العينة بلطف.
      ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة تماما العينة في العازلة الهضم لمنع العينة من تجفيف ووضعها في حاوية مغطاة (مربع الشريحة الصغيرة، البلاستيك جيدا، طبق بيتري، الخ) التي يمكن أن تكون مختومة مع الفيلم.

5. توسيع العينة والتصوير

  1. استخدام فرشاة الطلاء لينة لنقل العينة إلى 1X PBS في حاوية متوافقة مع نظام التصوير المطلوب وكبيرة بما يكفي لاستيعاب هلام الموسعة بالكامل. تأكد من وضع الأنسجة مع جانب العينة لأسفل إذا كان التصوير على نظام مقلوب أو أعلى إذا كان التصوير على نظام مستقيم لتقليل المسافة من هدف التصوير إلى العينة. الوجه هلام باستخدام فرشاة الطلاء لينة إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن استخدام الإضاءة الجانبية من LED لجعلها مرئية في السائل. لوحة قياسية 6-جيدا يمكن أن تستوعب العينات التي لديها قطر هادىنب مسبقا أقل من 0.6 سم. وينبغي استخدام لوحة بئر أسفل الزجاج للتصوير على نظام مقلوب.
  2. غسل العينات في 1X PBS في RT لمدة 10 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، إعادة وصمة عار العينة مع 300 NM DAPI كما عملية الهضم يصبغ بعيدا وصمة عار DAPI. إزالة PBS ووصمة عار مع 300 NM DAPI المخففة في 1X PBS لمدة 20 دقيقة في RT، تليها غسل 10 دقيقة مع 1X PBS في RT.
    ملاحظة: ويمكن تغطية العينات بـ 1x PBS وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. لتوسيع العينات، استبدل PBS واغسل بحجم زائد من ddH2O (على الأقل 10x حجم الجل النهائي) 3−5 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها، في RT.
    ملاحظة: بعد غسل 3rd أو 4ال، يجب أن يبدأ توسيع العينة إلى الهضبة. للتخزين، لمنع النمو البكتيري، يمكن أن تستكمل ddH2O مع 0.002٪ −0.01٪ أزيد الصوديوم (NaN3). في هذه الحالة، يتم تخفيض عامل التوسع النهائي بشكل عكسي بنسبة 10٪.
  4. قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر تقليدي واسع المجال أو مجهر بؤري أو نظام تصوير آخر من اختيارك.
    ملاحظة: لمنع المواد الهلامية من الانجراف، يمكن إزالة السائل الزائد من البئر. كما يمكن تعطيل المواد الهلامية مع 1.5-2٪ من الأغروز منخفض الذوبان. إعداد 1.5−2% (w/v) الأغروز منخفض الذوبان في الماء في حاوية 2-4 أضعاف حجم الحل. قم بتسخين الحل في حمام مائي بزاوية 40 درجة مئوية أو في ميكروويف لمدة 10-20 ثوانً لإذابة الحل. ماصة أغاروز ذاب حول حواف الجل. بعد السماح للأجاروز تصلب في RT أو 4 درجة مئوية، إضافة الماء إلى العينة لمنع الجفاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إذا تم تنفيذ البروتوكول بنجاح(الشكل 1)،ستظهر العينات كجل مسطح وشفاف بعد التجانس الميكانيكي(الشكل 3A)ويمكن أن تتوسع بمعامل 3-4.5x في الماء(الشكل 3B)، توفير قرار فعال من ~ 70 نانومتر اعتمادا على عامل التوسع النهائي ونظام التصوير المستخدمة5،16. ويبين الشكل 4 صوراً على سبيل المثال لعينة كلية FFPE سميكة تبلغ 5 ميكرومتر تمت معالجتها باستخدام بروتوكول ExPath. أدى التوسع الكامل للعينات الهلامية في عامل توسع 4.5x في الماء، وإعطاء قرار فعال من ~ 63 نانومتر عند تصويرها باستخدام هدف 0.95 NA. وقد تم تجهيز الأنسجة مسبقاً مع الزيلين لإزالة البارافين وإعادة ترطيبه (القسم 2-1-1)، يليه استرجاع مستضد مع المخزن المؤقت للسترات (القسم 2-2). ثم كانت ملطخة الأنسجة المستردة مع الأجسام المضادة لألفا أكتينين 4 (ACTN4) وفيمنتين، جنبا إلى جنب مع DAPI لتصور الحمض النووي والقمح الجلوتين الجرثومية (WGA)، لتسمية الكربوهيدرات. ثم تم تصوير العينة باستخدام مجهر القرص الغزل ية(الشكل 4A، B، D). تم التعامل مع الأنسجة بعد البروتوكول المذكور أعلاه وتوسعت بالكامل في المياه(الشكل 4C, E). وبالمثل، يُظهر الشكل 5 صوراً على سبيل المثال لأنسجة الثدي الطبيعية الملطخة H&E(الشكل 5ألف)التي عولجت بالزيلين (القسم 2-1-2) لإزالة زجاج الغلاف ثم عوملت كعينة من الـ FFPE (القسم 2-1-1). أثناء التجانس، يتم القضاء على وصمة عار H&E من الأنسجة. تشير صور ما بعد التوسع للعينة الملطخة DAPI التي تم الحصول عليها على مجهر البؤر القرص الغزل(الشكل 5B)مقارنة مع الصور قبل التوسع عامل التوسع من 5.1، وإعطاء قرار فعال من ~ 43 نانومتر عند تصويرها مع عدسة NA 1.15.

