Summary
Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.
Abstract
Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.
Introduction
Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleştirme mümkün yeni geliştirilen süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri1,2,3, uyarılmış emisyon tükenmesi de dahil olmak üzere (STED), foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM). Bu görüntüleme teknikleri nano ölçekte biyolojik fonksiyon anlayışında devrim yarattı, ancak pratikte, genellikle pahalı ve/veya özel ekipman ve görüntü işleme adımlarına güvenirler, geleneksel optik görüntüleme, belirli özelliklere sahip floroforlar gerektirir (fotoğraf anahtarlama yeteneği ve/veya yüksek fotostabilite gibi). Buna ek olarak, doku örnekleri üzerinde 3D süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.
İlk olarak 20154yılında tanıtılan genleşme mikroskobu (ExM), şişme polielektrolit hidrojeline gömülü korunmuş numuneleri fiziksel olarak genişleterek nano ölçekli özellikleri (<70 nm) görüntülemede alternatif bir araç sağlar. Burada, anahtar biyomoleküller ve/veya etiketler, kimyasal işleme den sonra izotonik olarak genişletilebilen bir polimer ağa yerinde sabitlenir. Fiziksel genişleme toplam etkin çözünürlüğü arttırdığından, ilgi molekülleri geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir. Özel sentezlenmiş floresan etiketlerin polimer ağına bağlı olduğu orijinal protokolün yayınlanmasından bu yana4, proteinleri (protein tutma ExM veya proExM) doğrudan bağlamak için yeni stratejiler kullanılmıştır5, 6,7,8,9 ve RNA9,10,11,12 hidrojel için, ve yineleme ile fiziksel büyütme artırmak genişleme13 veya adapte jelkimyası 8,14,15.
Burada proExM'in genleşme patolojisi (ExPath)16olarak adlandırılan ve klinik patoloji biçimleri için optimize edilmiş uyarlanmış bir versiyonunu salıyoruz. Protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE), hemaoksilin ve eozin (H&E) lekeli ve cam slaytlara monte edilmiş taze dondurulmuş insan doku örnekleri dahil olmak üzere klinik örnekleri ExM ile uyumlu bir duruma dönüştürür. Proteinler daha sonra hidrojele sabitlenir ve mekanik homojenizasyon yapılır (Şekil 1)16. Numunelerin 4 kat lineer genişlemesi ile çok renkli süper çözünürlükte (~70 nm) görüntüler, sadece ~300 nm çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir ve diğer süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile de kombine edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stok Reaktifleri ve Çözümlerinin Hazırlanması
-
Jelling çözeltisi bileşenlerini hazırlayın.
NOT: Çözelti konsantrasyonları g/mL (w/v yüzde) olarak verilmiştir.- Aşağıdaki stok çözeltileri yapın: %38 (w/v) sodyum akrilat (SA), %50 (w/v) akrilamid (AA), %2 (w/v) N,N′-methylenebisacrylamide (Bis) ve %29.2 (w/v) sodyum klorür (NaCl). Bileşikleri iki kat deiyonize suda çözün (ddH2O). Tablo 1'deki tutarları referans olarak kullanın; hazırlanan çözümler gerektiğinde hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Örneğin, %38 (w/v) SA çözeltisinin 10 mL'sini yapmak için, mezun olmuş 10 mL silindire 1,9 g SA ekleyin ve 5 mL'lik bir hacme DDH2O ekleyin.
- Tablo 1'degösterildiği gibi 1,06x konsantrasyonda 9,4 mL monomer çözeltisi hazırlayın.
NOT: Bu başlatıcı, hızlandırıcı ve inhibitör eklenmesinden sonra 1x konsantrasyonu neden olacaktır. Monomer stoku 4 °C'de 3 aya kadar veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir. - Aşağıdaki stok çözümlerini ddH2O'da ayrı ayrı hazırlayın: Inhibitörün %0,5'ini (w/v) 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametipiperidin-1-oxyl (4HT), jelleşmeyi engelleyen jelleşmeyi engelleyerek jelleşmeyi engelleyerek dokulara % 10 (v/v) amonyum persülfat (APS) ile radikal oluşumu hızlandıran başlatıcı tetrametilenedediamin (TEMED) ve jelleşme sürecini başlatan %10 (w/v) APS.
