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Medicine

शारीरिक और आइसोट्रोपिक विस्तार के माध्यम से मानव ऊतक धाराओं के Nanoscopic इमेजिंग

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/60195
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

Summary

नैदानिक ऊतक नमूनों की नैनोस्केल इमेजिंग रोग रोगजनन की समझ में सुधार कर सकती है। विस्तार विकृति (ExPath) विस्तार माइक्रोस्कोपी का एक संस्करण है (ExM), मानक नैदानिक ऊतक के नमूने के साथ संगतता के लिए संशोधित, जैव अणुओं के नैनोस्केल विन्यास का पता लगाने के लिए पारंपरिक विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर.

Abstract

आधुनिक विकृति विज्ञान में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी नैदानिक नमूनों की सूक्ष्म संरचनाओं का खुलासा करके रोग निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, मौलिक भौतिक विवर्तन सीमा पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते समय नैनोस्केल शरीर रचना विज्ञान और सूक्ष्म रोग परिवर्तन ों की पूछताछ को रोकता है। यहाँ, हम एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन, विस्तार विकृति (ExPath) कहा जाता है, नैदानिक प्राथमिक ऊतक नमूनों के आम प्रकार के नैनोस्केल ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए, दोनों फिक्स्ड-फ्रोज़न या formalin-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक सहित अनुभागों. इस विधि रासायनिक ऊतक-हाइड्रोगेल संकर में ऊतक के नमूने को बदलने और शारीरिक रूप से उन्हें शुद्ध पानी में कई तराजू भर में isotropically विस्तार द्वारा ऑप्टिकल विवर्तन सीमा को दरकिनार. विस्तार के कारण, पहले से अनसुलझे अणुओं को अलग कर रहे हैं और इस प्रकार एक पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया जा सकता है.

Introduction

एक तीन आयामी (3 डी) संदर्भ में ऊतकों के आणविक संगठन की जांच जैविक कार्यों और रोग के विकास की नई समझ प्रदान कर सकते हैं. तथापि, ये नैनोस्केल वातावरण पारंपरिक विवर्तन सीमित सूक्ष्मदर्शी (200$300 दउ) की संकल्प क्षमताओं से परे हैं, जहाँ न्यूनतम समाधान योग्य दूरी, घ को घ द्वारा परिभाषित किया जाता है । यहाँ र् प्रकाश की तरंगदैर्घ्य है तथा एएएन इमेजिंग प्रणाली का संख्यात्मक अपर्चर (एए) है। हाल ही में, फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं के प्रत्यक्ष दृश्य नव विकसित सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक1,2,3, प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) सहित द्वारा संभव बनाया गया है, फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (PALM), स्टोकास्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (STORM), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)। हालांकि इन इमेजिंग तकनीक नैनोस्केल पर जैविक समारोह की समझ में क्रांति ला दी है, व्यवहार में, वे अक्सर महंगा और / पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग, विशिष्ट विशेषताओं के साथ फ्लोरोफोर्स की आवश्यकता होती है (जैसे फोटो-स्विचिंग क्षमता और / इसके अलावा, यह ऊतक नमूनों पर 3 डी सुपर संकल्प इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक चुनौती बनी हुई है।

विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM), पहली बार 20154में शुरू की, एक फूला हुआ polyelectrolyte hydrogel में एम्बेडेड संरक्षित नमूनों का शारीरिक विस्तार करके इमेजिंग नैनोस्केल सुविधाओं (और lt;70 एनएम) का एक वैकल्पिक साधन प्रदान करता है। यहाँ, कुंजी जैव अणुओं और / या लेबल एक बहुलक नेटवर्क है कि isotopically रासायनिक प्रसंस्करण के बाद विस्तार किया जा सकता है के लिए situ में लंगर डाले हैं. क्योंकि भौतिक विस्तार कुल प्रभावी संकल्प बढ़ जाती है, ब्याज के अणुओं तो पारंपरिक विवर्तन सीमित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर हल किया जा सकता है. मूल प्रोटोकॉल के प्रकाशन के बाद से, जहां कस्टम संश्लेषित फ्लोरोसेंट लेबल बहुलक नेटवर्क4के लिए लंगर थे, नई रणनीतियों सीधे प्रोटीन लंगर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (प्रोटीन प्रतिधारण ExM, या proExM)5, 6,7,8,9 ,9 , आरएनए9,10,11,12 hydrogel के लिए , और पुनरावृत्त के माध्यम से शारीरिक आवर्धन में वृद्धि विस्तार13 या अनुकूलन जेल रसायन8,14,15.

यहाँ हम proExM के एक अनुकूलित संस्करण प्रस्तुत, विस्तार विकृति (ExPath)16कहा जाता है, जो नैदानिक विकृति प्रारूपों के लिए अनुकूलित किया गया है. प्रोटोकॉल नैदानिक नमूनों को परिवर्तित करता है, जिसमें फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई), हेमाटॉक्सिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग, और कांच की स्लाइडों पर लगाए गए ताजा जमे हुए मानव ऊतक नमूने, ExM के साथ संगत राज्य में शामिल हैं। इसके बाद प्रोटीनों को हाइड्रोजेल में लगाया जाता है और यांत्रिक समरूपीकरण किया जाता है (चित्र 1)16. नमूनों की एक 4 गुना रैखिक विस्तार के साथ, बहुरंगा सुपर संकल्प ($ 70 एनएम) छवियों केवल एक $ 300 एनएम संकल्प होने एक पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है और यह भी अन्य सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है.