يمكن رؤية بيانات المثال لشرائح الكلى المجمدة غير الثابتة التي تمت معالجتها باستخدام بروتوكول ExPath في الشكل 6. تم إصلاح الأنسجة لأول مرة في الأسيتون البارد (القسم 2.1.3) وملطخة ACTN4، vimentin، DAPI، وWGA. وتشير المقارنة بين صور ما قبل التوسع (غير المعروضة) وصور ما بعد التوسع إلى عامل توسع قدره 4.5. بيانات المقارنة من عينات الكلى المجمدة الأسيتون ثابتة إلى أن من عينات FFPE(الشكل 4C, E)تبين أن هناك انخفاضا في نوعية التلطيخ ACTN4 في عينة FFPE الموسعة، والتي قد تكون بسبب تدهور مضادات الجينات بسبب طريقة التثبيت16.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لسير عمل علم الأمراض التوسع (ExPath). يتم إجراء المعالجة المسبقة لشرائح الأنسجة المؤرشفة سريرياً أولاً بناءً على شكل التخزين. ثم تلطخت العينات باستخدام بروتوكولات تلطيخ المناعة التقليدية ويتم الحصول على صور ما قبل التوسع. ثم يتم التعامل مع العينات مع أكريلويل-X SE (AcX) لرسو البروتينات إلى هيدروجيل. يتم تشكيل البلمرة في الموقع قبل التجانس الميكانيكي باستخدام proteinase K (ProK). ويمكن بعد ذلك توسيع العينات في ddH2O قبل التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: غرفة الهلام لعينات علم الأمراض. (أ)يتم وضع اثنين من الفواصل، مثل قطعتين من الزجاج غطاء #1.5 مع سكين الماس، على جانبي الأنسجة بعد احتضان العينة في حل الهلام في 4 درجة مئوية. يجب أن تكون الفواصل أكثر سمكا من شرائح الأنسجة، لمنع ضغط العينة. (ب)يتم استخدام غطاء، مثل قطعة من الزجاج غطاء #1.5، لتغطية العينة قبل الحضانة في 37 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على توسيع العينة. وهناك عينة الكلى سميكة 5 ميكرومتر بعد التجانس،(أ)قبل و (ب)ما بعد التوسع في ddH2O. مربعات الشبكة هي 5 مم × 5 مم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية من عينات كلية FFPE سميكة 5 ميكرومتر. (أ)صورة موسعة مسبقاً. (ب)صورة ما قبل التوسع المكبرة للمنطقة المحددة ذات الاهتمام في اللوحة A و(C)صورة ما بعد التوسع المقابلة لنفس المنطقة ذات الاهتمام بعد توسيع العينة بالكامل في الماء. (د)صورة مكبرة للمنطقة المبينة من الاهتمام في لوحة B و(E)صورة ما بعد التوسع المقابلة لنفس المنطقة ذات الاهتمام بعد أن تم توسيع العينة بالكامل في الماء. يمكن أن يكون التكسير والتشوهات وفقدان الأهداف المسماة نتيجة لعدم كفاية الرسو و/أو التجانس(F, G). تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر محور القرص الغزل مع 20X (NA 0.95؛ غمر المياه) الهدف(A-E، G)أو 10X (NA 0.5) الهدف(F). الأزرق، DAPI؛ الأخضر ، فيمنتين ؛ الأحمر، ألفا أكتينين 4 (ACTN4)؛ أرجواني، WGA. قضبان مقياس = 100 درجة مئوية(A، F، G،أشرطة مقياس أصفر تشير إلى صور ما بعد التوسع)؛ 50 ميكرومتر(B)،50 ميكرومتر(C،حجم مادي بعد التوسع 225 م؛ عامل التوسع 4.5)؛ 25 ميكرومتر(D)؛ 25 ميكرومتر(E،الحجم المادي بعد التوسع 112.5 ميكرومتر؛ عامل التوسع 4.5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: النتائج التمثيلية من H & E الأنسجة الثدي الطبيعية الملون. (أ)صورة برايتفيلد للأنسجة الملطخة H&E الموسعة مسبقاً التي تم التقاطها بهدف 40x (0.95 NA). (ب)صورة DAPI بعد التوسع من نفس المنطقة ذات الاهتمام بعد أن تم توسيع العينة بالكامل في الماء. تم الحصول على الصورة على مجهر البؤر قرص الغزل باستخدام 40x (NA 1.15؛ غمر المياه) الهدف. قضبان مقياس = 10 ميكرومتر(A، شريط مقياس أصفر يشير إلى صور ما بعد التوسع) و 2 ميكرومتر(B، حجم المادية بعد التوسع 50.1 م؛ عامل التوسع 5.1). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية لعينات الكلى المجمدة الطازجة بعد التوسع، التي تم الحصول عليها على مجهر بؤري للقرص الدوار مع هدف 40x (NA 1.15؛ غمر المياه). الأزرق = فيمنتين; الأخضر = ألفا أكتينين 4 (ACTN4)؛ الأحمر = الكولاجين الرابع. رمادي = DAPI. شريط المقياس = 10 ميكرومتر (توسع ة الحجم المادي 45 ميكرومتر؛ عامل التوسع 4.5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون تركيز المخزون حجم المخزون (مل) التركيز النهائي المبلغ النهائي لكل 10 مل
أكريلات الصوديوم 0.380 جم / مل 2.25 0.086 جم/مل 0.86 غ
أكريلاميد 0.500 جم / مل 0.50 0.025 جم / مل 0.25 غ
N,N′-ميثيلين بياكريليلاميد 0.020 جم / مل 0.50 0.001 جم / مل 0.10 غ
كلوريد الصوديوم 0.292 جم/مل 4.00 0.117 جم/مل 1.17 غ
برنامج تلفزيوني 10 x 1.00 1x 1x
المياه 1.15
إجمالي حجم التداول 9.40