NOT: 4HT ve TEMED stok çözümleri 1 mL aliquots olarak hazırlanabilir ve en az 6 ay -20 °C'de saklanabilir. APS'nin uzun süreli depolamadan sonra etkinliğini kaybettiği ve jelling'den hemen önce küçük miktarlarda (<0.1 mL) olarak en iyi şekilde hazırlandığı tespit edilmiştir.
- 1 M Tris pH 8 (25 mL DDH2O) 25 mL 1 M Tris pH 8 (3.03 g Tris baz 3.03 g) birleştirerek sindirim tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] nonionic süraktif, 0.8 M NaCl) hazırlayın , 2.25 g niyonik yüzey aktif madde ve NaCl 23.38 g. Toplam 500 mL hacim için ddH2O ekleyin.
NOT: Çözelti gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir ve 4 °C'de saklanabilir. Proteinaz K (ProK) sindirim adımıhemen önce eklenecektir. - 20 mM sodyum sitrat çözeltisini 2,941 g sodyum sitrat tribasic dihidrat ile 500 mL ddH2O birleştirerek ve oda sıcaklığında (RT) pH'ı 8,0'a ayarlayarak hazırlayın. Gerektiğinde stok hacmini ölçeklendirin.
- 6-((akriloyl)amino)heksanoik asit, succinimidyl ester (akriloyl-X, SE; AcX), demirleme bileşeni. AcX'i 500 μL'lik susuz dimetil sülfoksitte (DMSO) 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda çözün.
NOT: Çözelti -20 °C'de 20°L aliquots'ta kurutulmuş bir ortamda saklanabilir. - İmmünoboyama için ticari olarak kullanılabilen tamponlar kullanmıyorsanız, engelleme tamponu hazırlayın. %5 (v/v) normal hayvan serumu ve %0,1 (w/v) niyonik yüzey aktif maddeden 1x fosfat tamponlu salin (PBS) bir engelleme tamponu kullanın ve ikincil antikorların ana hayvanına göre serumu seçin. Örneğin, keçide yetiştirilen antikorlar için 500 mL bloke tamponu hazırlamak için 25 mL keçi serumu, 0,45 g niyonik yüzey aktif madde ve 1x PBS ile 500 mL'lik bir hacim birleştirin.
2. ExPath için Arşivlenmiş ve Taze Hazırlanmış Klinik Doku Slaytlarının Hazırlanması
- Dokuyu ExPath uyumlu bir biçime dönüştürün. Numunenin nasıl hazırlandığına bağlı olarak aşağıdaki dört adımdan birini (2.1.1−2.1.4) seçin: FFPE slaytlar, lekeli FFPE slaytlar veya optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisinde sabitlenmemiş veya sabit dondurulmuş doku slaytları.
NOT: Bunlar patoloji örnekleri için standart kurtarma adımlarını temel alınmaktadır ve ExPath protokolüne özgü değildir.- FFPE klinik örnekleri
- %95 etanol, %70 etanol ve %50 etanol olmak üzere 30 mL hazırlayın. 30 mL ksilen, %100 etanol ve ddH2O ölçün.
- Slaydı 50 mL konik konik bir konik olarak yerleştirin ve 15 mL ksilen ekleyin. Tüpü kaplayın ve yaklaşık 60 rpm'de bir orbital shaker üzerine yatay olarak yerleştirin ve her çözelti için 3 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Kalan 15 mL xylene ile tekrarlayın.
- %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol, %50 etanol ve xilen yerine ddH2O ile tekrar adım 2.1.1.2.
- Lekeli ve monte edilmiş kalıcı slaytlar
- 100 mm Petri kabına kaydırıve ksilen ile kaplayın. Bir jilet kullanarak kapak kayslipini dikkatlice çıkarın. Kapak kolayca kaldırılmazsa, kapak kayması gevşeyene kadar kaydırağı ksilene geri döndürün.
- FFPE örnekleri için adımları kullanarak işlem (adım 2.1.1.1−2.1.1.3).
NOT: H&E lekeli slaytlarda genleşme işlemi sırasında lekeler ortadan kalkar.
- OCT çözeltisinde düzeltilmemiş dondurulmuş doku slaytları
- 10 dakika boyunca -20 °C'de asetondaki dokuyu düzeltin.
- Numuneleri 1x PBS çözeltisi ile her biri 10 dakika boyunca 3 kez RT'de yıkayın.
- Daha önce sabit, dondurulmuş klinik doku slaytlar
- OCT çözeltisini eritmek için slaytları RT'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Numuneyi RT'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1x PBS çözeltisi ile yıkayın.
- FFPE klinik örnekleri
- Biçim dönüştürmeden sonra tüm numunelerde antijen alımı için ısıl işlem yapın.
- Isıya dayanıklı bir kapta 20 mM sitrat çözeltisi (RT'de pH 8) ekleyin, örneğin slayt boyama kavanozu gibi.
NOT: Slayta monte edilen dokuyu kapsayacak kadar çözüm olmalıdır (standart bir slayt boyama kavanozu için 50 mL). - Sitrat çözeltisini mikrodalgafırında 100 °C'ye ısıtın ve kaydırağı çözeltiye yerleştirin. Kabı hemen bir kuluçka odasına aktarın ve 60 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
- Isıya dayanıklı bir kapta 20 mM sitrat çözeltisi (RT'de pH 8) ekleyin, örneğin slayt boyama kavanozu gibi.
- Standart immünofloresan (IF)/immünohistokimya (IHC) boyama protokollerini kullanarak numuneyi lekeleyin.
NOT: Spesifik primer ve sekonder antikor konsantrasyonları ve boyama süreleri üretici tarafından önerilen konsantrasyonlara veya belirli deney için optimizasyona bağlıdır.- Bir hidrofobik kalem doku kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini en aza indirmek için slayt üzerinde doku bölümü (ler) etrafında bir sınır çizmek için kullanın. Slaytı, kaydırağa sığacak kadar büyük bir tabağa yerleştirin. Standart 3 inç lik bir slayt için 100 mm Petri kabı kullanın.
NOT: Hidrofobik kalem, numunenin polimerizasyonuna veya sindirim sürecine engel olmaz. - Nonspesifik bağlanmayı azaltmak için 37 °C'de 1 saat, RT'de 2 saat veya 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile dokuyu kuluçkaya yatırın.
- Hazırlanan blokaj tamponu (veya diğer tercih edilen boyama tamponu) uygun miktarda istenilen konsantrasyona birincil antikorları seyreltin. En az 3 saat RT veya 37 °C'de veya gece boyunca 4 °C'de birincil antikor solüsyonu olan dokuları kuluçkaya yatırın.
NOT: Örnekler, dokunun kurumasını önlemek için nemlendirilmiş bir kapta (nemli silme ile Petri kabı gibi) yerleştirilmelidir. Tipik olarak, antikorlar kullanılan doku büyüklüğüne ve antikora bağlı olarak 200−500 μL tamponda 1:100−1:500'e seyreltilmiştir. - RT'de 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanmış bloke tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
- Seyreltik sekonder antikorlar (ve 300 nM 4′,6-diamidino-2-fenilindole [DAPI] istenirse), hazırlanan engelleme tampon (veya diğer tercih edilen boyama tampon) yaklaşık 10 g/mL konsantrasyon. Sekonder antikor çözeltisindeki dokuyu RT veya 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Zamanlama, kullanılan antikorlar ve doku kalınlığına bağlı olarak ayarlanabilir. Siyanür boyaları içeren sekonder antikorlar (Cy3, Cy5, Alexa 647) ön polimerizasyon uygulandığında ExM protokolü ile uyumlu değildir. Önerilen boyalar Alexa 488 (yeşil), Alexa 546 (turuncu/ kırmızı) ve Atto 647N veya CF633 (uzak kırmızı) içerir. DAPI genişleme işlemi sırasında yıkandığından, genişlemeden sonra yeniden uygulanmalıdır. - Rt'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanan engelleme tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. - Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
NOT: Bu adım, genişleme öncesi ve sonrası görüntüleri karşılaştırarak genişleme faktörlerini kullanarak biyolojik uzunluğu belirlemek için gereklidir. Genişleme sonrası görüntülemeyi kolaylaştırmak için, kolayca tanımlanabilir ilgi alanları seçilmeli ve hem düşük hem de yüksek büyütmede görüntüler toplanmalıdır.
- Bir hidrofobik kalem doku kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini en aza indirmek için slayt üzerinde doku bölümü (ler) etrafında bir sınır çizmek için kullanın. Slaytı, kaydırağa sığacak kadar büyük bir tabağa yerleştirin. Standart 3 inç lik bir slayt için 100 mm Petri kabı kullanın.
3. Numunelerin Yerinde Polimerizasyonunda
-
Numuneyi demirleme çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
- Aldehit olmayan fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 1x PBS'deki AcX stok çözeltisini 0,03 mg/mL konsantrasyona veya aldehit fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 0,1 mg/mL'ye seyrelterek demirleme çözeltisini (genellikle 250 μL doku bölümünü kapsayacak kadar yeterlidir) hazırlayın , AcX ile reaksiyona daha az ücretsiz aminler var.
- 100 mm Petri kabına kaydırığı yerleştirin ve pipet bağlantı çözeltisini dokunun üzerine yerleştirin. RT'de en az 3 saat veya 4 °C'de bir gece kuluçka.
-
Jelling çözeltisi içinde örnekleri kuluçkaya yatırın.
- Jelleç çözeltisinin en az 100 kat fazla hacmini hazırlayın. 200 μL başına, sırayla aşağıdakileri birleştirin: 188 μL monomer çözeltisi, 4 μL %0,5 4HT stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon: %0,01), 4 μL %10 TEMED stok çözeltisi (%1:50, nihai konsantrasyon 0.2%)ve 4 μL %10 APS stok çözeltisi (1:50 seyreltme, son konsantrasyon %0.2.
NOT: Jelling çözeltisi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır. Çözelti 4 °C'de tutulmalı ve erken jellemesini önlemek için APS çözeltisi en son eklenmelidir. - Doku bölümünden fazla çözeltiyi çıkarın ve kaydırağı 100 mm'lik petri kabına yerleştirin. Numuneye taze, soğuk jelleçözelti sürün ve karışımı dokuya 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırArak çözeltinin dokuya difüzyonuna izin verin.
- Jelleç çözeltisinin en az 100 kat fazla hacmini hazırlayın. 200 μL başına, sırayla aşağıdakileri birleştirin: 188 μL monomer çözeltisi, 4 μL %0,5 4HT stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon: %0,01), 4 μL %10 TEMED stok çözeltisi (%1:50, nihai konsantrasyon 0.2%)ve 4 μL %10 APS stok çözeltisi (1:50 seyreltme, son konsantrasyon %0.2.
-
Jelleme çözeltisini bozmadan, numunenin etrafındaki slaytta bir oda(Şekil 2A) oluşturun.
- Bir elmas bıçak kullanarak kapak cam parçaları ince keserek jelleştirici odası için spacers olun.
NOT: Görüntüleme sonrası genişlemeyi kolaylaştırmak için, spacers doku üzerinde boş jel miktarını azaltmak için doku örneğine kalınlığı yakın olmalıdır. Standart klinik numuneler için 1,5 cam (5−10 μm) kullanılabilir. Kapak cam parçaları kalın numuneler için istiflenebilir. - Su damlacıkları (~10 μL) kullanarak dokunun her iki tarafındaki boşlukları sabitleyin.
- Dikkatlice slayt üzerine bir kapak cam kapak yerleştirin, doku üzerinde hava kabarcıkları bindirme önlemek için emin olun(Şekil 2B).
- Bir elmas bıçak kullanarak kapak cam parçaları ince keserek jelleştirici odası için spacers olun.
- Numuneyi 37 °C'de nemli bir ortamda (nemli mendil ile kapalı petri kabı gibi) 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slayt haznesi 4 °C'de kapalı bir Petri kabının içinde saklanabilir.
4. Örnek Sindirim
-
Bir jiletkapağının altına yavaşça kaydırarak ve kapak kaymasını jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jelhazonun kapağını çıkarın. Hacmi en aza indirmek için doku etrafında boş jel kırpın. Örnek saydam olacağından, jelhomojenizasyondan sonra jelin yönünü izlemek için jeli asimetrik olarak kesin.
- Kullanmadan önce ProK'u sindirim tamponunda (son konsantrasyon 4 U/mL) 1:200 ile seyreltin. Jeli tamamen batırmak için yeterli çözelti hazırlayın; dört kuyulu plastik hücre kültür plakasının tek bir kuyusu, kuyu başına en az 3 mL gerektirir.
- Numuneyi 60 °C'de 3 saat boyunca sindirim tamponu içeren kapalı bir kapta kuluçkaya yatırın. Numune sindirim sırasında slayttan ayırmazsa, numuneyi nazikçe çıkarmak için jilet kullanın.
NOT: Numune, numunenin kurumasını önlemek için sindirim tamponuna tamamen batırılmalı ve filmle kapatılmış kapalı bir kapta (küçük bir kaydırak kutusu, plastik kuyu, Petri kabı vb.) yerleştirilmelidir.
5. Örnek Genişletme ve Görüntüleme
- Numuneyi istenilen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişletilmiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1x PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Doku, ters bir sistemde görüntüleme veya görüntüleme, görüntüleme nin görüntülenmesi durumunda örnek lebirlikte aşağı ya da görüntüleme nin dik bir sistemde görüntülenmesi durumunda, görüntüleme amacından numuneye olan uzaklığı en aza indirgemede olduğundan emin olun. Gerekirse yumuşak bir boya fırçası kullanarak jeli çevirin.
NOT: Bir LED'den yan aydınlatma, onları sıvı içinde görünür hale getirmek için kullanılabilir. Standart 6 kuyulu bir plaka, önceden genişletilmiş çapı 0,6 cm'den az olan numuneleri barındırabilir. Ters bir sistemde görüntüleme için cam alt kuyu plakası kullanılmalıdır. - Numuneleri 10 dakika boyunca RT'de 1x PBS'de yıkayın. İstenirse, sindirim işlemi DAPI lekesini yıkayınca numuneyi 300 nM DAPI ile yeniden lekeleyin. Rt'de 20 dakika boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş 300 nM DAPI ile PBS ve lekeyi çıkarın ve ardından RT'de 1x PBS ile 10 dk yıkayın.
NOT: Numuneler 1x PBS ile kaplanabilir ve bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir. - Numuneleri genişletmek için PBS'yi değiştirin ve RT'de 10 dakika boyunca her biri için 3−5 kez ddH2O (en az 10 x son jel hacmi) hacmi fazlalığıile yıkayın.
NOT: 3 veya4 yıkamadan sonra numunenin genişlemesi platoya başlanmalıdır. Depolama için, bakteri üremesini önlemek için, ddH2O ile takviye edilebilir 0.002%−0.01% sodyum azit (NaN3). Bu durumda, son genişleme faktörü geri döndürülen% 10 azalır. - Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
NOT: Jellerin sürüklenmesini önlemek için, fazla sıvı kuyudan çıkarılabilir. Jeller de 1.5−2% düşük erime agarose ile hareketsiz olabilir. Çözelti hacminin 2−4 katı bir kapta suda 1,5−2%(w/v) az erimiş agarose hazırlayın. Çözeltiyi 40 °C'lik bir su banyosunda veya mikrodalgafırında 10−20 s ısıtın ve çözeltiyi eritin. Pipet jel kenarlarında erimiş agarose. Agarose'un RT veya 4 °C'de sertlemesine izin verdikten sonra, dehidratasyonu önlemek için numuneye su ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol başarıyla uygulanmışsa(Şekil 1),numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve saydam bir jel olarak görünür (Şekil 3A) ve suda 3−4.5x faktörüile genişleyebilir (Şekil 3B), kullanılan son genleşme faktörü ve görüntüleme sistemine bağlı olarak ~70 nm etkin bir çözünürlük sağlayarak5,16. Şekil 4, ExPath protokolü kullanılarak işlenen 5 μm kalınlığındaff böbrek örneğinin örnek görüntülerini gösterir. Jelleştirilmiş numunelerin tam genişlemesi suda 4,5 x genleşme faktörü ile sonuçlandı ve 0,95 NA hedefi kullanılarak görüntülendiğinde ~63 nm'lik etkili bir çözünürlük verdi. Doku ilk parafin kaldırmak için ksilen ile önceden işlenmiş ve rehydrated (bölüm 2.1.1), sitrat tampon (bölüm 2.2) ile antijen alma izledi. Daha sonra kurtarılan doku, karbonhidratları etiketlemek için nükleer DNA ve buğday mikrobu aglütinini (WGA) görselleştirmek için DAPI ile birlikte alfa-aktin 4 (ACTN4) ve vimentin antikorları ile boyandı. Örnek daha sonra dönen bir disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir(Şekil 4A,B,D). Dokular yukarıdaki protokole göre tedavi edildi ve suda tamamen genişletildi (Şekil 4C,E). Benzer şekilde Şekil 5, kapak camı çıkarmak için ksilen (bölüm 2.1.2) ile tedavi edilen ve ffpe örneği olarak ele alınan H&E lekeli normal meme dokusunun örnek görüntülerini(Şekil 5A)gösterir (bölüm 2.1.1). Homojenizasyon sırasında H&E lekesi dokudan çıkarılır. Bir dönen disk konfokal mikroskobunda elde edilen DAPI lekeli numunenin genişleme sonrası görüntüleri(Şekil 5B)genişleme öncesi görüntülerle karşılaştırıldığında 5,1 genleşme faktörüne işaret eder ve ~43 nm'nin etkin bir çözünürlüğünü bir NA 1.15 lens.
ExPath protokolü kullanılarak işlenen düzeltilmemiş dondurulmuş böbrek dilimleri için örnek veriler Şekil 6'dagörülebilir. Doku ilk soğuk aseton (bölüm 2.1.3) sabit ve ACTN4, vimentin, DAPI ve WGA ile lekeli oldu. Genişletme öncesi (gösterilmeyen) ve genişleme sonrası görüntülerin karşılaştırılması, 4,5'lik bir genişletme faktörü gösterir. Aseton sabitdondurulmuş böbrek örneklerinden elde edilen karşılaştırma verileri FFPE örneklerine(Şekil 4C,E)göre genişletilmiş FFPE numunesinde ACTN4 boyama kalitesinin azaldığını göstermektedir, bu da antijenitenin bozulmasına bağlı olabilir. fiksasyon yöntemi nedeniyle16.
Şekil 1: Genişleme patolojisi şeması (ExPath) iş akışı. Klinik olarak arşivlenmiş doku slaytlarının ön işleme sokulan ilk bölümü depolama formatına göre yapılır. Numuneler daha sonra konvansiyonel immünboyama protokolleri kullanılarak boyanır ve genişleme öncesi görüntüler elde edilir. Örnekler daha sonra hidrojel proteinleri bağlamak için akriloyl-X SE (AcX) ile tedavi edilir. In situ polimerizasyon proteinaz K (ProK) kullanılarak mekanik homojenizasyondan önce önceden oluşturulmuştur. Örnekler daha sonra görüntüleme denönce ddH 2O'da genişletilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Patoloji örnekleri için jelleşme odası. (A) Elmas bir bıçakla kesilen iki adet #1,5 kapaklı cam gibi iki boşluk, numuneyi 4 °C'de jelleme çözeltisinde kuluçkaya yatırıldıktan sonra dokunun her iki tarafına yerleştirilir. Spacers doku dilimleri daha kalın olmalıdır, örnek sıkıştırma önlemek için. (B) #1,5 kapaklı cam parçası gibi bir kapak, 37 °C'de kuluçkadan önce numuneyi kapsayacak şekilde kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Örnek genişletme örneği. DDH2O'da 5 μm kalınlığında böbrek numunesi homojenizasyon sonrası, (A) öncesi ve (B) genişleme sonrası gösterilmiştir. Izgara kareler 5 mm x 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 5 μm kalınlığında FFPE böbrek örneklerinden elde edilir. (A) Önceden genişletilmiş görüntü. (B) A panelinde ana hatlanan bölgenin büyütülmüş ön genişletme görüntüsü ve(C)numune suda tamamen genişletildikten sonra aynı ilgi alanının ilgili genişleme sonrası görüntüsü. (D) B panelinde ana hatlarıyla belirtilen bölgenin büyütülmüş görüntüsü ve (E) numune suda tamamen genişletildikten sonra aynı ilgi alanının ilgili genişleme sonrası görüntüsü. Çatlama, bozulmalar ve etiketli hedeflerin kaybı yetersiz demirleme ve/veya homojenizasyon sonucu olabilir(F,G). Tüm görüntüler 20x (NA 0.95; su daldırma) hedefi(A-E,G)veya 10x (NA 0.5) hedefi(F)ile dönen bir disk konfokal mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. Mavi, DAPI; yeşil, vimentin; kırmızı, alfa-aktin 4 (ACTN4); macenta, WGA. Ölçek çubukları = 100 μm(A,F,G, sarı ölçek çubukları genişleme sonrası görüntüleri gösterir); 50 μm (B), 50 μm (C, fiziksel boyut genişleme sonrası genişleme 225 μm; genleşme faktörü 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, fiziksel boyut genişleme sonrası genişleme 112,5 μm; genleşme faktörü 4.5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: H&E lekeli normal meme dokusunun temsilcisi sonuçlar. (A) Önceden genişletilmiş H & E lekeli doku Brightfield görüntü 40x (0.95 NA) hedefi ile alınan. (B) Numune suda tamamen genişletildikten sonra aynı ilgi alanının genişleme sonrası DAPI görüntüsü. Görüntü 40x (NA 1.15; su daldırma) hedefi kullanılarak dönen bir disk konfokal mikroskobundan elde edilmiştir. Ölçek çubukları = 10 μm(A, sarı ölçek çubuğu genişleme sonrası görüntüleri gösterir) ve 2 μm(B, fiziksel boyut genişleme sonrası genişleme 50.1 μm; genleşme faktörü 5.1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 40x (NA 1.15; su daldırma) hedefi yle dönen bir disk konfokal mikroskobundan elde edilen genleşme sonrası taze dondurulmuş böbrek örneklerinin temsili sonuçları. Mavi = vimentin; yeşil = alfa-aktin 4 (ACTN4); kırmızı = kollajen IV; gri = DAPI. Ölçek çubuğu = 10 μm (fiziksel boyut sonrası genleşme 45 μm; genleşme faktörü 4.5). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşen | Stok konsantrasyonu | Stok hacmi (mL) | Son konsantrasyon | 10 mL başına son tutar |
| Sodyum akrilat | 0.380 g/mL | 2.25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Akrilamid | 0.500 g/mL | 0.50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N,N′-Metilenebisacrylamide | 0.020 g/mL | 0.50 | 0.001 g/mL | 0,10 g |
| Sodyum klorür | 0.292 g/mL | 4.00 | 0,117 g/mL | 1.17 g |
| Pbs | 10x | 1.00 | 1 x | 1 x |
| Su | 1.15 | |||
| Toplam Hacim | 9.40 |
Tablo 1: Monomer çözeltisinin bileşenleri. Tüm konsantrasyonlar PBS hariç g/mL (w/v) açısından verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM5'in bir varyantı olan ExPathprotokol16'yısıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath'e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine9, ExPath sindirim tampon EDTA daha yüksek bir konsantrasyon dayanır, formalin-sabit dokuların genişlemesini artırır, orijinal ExPath çalışmada gösterildiği gibi16. Protokol 5−10 μm kalınlığında klinik örnekler de doğrulandı16, ama aynı zamanda bazı değişiklikler ile kalın doku örnekleri uygulanabilir. Bu protokoldeki en kritik adımlar şunlardır: 1) jelleşme adımlarının zamanlaması; 2) jelleşme odası kurulumu; örnek homojenizasyon için 3) parametreleri; ve 4) jel işleme.
Bu protokol için en kritik parametre jelleşme adımlarının zamanlamasıdır. Jelleşme çözeltisi zamanından önce polimerize olursa, numune jel matrisine yeterince bağlı olmayacaktır. Yetersiz demirleme ve erken jelasyon bozulmalara neden olabilir, genişlemeyi sınırlayabilir ve hedef moleküllerin kaybına neden olabilir(Şekil 4F,G). Jelasyonun başlatılması ısıya bağlıdır, bu nedenle karışık jelleşme çözeltisini hedef numunenin üzerine yerleştirmeden önce 4 °C'de tutmak önemlidir. Başlatıcı, APS, taze hazırlanmış olmalı ve jelleme solüsyonu uygulamadan hemen önce eklenmelidir. APS RT'de stabil değildir ve donma-çözülme döngülerinden geçtikten sonra etkinliğini kaybedebilir. Yetersiz demirleme de uzun süreli depolama sonra veya su ile temas tan sonra aktivite kaybedebilir ankraj bileşik, AcX, azaltılmış reaktivitesi sonucu olabilir. AcX'in -20 °C'de kurutulmuş bir ortamda 6 aylık depolamadan sonra faaliyetini koruduğu tespit edilmiştir. Erken jelleşme distorsiyon şüpheli nedeni değilse, AcX yeni bir stok çözümü hazırlanabilir.
Jelleşme odasının kurulumu sırasında, hava kabarcıkları kapak cam kapağı altında sıkışıp olabilir. Bu kabarcıklar numunenin üstünde veya doğrudan dokunuyorsa, bozulmalara neden olabilir. Haznenin yan tarafına daha fazla jelling çözeltisi ekleyerek numuneden uzaklaştırılabilirler. Hava kabarcıkları önlemeye yardımcı olmak için, jelling çözeltisi küçük bir damla doku üzerine yerleştirmeden önce kapak üzerine yatırılabilir.
Örnek sindirim zamana bağlıdır, sıcaklık, yanı sıra doku özellikleri, kalınlık ve doku tipi gibi. Yetersiz sindirim de bozulmalara neden olabilir ve beklenenden daha küçük bir genişleme faktörü neden olur. Eksik sindirim den şüpheleniliyorsa, sindirim süresi ve / veya ProK konsantrasyonu, kalın dokularda özellikle artabilir. ProK da zaman içinde aktivite kaybedebilir. ProK,-20 °C'de depolanmalıdır ve serbest çözülme döngülerini önlemek için daha küçük hacimlerde kullanılabilir.
Homojenize edilmiş numuneleri işlerken, özellikle tamamen genişletildiğinde dikkatli olunmalıdır. Numunenin sıvıya batırıldığında bulunması zorsa, kabı farklı açılardan aydınlatmak, jelin görüntülenmesi için olay ışığını dağıtabilir. Tamamen genişletilmiş jeller kırılgan dır ve kullanım sırasında kırılabilir. Genişletilmiş jellerin aktarılması için yumuşak fırçalar ve plastik spatulaların kullanılması tavsiye edilir.
ExPath protokolü, klinik biyopsi örneklerinde nanoölçekli yapıları sorgulamak için mevcut süper çözünürlüklü görüntüleme ve elektron mikroskobu tekniklerine uygun maliyetli bir alternatif sunmaktadır. ProK homojenizasyon dan sonra numunenin eşit şekilde genişlemesini sağlasa da, protein kaybı genişleme sonrası diğer ilgi hedeflerinin sorgulanmasını önler. Ancak, protokol kolayca herhangi bir düzenli ıslak laboratuvarda yapılabilir. En önemlisi, nanoölçekli özelliklerin görüntülemesi, biyoloji laboratuvarlarında ve görüntüleme çekirdek tesislerinde yaygın olarak bulunan konvansiyonel geniş alan veya konfokal mikroskoplarda yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ ve OB, burada açıklanan teknolojilerin bir alt kümesi nde patent koruması almış ve başvuran mucitlerden ikisidir (ABD patentleri US20190064037A1, WO2018157074A1 ve WO201815704A1 ve WO2018157048A1).
Acknowledgments
Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi (YZ) ve NIH Direktörü'nün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD025926-01'den YZ'ye) Fakülte Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