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Protocol

1. स्टॉक अभिकर्मकों और समाधान की तैयारी

  1. जेलिंग समाधान घटक तैयार करें।
    नोट:     हल सांद्रता g/mL (w/v प्रतिशत) में दी गई है।
    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान करें: 38% (w/v) सोडियम ऐक्रिलेट (एसए), 50% (w/v) ऐक्रिलमाइड (एए), 2% (w/v) N,N]-methylenebisacrylamide (Bis), और 29.2% (w/v) सोडियम क्लोराइड (NaCl)। द्वि-विनिर्दित जल (डीडीएच2हे) में यौगिकों को भंग करें। संदर्भ के रूप में तालिका 1 में मात्रा का उपयोग करें; तैयार समाधान ों को आवश्यकतानुसार मात्रा में ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 38% (w/v) SA समाधान के 10 एमएल बनाने के लिए, 1.9 ग्राम SA को स्नातक 10 एमएल सिलिंडर में जोड़ें और 5 एमएल के किसी आयतन में डीडीएच2व् जोड़ें।
    2. सारणी 1में दर्शाए गए 1ण्06x सांद्रता पर 9ण्4 उल मोनोमर विलयन की तैयारी की है।
      नोट: यह शुरू करने वाला, त्वरक, और अवरोध करनेवाला के अलावा के बाद एक 1x एकाग्रता में परिणाम होगा. मोनोमर स्टॉक को 3 महीने तक या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. निम्नलिखित स्टॉक समाधान को अलग से ddH2O में तैयार करें: 0.5% (w/v) अवरोधक के 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-ऑक्सील (4HT), जो gelation को रोकता है ऊतकों में जेलिंग समाधान के प्रसार को सक्षम करने के लिए, 10% (v/v) प्रारंभक टेट्रामेथिलीथिलीनडिऐडिमिन (टीईएमईडी), जो अमोनियम पर्सुलफेट (एपीएस) द्वारा कट्टरपंथी पीढ़ी को गति प्रदान करता है, और 10% (w/v) एपीएस जो जेलिंग प्रक्रिया शुरू करता है।
      नोट: 4HT और TEMED के शेयर समाधान 1 एमएल एलिकोट्स में तैयार किया जा सकता है और कम से कम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ए पी एस लंबी अवधि के भंडारण के बाद प्रभावकारिता खोने के लिए पाया गया है और सबसे अच्छा जेलिंग से पहले तुरंत छोटी मात्रा में तैयार किया जाता है (lt;0.1 एमएल)।
  2. पाचन बफर तैयार करें (50 एमएम ट्रास पीएच 8.0, 25 एमएम EDTA, 0.5% [w/v] nonionic सर्फैक्टेंट, 0.8 एम NaCl) 1 एम Tris पीएच 8 (3.03 ग्राम डीडीएच2ओ के 25 एमएल में Tris आधार के 25 एमएल) के संयोजन से (0.5 एम.एच.) , 2.25 ग्राम nonionic सर्फेक्टेंट, और 23.38 ग्राम NaCl के. 500 एमएल की कुल मात्रा के लिए ddH2O जोड़ें।
    नोट: समाधान को आवश्यकतानुसार ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है। पाचन चरण से ठीक पहले प्रोटीनज के (प्रोक) को जोड़ दिया जाएगा।
  3. 20 एमएम सोडियम साइट्रेट समाधान को 500 एमएल डीडीएच2हे के साथ मिलाकर 20 एमएम सोडियम साइट्रेट घोल तैयार करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर पीएच को 8ण्0 तक समायोजित करें। जरूरत के रूप में शेयर की मात्रा स्केल.
  4. 6-((acryloyl)amino) hexanoic एसिड, succinimidyl एस्टर (acryloyl-X, SE) का एक शेयर समाधान तैयार करें; AcX), एंकरिंग यौगिक. 10 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए एनहाइड्रोस डाइमेथिल सल्फोक्सेक्साइड (डीएमएसओ) के 500 डिग्री एल में एसीएक्स को भंग करें।
    नोट: विलयन को 20 डिग्री सेल्सियस में एक शुष्क वातावरण में संग्रहित किया जा सकता है।
  5. यदि इम्यूनोस्टेनिंग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बफर्स का उपयोग नहीं करते हैं, तो ब्लॉकिंग बफर तैयार करें। 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 5% (v/v) सामान्य पशु सीरम और 0.1% (w/v) nonionic सर्फेक्टेंट के अवरुद्ध बफर का उपयोग करें और द्वितीयक एंटीबॉडी के मेजबान जानवर के आधार पर सीरम का चयन करें। उदाहरण के लिए, बकरी में उठाए गए एंटीबॉडी के लिए 500 एमएल अवरुद्ध बफर तैयार करने के लिए, बकरी सीरम के 25 एमएल, nonionic सर्फैक्टेंट के 0.45 ग्राम, और 500 एमएल की मात्रा के लिए 1x PBS गठबंधन.

2. ExPath के लिए संग्रहीत और ताजा तैयार नैदानिक ऊतक स्लाइड की तैयारी

  1. ऊतक को ExPath संगत स्वरूप में कनवर्ट करें. चार निम्नलिखित चरणों में से एक चुनें (2.1.1.1.4) कैसे नमूना तैयार किया गया था के आधार पर: FFPE स्लाइड, दाग FFPE स्लाइड, या इष्टतम काटने तापमान (OCT) समाधान में unfixed या तय जमे हुए ऊतक स्लाइड.
    नोट:     ये पैथोलॉजी नमूनों के लिए मानक पुनर्प्राप्ति चरणों पर आधारित हैं और ExPath प्रोटोकॉल के लिए विशिष्ट नहीं हैं।
    1. FFPE नैदानिक नमूने
      1. 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और 50% इथेनॉल के 30 एमएल तैयार करें। 30 एमएल xylene, 100% इथेनॉल, और ddH2हे बाहर उपाय.
      2. स्लाइड को संदंश का उपयोग करके 50 एमएल शंकु में नमूने के साथ रखें और 15 एमएल xylene जोड़ें। ट्यूब को कैप करें और इसे लगभग 60 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर क्षैतिज रूप से रखें और प्रत्येक समाधान के लिए 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। शेष 15 एमएल जाइल्स के साथ दोहराएँ।
      3. 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, और xylene के स्थान पर डीडीएच2हे के साथ कदम 2.1.1.2 दोहराएँ।
    2. सना हुआ और माउंटेड स्थायी स्लाइड्स
      1. स्लाइड को 100 मिमी पेट्री डिश में रखें और xylene के साथ कवर करें। रेजर ब्लेड का उपयोग करके कवरस्लिप को सावधानी से निकालें। यदि कवरस्लिप को आसानी से नहीं हटाया जाता है, तो स्लाइड को xylene पर तब तक वापस करें जब तक कि कवरस्लिप ढीला न हो जाए।
      2. FFPE नमूनों के लिए चरणों का उपयोग कर प्रक्रिया (चरण 2.1.1.1$2.1.3)।
        नोट: एच एंड ई दाग स्लाइड के मामले में, दाग विस्तार की प्रक्रिया के दौरान समाप्त कर रहे हैं।
    3. OCT समाधान में अफिक्स्ड जमे हुए ऊतक स्लाइड
      1. 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन में ऊतक को ठीक करें।
      2. 1x पीबीएस समाधान के साथ नमूने धो एंपल को 10 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी में 3 बार धोएं।
    4. पहले तय, जमे हुए नैदानिक ऊतक स्लाइड
      1. OCT समाधान पिघला करने के लिए आरटी पर 2 मिनट के लिए स्लाइड इनक्यूबेट करें।
      2. 1x पीबीएस समाधान के साथ नमूना धो लें 3 बार के लिए 5 मिनट प्रत्येक आरटी पर.
  2. प्रारूप रूपांतरण के बाद सभी नमूनों पर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए गर्मी उपचार प्रदर्शन.
    1. गर्मी प्रतिरोधी कंटेनर में 20 एमएम साइट्रेट समाधान (पीएच 8 आरटी पर) जोड़ें, जैसे स्लाइड धुंधला जार।
      नोट: स्लाइड पर लगे ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान होना चाहिए (50 एमएल एक मानक स्लाइड धुंधला जार के लिए)।
    2. साइट्रेट घोल को माइक्रोवेव में 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और स्लाइड को घोल में रखें। कंटेनर को तत्काल एक ऊष्मायन कक्ष में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। स्लाइड पेट्री व्यंजन में रखा जा सकता है और 1x पीबीएस में कवर किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ)/प्रतिरक्षा रसायन (आईएचसी) धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करके नमूने को दाग दें।
    नोट:     विशिष्ट प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता और धुंधला durations निर्माता द्वारा या विशिष्ट प्रयोग के लिए अनुकूलन द्वारा सुझाए गए सांद्रता पर निर्भर हैं.
    1. ऊतक को कवर करने के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा को कम करने के लिए स्लाइड पर ऊतक अनुभाग (ओं) के चारों ओर एक सीमा बनाने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें। स्लाइड को फ़िट करने के लिए स्लाइड को पर्याप्त बड़े डिश में रखें. एक मानक 3-इंच स्लाइड के लिए, एक 100 मिमी पेट्री डिश का उपयोग करें।
      नोट: हाइड्रोफोबिक पेन नमूने के बहुलकीकरण और न ही पाचन प्रक्रिया में हस्तक्षेप नहीं करता है।
    2. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को कम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच, आरटी पर 2 एच, या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए बफर को अवरुद्ध करने के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    3. तैयार अवरुद्ध बफर (या अन्य पसंदीदा धुंधला बफर) की उचित मात्रा में वांछित एकाग्रता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 एच के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें, या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: नमूने एक humidified कंटेनर में रखा जाना चाहिए (जैसे एक नम पोंछे के साथ एक पेट्री डिश के रूप में) बाहर सुखाने से ऊतक को रोकने के लिए. आमतौर पर, एंटीबॉडी को 200$500L बफर में 1:100 डिग्री 1:500 तक पतला किया गया है, जो ऊतक के आकार और उपयोग किए गए एंटीबॉडी के आधार पर होता है।
    4. तैयार अवरुद्ध बफर (या अन्य पसंदीदा धोने बफर) के साथ ऊतक धो लें 3 बार 10 मिनट के लिए आर टी पर.
    5. डिल्यूट माध्यमिक एंटीबॉडी (और 300 एनएम 4 ],6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] यदि वांछित), तैयार अवरुद्ध बफर में (या अन्य पसंदीदा धुंधला बफर) लगभग 10g/ आरटी या 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में ऊतक को इनक्यूबेट करें।
      नोट: समय इस्तेमाल एंटीबॉडी और ऊतक की मोटाई के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. साइनाइन रंगों वाले माध्यमिक एंटीबॉडी (Cy3, Cy5, Alexa 647) ExM प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं हैं जब पूर्व बहुलकन लागू किया गया है। सुझाए गए रंगों में एलेक्सा 488 (हरा), एलेक्सा 546 (नारंगी/लाल), और Atto 647N या CF633 (दूर-लाल) शामिल हैं। DAPI विस्तार के बाद पुन: लागू किया जाना चाहिए, क्योंकि यह विस्तार प्रक्रिया के दौरान बह जाता है।
    6. तैयार अवरुद्ध बफर (या अन्य पसंदीदा धोने बफर) के साथ ऊतक धो लें 3 बार 10 मिनट प्रत्येक के लिए आर टी पर.
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। स्लाइड पेट्री व्यंजन में रखा जा सकता है और 1x पीबीएस में कवर किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप, confocal माइक्रोस्कोप, या पसंद के अन्य इमेजिंग प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: इस चरण के पूर्व और बाद विस्तार छवियों की तुलना करके विस्तार कारक का उपयोग जैविक लंबाई निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. पोस्ट विस्तार इमेजिंग की सुविधा के लिए, ब्याज की आसानी से पहचाने जाने योग्य क्षेत्रों का चयन किया जाना चाहिए और दोनों कम और उच्च आवर्धन पर छवियों को एकत्र किया जाना चाहिए.

3. Specimens के Situ बहुलकीकरण में

  1. लंगर समाधान में नमूना इनक्यूबेट करें।
    1. एंकरिंग समाधान तैयार करें (आमतौर पर 250 डिग्री सेल्सियस ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है) 1x पीबीएस में AcX स्टॉक समाधान को कम करके गैर-एल्डिहाइड फिक्सेटिव्स या 0.1 mg/mL के साथ तय नमूनों के लिए नमूने के लिए 0.03 mg/mL की एकाग्रता के लिए एल्डिहाइड fixatives के साथ तय किया गया है , जो कम मुक्त amines AcX के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए उपलब्ध है.
    2. स्लाइड को 100 मिमी पेट्री डिश में रखें और ऊतक पर एंकरिंग समाधान को पाइपेट करें। आरटी में कम से कम 3 एच के लिए इनक्यूबेट या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. जेलिंग समाधान में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    1. जेलिंग समाधान की कम से कम 100 गुना अतिरिक्त मात्रा तैयार करें। प्रति 200 $L, निम्नलिखित गठबंधन, क्रम में: 188 monomer समाधान के $L, 4 $L 0.5% 4HT स्टॉक समाधान (1:50 कमजोर पड़ने, अंतिम एकाग्रता: 0.01%), 10% के 4 $L TEMED स्टॉक समाधान (1:50 कमजोर पड़ने, अंतिम एकाग्रता 0.2%), और 10% एपीएस स्टॉक समाधान के 4 डिग्री एल (1:50) तनुता, अंतिम एकाग्रता 0.2%).
      नोट: उपयोग करने से तुरंत पहले जेलिंग समाधान किया जाना चाहिए। समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए और एपीएस समाधान पिछले जोड़ा जाना चाहिए, समय से पहले जेलिंग को रोकने के लिए।
    2. ऊतक अनुभाग से अतिरिक्त समाधान निकालें और स्लाइड को 100 मिमी पेट्री डिश में रखें। नमूने के लिए ताजा, ठंडा जेलिंग समाधान जोड़ें और ऊतक में समाधान के प्रसार की अनुमति देने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊतक पर मिश्रण इनक्यूबेट करें।
  3. नमूना के चारों ओर स्लाइड पर एक कक्ष का निर्माण करें (चित्र 2क) जेलिंग समाधान को परेशान किए बिना।
    1. एक हीरे के चाकू का उपयोग कर कवर कांच के टुकड़े पतले काटने से जेलिंग कक्ष के लिए स्पेसर्स बनाओ।
      नोट: इमेजिंग पोस्ट विस्तार की सुविधा के लिए, spacers ऊतक नमूना करने के लिए मोटाई में बंद होना चाहिए ऊतक के ऊपर खाली जेल की मात्रा को कम करने के लिए. संख्या 1.5 कांच मानक नैदानिक नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (5 डिग्री 10 डिग्री मी). कवर ग्लास टुकड़े मोटा नमूने के लिए खड़ी किया जा सकता है.
    2. पानी की बूंदों का उपयोग कर ऊतक के दोनों ओर स्पेसर्स को सुरक्षित करें ($10 डिग्री सेल्सियस)।
    3. ध्यान से स्लाइड पर एक कवर ग्लास ढक्कन जगह है, ऊतक पर हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए सुनिश्चित कर रही है (चित्र 2बी).
  4. एक आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें (जैसे कि नम पोंछे के साथ एक बंद पेट्री डिश) 2 ज के लिए।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। स्लाइड चैम्बर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सील पेट्री पकवान के अंदर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. नमूना पाचन

  1. धीरे कवरस्लिप के नीचे एक उस्तरा ब्लेड फिसलने और धीरे से जेल की सतह से कवरस्लिप उठाने से जेलिंग चैम्बर के ढक्कन को हटा दें। मात्रा को कम करने के लिए ऊतक के चारों ओर खाली जेल ट्रिम. एकरूपीकरण के बाद जेल के उन्मुखीकरण को ट्रैक करने के लिए जेल को विषम रूप से काटें, क्योंकि नमूना पारदर्शी हो जाएगा।
    1. उपयोग करने से पहले पाचन बफर (अंतिम एकाग्रता 4 U/ जेल को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त समाधान तैयार करें; एक चार अच्छी तरह से प्लास्टिक सेल संस्कृति प्लेट के एक भी अच्छी तरह से प्रति कम से कम 3 एमएल की आवश्यकता है.
    2. एक बंद कंटेनर में नमूने को इनक्यूबेट करें जिसमें पाचन बफर के लिए 3 एच पर 60 डिग्री सेल्सियस होता है। यदि नमूना पाचन के दौरान स्लाइड से अलग नहीं होता है, तो नमूना को धीरे से हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
      नोट: नमूना पूरी तरह से पाचन बफर में डूब जाना चाहिए बाहर सुखाने से नमूना को रोकने के लिए और एक कवर कंटेनर में रखा (छोटे स्लाइड बॉक्स, प्लास्टिक अच्छी तरह से, पेट्री डिश, आदि) कि फिल्म के साथ बंद किया जा सकता है.

5. नमूना विस्तार और इमेजिंग

  1. एक नरम रंग ब्रश का उपयोग करने के लिए एक कंटेनर में 1x PBS में नमूना हस्तांतरण वांछित इमेजिंग प्रणाली के साथ संगत और पूरी तरह से विस्तारित जेल को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बड़े. सुनिश्चित करें कि ऊतक नमूना साइड के साथ नीचे रखा गया है अगर एक उल्टे प्रणाली पर इमेजिंग या ऊपर अगर एक ईमानदार प्रणाली पर इमेजिंग इमेजिंग के नमूने के लिए इमेजिंग उद्देश्य से दूरी को कम करने के लिए. यदि आवश्यक हो तो एक नरम पेंट ब्रश का उपयोग कर जेल फ्लिप।
    नोट: एक एलईडी से साइड-लिलेशन उन्हें तरल में दिखाई देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक मानक 6-वेल प्लेट उन नमूनों को समायोजित कर सकती है जिनका पूर्व-विस्तृत व्यास 0.6 सेमी से कम है। एक गिलास नीचे अच्छी तरह से थाली एक उल्टे प्रणाली पर इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. 10 मिनट के लिए आरटी में 1x पीबीएस में नमूने धो लें। यदि वांछित, पाचन प्रक्रिया DAPI दाग दूर washes के रूप में 300 एनएम DAPI के साथ नमूना फिर से दाग. पीबीएस निकालें और 300 एनएम DAPI के साथ दाग आरटी पर 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में पतला, आरटी में 1x पीबीएस के साथ एक 10 मिनट धोने के बाद.
    नोट: नमूने 1x पीबीएस के साथ कवर किया जा सकता है और अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया।
  3. नमूनों का विस्तार करने के लिए, PBS की जगह और ddH2O की एक अतिरिक्त मात्रा के साथ धोने (कम से कम 10x अंतिम जेल मात्रा) 3 "5 बार के लिए 10 मिनट प्रत्येक, RT पर.
    नोट: 3rd या 4धोने के बाद, नमूना विस्तार पठार के लिए शुरू करना चाहिए. भंडारण के लिए, जीवाणु विकास को रोकने के लिए, ddH2O 0.002% के साथ पूरक किया जा सकता है 0.01% सोडियम azide (NAN3). इस मामले में, अंतिम विस्तार कारक reversibly 10% से कम है.
  4. एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप, confocal माइक्रोस्कोप, या पसंद के अन्य इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: बहती से जैल को रोकने के लिए, अतिरिक्त तरल अच्छी तरह से हटाया जा सकता है. जेल भी 1.5 डिग्री 2% कम पिघल agarose के साथ स्थिर किया जा सकता है. एक कंटेनर में पानी में 1.5 डिग्री 2%(w/v) कम पिघल agarose तैयार 2 $4 बार समाधान की मात्रा. घोल को 40 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में या माइक्रोवेव में 10 डिग्री 20 s के लिए घोल को पिघला दें। जेल के किनारों के आसपास पिघले हुए अग्रोस को पिपेट करें। आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर कठोर करने के लिए agarose की अनुमति देने के बाद, निर्जलीकरण को रोकने के लिए नमूने में पानी जोड़ें।

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Representative Results

यदि प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा किया गया है (चित्र 1), तो नमूने यांत्रिक समरूपन के बाद एक सपाट और पारदर्शी जेल के रूप में दिखाई देंगे (चित्र 3क) और जल में 3 डिग्री 4.5x के एक कारक द्वारा विस्तार कर सकते हैं (चित्र 3ठ) अंतिम विस्तार कारक और इमेजिंग प्रणाली के आधार पर 70 एनएम का एक प्रभावी संकल्प प्रदान करना5,16. चित्र 4 ExPath प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित 5 डिग्री सेल्सियस मोटी FFPE गुर्दे के नमूने के उदाहरण छवियों को दर्शाता है। gelled नमूनों का पूर्ण विस्तार पानी में एक 4.5x विस्तार कारक के परिणामस्वरूप, $ 63 एनएम का एक प्रभावी संकल्प दे जब एक 0.95 एनए उद्देश्य का उपयोग कर छवि. ऊतक पहले xylene के साथ पूर्व संसाधित किया गया था पैराफिन और rehydrated हटाने के लिए (खंड 2.1.1), प्रतिजन द्वारा पुन: प्राप्ति के साथ प्रतिजन-पुनर्प्राप्ति के साथ (खंड 2.2). बरामद ऊतक तो अल्फा-actinin 4 (ACTN4) और vimentin के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग था, DAPI के साथ परमाणु डीएनए और गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA) कल्पना करने के लिए, कार्बोहाइड्रेट लेबल. इसके बाद इस नमूने को कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्र 4ए, बी, डी) का उपयोग करके छविबद्ध किया गया था। उपर्युक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ऊतकों का उपचार किया गया और जल में पूर्ण रूप से विस्तार किया गया(चित्र 4ंग, ई)। इसी प्रकार चित्र 5 में एच एंड ई केउदाहरण चित्र ों को दिखाया गया है जो कि xylene (अनुभाग 2.1.2)के साथ उपचारित किया गया था ताकि आवरण कांच को हटाया जा सके और फिर एफएफपीई नमूने (खंड 2-1-1) के रूप में व्यवहार किया गया। एकरूपता के दौरान, एच एंड ई दाग ऊतक से समाप्त हो जाता है। DAPI के बाद विस्तार छवियों एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप पर प्राप्त नमूना दाग (चित्र 5बी) पूर्व विस्तार छवियों के साथ तुलना में 5.1 का एक विस्तार कारक से संकेत मिलता है, $ 43 एनएम का एक प्रभावी संकल्प दे जब के साथ imaged एक एनए 1.15 लेंस.

ExPath प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित अनिर्णित जमे हुए गुर्दे के स्लाइस के लिए उदाहरण डेटा चित्र 6 में देखा जा सकता है। ऊतक पहले ठंड एसीटोन में तय किया गया था (अनुभाग 2.1.3) और ACTN4, vimentin, DAPI, और WGA के साथ दाग. पूर्व विस्तार की तुलना (नहीं दिखाया गया) और बाद विस्तार छवियों 4.5 के एक विस्तार कारक से संकेत मिलता है. एफएफपीई नमूनों के एसीटोन-फिक्स्ड जमे हुए गुर्दे के नमूनों से तुलना डेटा (चित्र 4ब्, ई) से पता चलता है कि विस्तारित एफएफपीई नमूने में ACTN4 धुंधला की गुणवत्ता में कमी है, जो एंटीजेनिकिटी की गिरावट के कारण हो सकता है निर्धारण विधि16के कारण .

Figure 1
चित्र 1: विस्तार विकृति (ExPath) कार्यप्रवाह का Schematic. नैदानिक रूप से संग्रहीत ऊतक स्लाइड ों की पूर्व प्रसंस्करण पहले भंडारण प्रारूप के आधार पर किया जाता है। नमूने तो पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर दाग रहे हैं और पूर्व विस्तार छवियों प्राप्त कर रहे हैं. नमूने तो hydrogel के लिए प्रोटीन लंगर acryloyl-X एसई (AcX) के साथ इलाज कर रहे हैं. स्थिति में बहुलकन प्रोटीनाज के (प्रोक) का उपयोग करके यांत्रिक एकरूपीकरण से पहले पूर्वनिर्मित होता है। नमूने तो इमेजिंग से पहले डीडीएच2ओ में विस्तार किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पैथोलॉजी नमूनों के लिए जेलेशन चैम्बर। (ए) दो स्पेसर, जैसे कि हीरे के चाकू से #1.5 कवर कांच के दो टुकड़े, ऊतक के दोनों ओर 4 डिग्री सेल्सियस पर गिलिंग घोल में नमूना को इनक्यूबेट करने के बाद रखे जाते हैं। स्पेसर्स ऊतक स्लाइस की तुलना में मोटा होना चाहिए, नमूना के संपीड़न को रोकने के लिए. (बी)एक ढक्कन, जैसे #1.5 कवर ग्लास का एक टुकड़ा, 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन से पहले नमूने को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: नमूना विस्तार का उदाहरण. 5 मीटर मोटी गुर्दे का नमूना समरूपता के बाद, (ए) पूर्व और (बी) डी डी एच2हे में पोस्ट-एक्सपेंशन दिखाया गया है। ग्रिड वर्गों 5 मिमी x 5 मिमी हैं, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि परिणाम से 5 डिग्री मोटी FFPE गुर्दे के नमूने. (ए) पूर्व विस्तृत छवि. (ख) पैनल ए और(सी)में रुचि के रेखांकित क्षेत्र की विस्तारित पूर्व विस्तार छवि , नमूने के जल में पूरी तरह से विस्तार होने के बाद उसी क्षेत्र की इसी ोत्तर विस्तार छवि का विस्तार किया गया है। (घ) पैनल ख और(ई) में रुचि के रेखांकित क्षेत्र की बढ़ी हुई छवि , नमूने के जल में पूरी तरह से विस्तार होने के बाद उसी क्षेत्र की इसी ोत्तर विस्तार छवि का विस्तार किया गया है। क्रैकिंग, विकृतियों, और लेबल लक्ष्यों की हानि अपर्याप्त एंकरिंग और/या homogenization(F,G)का परिणाम हो सकता है। सभी छवियों को एक 20x (एनए 0.95; पानी विसर्जन) उद्देश्य(ए-ई, जी) या 10x (ए नए 0.5) उद्देश्य (एफ) के साथ एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया गया. नीला, डीएपीआई; हरे, vimentin; लाल, अल्फा-एक्टिनिन 4 (ACTN4); मैजंटा, डब्ल्यूजीए. स्केल बार ] 100 डिग्री(ए, एफ, जी,पीले पैमाने पर सलाखों के बाद विस्तार छवियों से संकेत मिलता है); 50 डिग्री (बी), 50 डिग्री (सी, भौतिक आकार पोस्ट विस्तार 225 डिग्री; विस्तार कारक 4.5); 25 डिग्री मी (डी) 25 डिग्री मी(ई, भौतिक आकार के बाद विस्तार 112.5 डिग्री उ; विस्तार कारक 4.5)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एच एंड ई से प्रतिनिधि परिणाम सामान्य स्तन ऊतक दाग. (क)पूर्व-विस्तारित एच एंड ई के ब्राइटफील्ड छवि को 40x (0.95 एनए) उद्देश्य के साथ लिया गया था। (ख) जल में नमूने का पूरी तरह से विस्तार होने के बाद उसी क्षेत्र कीपी.आई.पी. छवि एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप पर एक 40x (NA 1.15; पानी विसर्जन) उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. स्केल बार ] 10 डिग्रीमी(ए, पीले पैमाने पर पट्टी पोस्ट-विस्तार छवियों को इंगित करता है) और 2 डिग्री(बी, भौतिक आकार पोस्ट विस्तार 50.1 $m; विस्तार कारक 5.1)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: विस्तार के बाद ताजा जमे हुए गुर्दे के नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम, एक 40x (एनए 1.15; पानी विसर्जन) उद्देश्य के साथ एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप पर प्राप्त की. ब्लू जेड vimentin; हरी ] अल्फा-actinin 4 (ACTN4); लाल जेड कोलेजन चतुर्थ; ग्रे जेड डीएपीआई। स्केल बार - 10 डिग्री मी (भौतिक आकार के बाद विस्तार 45 डिग्री मीटर; विस्तार कारक 4.5)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक स्टॉक एकाग्रता स्टॉक वॉल्यूम (एमएल) अंतिम एकाग्रता 10 एमएल प्रति अंतिम राशि
सोडियम एक्रिलेट 0.380 ग्राम/ 2.25 0.086 ग्राम/ 0.86 ग्राम
ऐक्रिलमाइड 0.500 ग्राम/ 0.50 0.025 ग्राम/ 0.25 ग्राम
एन,एन]-मेथिलीनबिसक्रेलमाइड 0.020 ग्राम/ 0.50 0.001 ग्राम/ 0.10 ग्राम
सोडियम क्लोराइड 0.292 ग्राम/ 4.00 0.117 ग्राम/ 1.17 ग्राम
Pbs 10x 1.00 1x 1x
पानी 1.15
कुल वॉल्यूम 9.40

तालिका 1: मोनोमर समाधान के घटक। सभी सांद्रता पीबीएस को छोड़कर जी/एमएल (डब्ल्यू/v) के रूप में दी जाती है।

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Discussion

यहाँ, हम ExPath प्रोटोकॉल16,proExM5 का एक संस्करण है कि FFPE, एच एंड ई दाग, और कांच स्लाइड पर ताजा जमे हुए नमूनों सहित पैथोलॉजी में इस्तेमाल नैदानिक बायोप्सी नमूनों का सबसे आम प्रकार के लिए लागू किया जा सकता प्रस्तुत करते हैं। प्रारूप रूपांतरण, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, और नमूनों के इम्यूनोस्टेनिंग सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का पालन करते हैं जो ExPath के लिए विशिष्ट नहीं हैं। मूल proExM प्रोटोकॉल9के विपरीत, ExPath पाचन बफर में EDTA के एक उच्च एकाग्रता पर निर्भर करता है, जो formalin-फिक्स्ड ऊतकों के विस्तार में सुधार, के रूप में मूल ExPath अध्ययन16में प्रदर्शन किया. प्रोटोकॉल में मान्य किया गया है 5 "10 मीटर मोटी नैदानिक नमूनों16, लेकिन यह भी कुछ संशोधन के साथ मोटा ऊतक के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) जेलेशन चरणों का समय; 2) जेलेशन चैम्बर की स्थापना; 3) नमूना homogenization के लिए पैरामीटर; और 4) जेल की हैंडलिंग.

इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर जेलेशन चरणों का समय है. यदि जेलिंग समाधान समय से पहले polymerizes, नमूना पर्याप्त जेल मैट्रिक्स के लिए लंगर नहीं किया जाएगा. अपर्याप्त लंगर और समयपूर्व जेलेशन विकृतियों का कारण बन सकता है, विस्तार को सीमित कर सकता है, और इसके परिणामस्वरूप लक्ष्य अणुओं की हानि हो सकती है (चित्र 4च, जी)। जेलेशन की दीक्षा तापमान पर निर्भर है, इसलिए इसे लक्ष्य नमूने पर रखने से पहले मिश्रित जेलिंग समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना महत्वपूर्ण है। शुरुआत, एपीएस, ताजा तैयार किया जाना चाहिए और जेलिंग समाधान लागू करने से पहले तुरंत जोड़ा जाना चाहिए। ए पी एस आरटी में स्थिर नहीं है और फ्रीज-थॉव चक्र के दौर से गुजरने के बाद प्रभावकारिता खो सकते हैं। अपर्याप्त एंकरिंग भी लंगर यौगिक की कम प्रतिक्रिया का परिणाम हो सकता है, AcX, जो लंबी अवधि के भंडारण के बाद या पानी के साथ संपर्क के बाद गतिविधि खो सकते हैं. AcX -20 डिग्री सेल्सियस पर एक शुष्क वातावरण में भंडारण के 6 महीने के बाद गतिविधि बनाए रखने के लिए पाया गया है। यदि समय से पहले जेलेशन विरूपण का संदिग्ध कारण नहीं है, AcX का एक नया स्टॉक समाधान तैयार किया जा सकता है.

जेलेशन चैम्बर की स्थापना के दौरान, हवा के बुलबुले कवर ग्लास ढक्कन के नीचे फंस सकते हैं। इन बुलबुले के शीर्ष पर हैं या सीधे नमूना छू रहे हैं, वे विकृतियों पैदा कर सकता है। वे कक्ष के पक्ष के माध्यम से अधिक जेलिंग समाधान जोड़कर नमूना से दूर ले जाया जा सकता है. हवा के बुलबुले को रोकने में मदद करने के लिए, gelling समाधान की एक छोटी सी बूंद यह ऊतक पर रखने से पहले ढक्कन पर जमा किया जा सकता है।

नमूना पाचन समय, तापमान, साथ ही ऊतक गुण, जैसे मोटाई और ऊतक के प्रकार पर निर्भर है। अपर्याप्त पाचन भी विकृतियों का कारण बन सकता है और एक विस्तार कारक है कि उम्मीद से छोटा है में परिणाम. यदि अधूरा पाचन संदिग्ध है, पाचन समय और / ProK भी समय के साथ गतिविधि खो सकते हैं. अपनी गतिविधि को बनाए रखने के लिए, ProK -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और मुक्त-थॉव चक्र से बचने के लिए छोटे संस्करणों में alicated किया जा सकता है।

homogenized नमूनों से निपटने जब देखभाल की जानी चाहिए, खासकर जब पूरी तरह से विस्तार. यदि नमूने का पता लगाना मुश्किल है जब तरल में डूब, विभिन्न कोणों से कंटेनर रोशन घटना प्रकाश तितर बितर करने के लिए जेल के दृश्य की अनुमति कर सकते हैं. पूरी तरह से विस्तारित जैल नाजुक हैं और हैंडलिंग के दौरान तोड़ सकते हैं। विस्तारित जैल को स्थानांतरित करने के लिए नरम ब्रश और प्लास्टिक स्पैटुला का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

ExPath प्रोटोकॉल नैदानिक बायोप्सी नमूनों में नैनोस्केल संरचनाओं पूछताछ करने के लिए वर्तमान सुपर संकल्प इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। हालांकि ProK homogenization के बाद नमूने का भी विस्तार प्रदान करता है, प्रोटीन की हानि ब्याज के बाद विस्तार के अन्य लक्ष्यों की पूछताछ से बचाता है. हालांकि, प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी नियमित रूप से गीला प्रयोगशाला में किया जा सकता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, नैनोस्केल सुविधाओं की इमेजिंग पारंपरिक व्यापक क्षेत्र या confocal माइक्रोस्कोप है कि आमतौर पर जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं और इमेजिंग कोर सुविधाओं में पाए जाते हैं पर किया जा सकता है.

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Disclosures

वाईजेड और ओबी आविष्कारक जो के लिए दायर की है और यहाँ वर्णित प्रौद्योगिकियों के एक सबसेट पर पेटेंट संरक्षण प्राप्त कर रहे हैं (अमेरिका पेटेंट US20190064037A1, WO2018157074A1, और WO2018157048A1).

Acknowledgments

यह काम कार्नेगी मेलॉन विश्वविद्यालय (वाईजेड) और NIH निदेशक की नई नवाचारी पुरस्कार (DP2 OD025926-01 से वाईजेड) से संकाय स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acetone Fischer Scientifc A18-500
Acrylamide Sigma Aldrich A8887
Acryloyl-X, SE (AcX) Invitrogen A20770
Agarose Fischer Scientifc BP160-100
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich A3678 Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit Sigma Aldrich HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse Santa Cruz Biotech sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken Abcam ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen Scientific Device 980402
Breast Common Disease Tissue Array Abcam ab178113
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248 Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M		 VWR BDH7830-1
FFPE Kidney Sample USBiomax HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A Biotium 20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 Biotium 20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 Invitrogen A11010
MAXbind Staining Medium Active Motif 15253 Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium Active Motif 15252 Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium Active Motif 15254 Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		 Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide Sigma Aldrich M7279
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121 For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063 Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc 15 mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc 50 mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientifc BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm) Fischer Scientifc FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate Sigma Aldrich 408220
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Tris Base Fischer Scientifc BP152-1
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R Biotium 29026
Xylenes Sigma Aldrich 214736

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References

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Klimas, A., Bucur, O., Njeri, B., Zhao, Y. Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion. J. Vis. Exp. (151), e60195, doi:10.3791/60195 (2019).

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