الجدول 1: مكونات محلول مونومر. وترد جميع التركيزات من حيث غرام/مل (ث/ت) باستثناء PBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نقدم بروتوكول ExPath16، وهو متغير من proExM5 التي يمكن تطبيقها على الأنواع الأكثر شيوعا من عينات خزعة السريرية المستخدمة في علم الأمراض، بما في ذلك FFPE، H & E الملون، والعينات المجمدة حديثا على الشرائح الزجاجية. يتبع تحويل التنسيق واسترجاع المستضد وتلطيخ العينات للعينات بروتوكولات شائعة الاستخدام غير الخاصة بـ ExPath. على عكس بروتوكول proExM الأصلي9، يعتمد ExPath على تركيز أعلى من EDTA في المخزن المؤقت للهضم ، مما يحسن التوسع في الأنسجة المكونة من شكلي ثابت ، كما هو موضح في دراسة ExPath الأصلية16. وقد تم التحقق من صحة البروتوكول في 5-10 ميكرومتر عينات سريرية سميكة16، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على عينات الأنسجة أكثر سمكا مع بعض التعديل. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) توقيت خطوات الهلام؛ 2) إعداد غرفة الهلام؛ 3) المعلمات لتجانس العينة؛ و 4) التعامل مع هلام.

المعلمة الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هو توقيت خطوات الهلام. إذا كان الحل الهلام البلمرة قبل الأوان، فإن العينة لن تكون راسية بما فيه الكفاية إلى مصفوفة هلام. غير كافية الرسو وهلام سابق لأوانه يمكن أن يسبب تشوهات، والحد من التوسع، ويؤدي إلى فقدان الجزيئات المستهدفة(الشكل 4F، G). بدء الهلام يعتمد على درجة الحرارة، وبالتالي فمن المهم للحفاظ على حل الهلام مختلطة في 4 درجة مئوية قبل وضعه على العينة المستهدفة. وينبغي أن تكون البادئة، APS، أعدت حديثا وتضاف على الفور قبل تطبيق الحل الهلام. APS ليست مستقرة في RT ويمكن أن تفقد فعاليتها بعد خضوعه لدورات تجميد ذوبان الجليد. يمكن أن يكون الإرساء غير الكافي أيضا نتيجة لانخفاض التفاعل من مجمع الرسو، AcX، والتي يمكن أن تفقد النشاط بعد التخزين على المدى الطويل أو بعد ملامسة الماء. تم العثور على AcX للاحتفاظ بالنشاط بعد 6 أشهر من التخزين في بيئة المجففة في -20 درجة مئوية. إذا لم يكن الجلقبل هو السبب المشتبه به للتشويه، يمكن إعداد حل مخزون جديد من AcX.

أثناء إعداد غرفة الهلام، يمكن أن تصبح فقاعات الهواء محاصرين تحت غطاء الزجاج الغطاء. إذا كانت هذه الفقاعات على رأس أو لمس العينة مباشرة، فإنها يمكن أن تسبب تشوهات. ويمكن نقلها بعيدا عن العينة عن طريق إضافة المزيد من حل الهلام من خلال جانب الغرفة. للمساعدة في منع فقاعات الهواء، يمكن إيداع قطرة صغيرة من محلول الهلام على الغطاء قبل وضعه فوق الأنسجة.

يعتمد هضم العينة على الوقت ودرجة الحرارة، فضلا عن خصائص الأنسجة، مثل سمك ونوع الأنسجة. كما أن عدم كفاية الهضم يمكن أن يسبب تشوهات ويؤدي إلى عامل توسع أصغر من المتوقع. إذا كان يشتبه في الهضم غير مكتملة، يمكن زيادة وقت الهضم و / أو تركيز بروك، لا سيما في حالة الأنسجة أكثر سمكا. ProK يمكن أن تفقد أيضا النشاط مع مرور الوقت. للحفاظ على نشاطها، يجب تخزين ProK في -20 درجة مئوية ويمكن أن aliquoted في أحجام أصغر لتجنب دورات ذوبان الحرة.

وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع العينات المتجانسة، لا سيما عندما يتم توسيعها بشكل كامل. إذا كان من الصعب تحديد العينة عند غمرها في السائل، وإضاءة الحاوية من زوايا مختلفة يمكن أن مبعثر ضوء الحادث للسماح التصور من هلام. المواد الهلامية الموسعة بالكامل هشة ويمكن كسرها أثناء المناولة. ينصح باستخدام فرش لينة وملاعق بلاستيكية لنقل المواد الهلامية الموسعة.

يوفر بروتوكول ExPath بديلاً فعالاً من حيث التكلفة للتقنيات الحالية للتصوير فائق الدقة والفحص المجهري الإلكتروني لاستجواب الهياكل النانوية في عينات الخزعة السريرية. على الرغم من أن ProK يوفر حتى توسيع العينة بعد التجانس، وفقدان البروتينات يمنع استجواب أهداف أخرى من الفائدة بعد التوسع. ومع ذلك، يمكن تنفيذ البروتوكول بسهولة في أي مختبر الرطب العادية. والأهم من ذلك، يمكن تصوير الخصائص النانوية على المجاهر التقليدية واسعة المجال أو البؤر البؤرية التي توجد عادة في مختبرات البيولوجيا ومرافق التصوير الأساسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

YZ وOB هما من المخترعين الذين قدموا وحصلوا على حماية براءات الاختراع على مجموعة فرعية من التكنولوجيات الموصوفة هنا (براءات الاختراع الأمريكية US20190064037A1، WO2018157074A1، وWO2018157048A1).

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء الكلية من جامعة كارنيجي ميلون (YZ) وجائزة مدير المعهد الوطني للصحة للمبتكرين الجدد (DP2 OD025926-01 إلى YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acetone Fischer Scientifc A18-500
Acrylamide Sigma Aldrich A8887
Acryloyl-X, SE (AcX) Invitrogen A20770
Agarose Fischer Scientifc BP160-100
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678 Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit Sigma Aldrich HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse Santa Cruz Biotech sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken Abcam ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen Scientific Device 980402
Breast Common Disease Tissue Array Abcam ab178113
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M		 VWR BDH7830-1
FFPE Kidney Sample USBiomax HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A Biotium 20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 Biotium 20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010
MAXbind Staining Medium Active Motif 15253 Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium Active Motif 15252 Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium Active Motif 15254 Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		 Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma Aldrich M7279
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121 For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063 Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc 15 mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc 50 mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientifc BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm) Fischer Scientifc FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate Sigma Aldrich 408220
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Tris Base Fischer Scientifc BP152-1
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R Biotium 29026
Xylenes Sigma Aldrich 214736

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Tags

التراجع، العدد 151، الفحص المجهري للتوسع، الفحص المجهري الفلوري، التصوير بالنانو، التصوير فائق الدقة، علم الأمراض، علم الأمراض التوسع، الكيمياء المناعية
التصوير النانوسكوبي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع البدني والنظائري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klimas, A., Bucur, O., Njeri, B.,… More

Klimas, A., Bucur, O., Njeri, B., Zhao, Y. Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion. J. Vis. Exp. (151), e60195, doi:10.3791/60195 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter