Summary
A imagem latente de nanoscale de amostras clínicas do tecido pode melhorar a compreensão da patogénese da doença. A patologia de expansão (ExPath) é uma versão da microscopia de expansão (ExM), modificada para compatibilidade com amostras de tecido clínico padrão, para explorar a configuração de nanoescala de biomoléculas usando microscópios limitados de difração convencional.
Abstract
Na patologia moderna, a microscopia óptica desempenha um papel importante no diagnóstico da doença, revelando estruturas microscópicas de espécimes clínicos. No entanto, o limite de difração física fundamental impede a interrogação da anatomia de nanoescala e alterações patológicas sutis ao usar abordagens de imagem óptica convencionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato, chamado patologia da expansão (expath), para a imagem latente ótica nanoescala de tipos comuns de espécimes preliminares clínicos do tecido, incluindo o tecido fixo-congelado ou formalin-fixo da parafina incorporado (ffpe) Seções. Este método contorna o limite ótico da difração quimicamente transformando as amostras do tecido no híbrido do tecido-Hydrogel e expandindo-os fisicamente isotropicamente através das escalas múltiplas na água pura. Devido à expansão, moléculas previamente inresolvíveis são separadas e, portanto, podem ser observadas usando um microscópio óptico convencional.
Introduction
Investigar a organização molecular dos tecidos em um contexto tridimensional (3D) pode proporcionar uma nova compreensão das funções biológicas e do desenvolvimento da doença. No entanto, esses ambientes de nanoescala estão além das capacidades de resolução de microscópios limitados de difração convencional (200 − 300 nm), onde a distância mínima resolvível, d é definida por d α λ/na. Aqui λ é o comprimento de onda da luz e na é a abertura numérica (na) do sistema de imagem. Recentemente, a visualização direta de moléculas etiquetadas cDNAs foi feita possível por técnicas de imagem latente recentemente desenvolvidas da super-definição1,2,3, incluindo a depleção de emissão estimulada (sted), microscopia de Localização foto-ativada (PALM), microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM). Embora essas técnicas de imagem tenham revolucionado a compreensão da função biológica na nanoescala, na prática, eles muitas vezes dependem de equipamentos caros e/ou especializados e etapas de processamento de imagem, podem ter um tempo de aquisição mais lento em comparação com a imagem latente ótica convencional, exige fluoróforos com características específicas (tais como a capacidade da foto-comutação e/ou o photostability elevado). Além disso, continua a ser um desafio para executar imagens 3D de super resolução em espécimes de tecido.
A microscopia de expansão (Exm), introduzida primeiramente em 20154, fornece meios alternativos de características da nanoescala da imagem latente (< 70 nanômetro) fisicamente expandindo amostras preservadas encaixadas em um Hydrogel expansível do polyeletrólito. Aqui, as principais biomoléculas e/ou rótulos são ancorados in situ a uma rede de polímeros que pode ser isotopicamente expandida após o processamento químico. Como a expansão física aumenta a resolução efetiva total, as moléculas de interesse podem ser resolvidas usando sistemas convencionais de geração de imagens com limitação de difração. Desde a publicação do protocolo original, onde rótulos fluorescentes sintetizados personalizados foram ancorados à rede de polímeros4, novas estratégias têm sido usadas para ancorar diretamente as proteínas (retenção de proteínas Exm, ou proexm)5, 6,7,8,9 e RNA9,10,11,12 ao Hydrogel, e aumentam a ampliação física com iterativo expansão13 ou adaptando a química do gel8,14,15.
Aqui nós apresentamos uma versão adaptada de proExM, chamada patologia da expansão (ExPath)16, que foi aperfeiçoada para formatos clínicos da patologia. O protocolo converte amostras clínicas, incluindo o formalin-fixo parafina-encaixado (ffpe), o hematoxilina e a eosina (H & e) manchado, e os espécimes humanos fresco-congelados do tecido montados em corrediças de vidro, em um estado compatível com Exm. As proteínas são então ancoradas no hidrogel e a homogeneização mecânica é realizada (Figura 1)16. Com uma expansão linear de 4 dobras das amostras, as imagens multicolor da super-definição (~ 70 nanômetro) podem ser obtidas usando um microscópio confocal convencional que tem somente uma definição do ~ 300 nm e pode igualmente ser combinada com outras técnicas de imagem latente da super-definição.
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Protocol
1. preparação de reagentes e soluções de estoque
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Prepare os componentes da solução de gelificação.
Nota: as concentrações da solução são dadas em g/ml (w/v por cento).- Faça as seguintes soluções de estoque: 38% (w/v) acrilato de sódio (SA), 50% (w/v) acrilamida (AA), 2% (w/v) N, N′-metilenebisacrilamida (BIS), e 29,2% (w/v) cloreto de sódio (NaCl). Dissolva os compostos em água duplamente desionizada (ddH2o). Use os montantes na tabela 1 como referência; as soluções preparadas podem ser dimensionadas para cima ou para baixo em volume conforme necessário. Por exemplo, para fazer 10 mL de uma solução de SA 38% (w/v), adicione 1,9 g SA a um cilindro graduado de 10 mL e adicione ddH2o a um volume de 5 ml.
- Prepare 9,4 mL de solução de monômero a uma concentração de 1,06 x, como mostrado na tabela 1.
Nota: Isso resultará em uma concentração de 1x após a adição do iniciador, acelerador e inibidor. O estoque do monómero pode ser armazenado em 4 ° c por até 3 meses, ou em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo. - Prepare as seguintes soluções de estoque separadamente em ddH2o: 0,5% (w/v) do inibidor 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetrametilpiperidina-1-OXILO (4ht), que inibe a gelação para permitir a difusão da solução de geladura em tecidos, 10% (v/v) do tetrametilethylenediamine do iniciador (TEMED), que acelera a geração radical pelo persulfato do amónio (APS), e 10% (w/v) APS que inicia o processo gelificação.
Nota: As soluções de stock de 4HT e TEMED podem ser preparadas em alíquotas de 1 mL e armazenadas a-20 ° c durante pelo menos 6 meses. O APS foi encontrado para perder a eficácia após o armazenamento a longo prazo e é preparado melhor em quantidades pequenas (< 0.1 mL) imediatamente antes de Gelling.
- Prepare o tampão de digestão (50 mM TRIS pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] surfactante não iônico, 0,8 M NaCl) combinando 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3, 3 g de base Tris em 25 mL de ddH2O), 25 ml de EDTA (0,5 m pH 8) , 2,25 g de surfactante não iônico e 23,38 g de NaCl. Adicionar ddH2O para um volume total de 500 ml.
Nota: A solução pode ser dimensionada para cima ou para baixo conforme necessário e ser armazenada a 4 ° c. Proteinase K (ProK) será adicionado imediatamente antes da etapa de digestão. - Prepare solução de citrato de sódio a 20 mM combinando 2,941 g de citrato de sódio tribásico dihidratado com 500 mL de ddH2O e ajustando o pH para 8,0 à temperatura ambiente (RT). Dimensione o volume de estoque conforme necessário.
- Prepare uma solução de estoque de 6-((acryloyl) amino) hexanoic acid, grufo Ester (acryloyl-X, se; AcX), o composto de ancoragem. Dissolver AcX em 500 μL de dimetil sulfóxido anidro (DMSO) para uma concentração final de 10 mg/mL.
Nota: A solução pode ser armazenada em um ambiente dessecado a-20 ° c em alíquotas de 20 μL. - Se não estiver usando buffers disponíveis comercialmente para imunomarcação, prepare o buffer de bloqueio. Use um amortecedor de bloqueio de 5% (v/v) soro animal normal e 0,1% (w/v) surfactante nonionic em 1x fosfato-tampão salino (PBS) e selecione o soro baseado no animal do anfitrião dos anticorpos secundários. Por exemplo, para preparar 500 mL de tampão de bloqueio para anticorpos levantados na cabra, combine 25 mL de soro de cabra, 0,45 g de surfactante não iônico, e 1X PBS a um volume de 500 mL.
2. preparação de slides de tecido clínico arquivados e recém-preparados para ExPath
- Converta o tecido em um formato compatível com ExPath. Escolha uma das quatro etapas seguintes (2.1.1 − 2.1.4) com base no modo como a amostra foi preparada: lâminas de FFPE, lâminas de FFPE manchadas ou lâminas de tecido congelado fixas ou fixadas em uma solução de temperatura de corte ótima (OCT).
Nota: estes são baseados em passos de recuperação padrão para amostras de patologia e não são específicos para o protocolo ExPath.- Amostras clínicas de FFPE
- Prepare 30 mL de 95% de etanol, 70% de etanol e 50% de etanol. Medir 30 mL de xileno, 100% de etanol e ddH2O.
- Coloque o slide com a amostra em um 50 mL cônico usando fórceps e adicione 15 mL de xileno. Tampe o tubo e posicione-o horizontalmente em um agitador orbital a aproximadamente 60 RPM e incubar em RT por 3 min para cada solução. Repita com os restantes 15 mL de xileno.
- Repita a etapa 2.1.1.2 com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, 50% de etanol e ddH2O em lugar de xileno.
- Lâminas permanentes manchadas e montadas
- Coloque o slide em um prato de Petri de 100 mm e cubra com xileno. Retire cuidadosamente a lamínula com uma lâmina de barbear. Se a lamínula não for facilmente removida, devolva o slide ao xileno até que a lamínula se afrouxa.
- Processo que usa as etapas para amostras de FFPE (etapas 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
Nota: No caso de lâminas manchadas de H & E, as manchas são eliminadas durante o processo de expansão.
- Deslizamentos de tecido congelado não fixos na solução de OCT
- Fixar o tecido em acetona a-20 ° c durante 10 min.
- Lave as amostras com solução 1X PBS 3 vezes por 10 min cada na RT.
- Lâminas de tecido clínico previamente fixas e congeladas
- Incubar os slides por 2 min em RT para derreter a solução OCT.
- Lave a amostra com solução 1X PBS 3 vezes por 5 min cada na RT.
- Amostras clínicas de FFPE
- Realize o tratamento térmico para a recuperação do antígeno em todas as amostras após a conversão do formato.
- Adicione 20 mM de solução de citrato (pH 8 em RT) em um recipiente resistente ao calor, como um frasco de coloração de slides.
Nota: Deve haver solução suficiente para cobrir o tecido montado na corrediça (50 mL para um frasco de coloração de slide padrão). - Aqueça a solução de citrato a 100 ° c no microondas e coloque o slide na solução. Transfira imediatamente o recipiente para uma câmara de incubação e incubar a 60 ° c durante 30 min.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As lâminas podem ser colocadas em placas de Petri e cobertas em 1X PBS e armazenadas a 4 ° c.
- Adicione 20 mM de solução de citrato (pH 8 em RT) em um recipiente resistente ao calor, como um frasco de coloração de slides.
- Manchar a amostra usando protocolos de coloração padrão da imunofluorescência (se)/immunohistochemistry (IHC).
Nota: as concentrações específicas de anticorpos primários e secundários e as durações de coloração dependem das concentrações sugeridas pelo fabricante ou pela otimização para o experimento específico.- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite ao redor da seção (s) de tecido no slide para minimizar o volume de solução necessária para cobrir o tecido. Coloque o slide em um prato grande o suficiente para caber o slide. Para um slide de 3 polegadas padrão, use um prato de Petri de 100 mm.
Nota: A caneta hidrofóbica não interfere na polimerização da amostra nem no processo de digestão. - Incubar o tecido com tampão de bloqueio para 1 h a 37 ° c, 2 h em RT, ou 4 ° c durante a noite para reduzir a ligação não específica.
- Diluir os anticorpos primários à concentração desejada na quantidade adequada de tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de coloração preferido). Incubar os tecidos com a solução de anticorpo primário por pelo menos 3 h a RT ou 37 ° c, ou durante a noite a 4 ° c.
Nota: As amostras devem ser colocadas em um recipiente humidificado (tal como uma placa de Petri com uma limpeza úmida) para impedir que o tecido seque para fora. Tipicamente, os anticorpos foram diluídos a 1:100 − 1:500 em 200 − 500 μL do tampão, dependendo do tamanho do tecido e do anticorpo usado. - Lave o tecido com tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de lavagem preferido) 3 vezes por 10 min em RT.
- Diluir anticorpos secundários (e 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] se desejado), em tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de coloração preferido) a uma concentração de aproximadamente 10 μg/mL. Incubar o tecido na solução de anticorpos secundários durante pelo menos 1 h a RT ou 37 ° c.
Nota: O sincronismo pode ser ajustado dependendo dos anticorpos usados e da espessura do tecido. Os anticorpos secundários que contenham corantes de cianina (Cy3, Cy5, Alexa 647) não são compatíveis com o protocolo ExM quando aplicados pré-polimerização. Corantes sugeridos incluem Alexa 488 (verde), Alexa 546 (laranja/vermelho) e ATTO 647N ou CF633 (far-Red). DAPI deve ser reaplicado após a expansão, como ele é lavado durante o processo de expansão. - Lave o tecido com tampão de bloqueio preparado (ou outro tampão de lavagem preferido) 3 vezes por 10 min cada no RT.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As lâminas podem ser colocadas em placas de Petri e cobertas em 1X PBS e armazenadas a 4 ° c. - Realize a imagem latente fluorescente usando um microscópio convencional do largo-campo, um microscópio confocal, ou o outro sistema da imagem latente da escolha.
Nota: Esta etapa é necessária para determinar o comprimento biológico usando o fator de expansão, comparando imagens pré e pós-expansão. Para facilitar a imagem latente da borne-expansão, as regiões de interesse facilmente identificáveis devem ser selecionadas e as imagens na ampliação baixa e elevada devem ser coletadas.
- Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um limite ao redor da seção (s) de tecido no slide para minimizar o volume de solução necessária para cobrir o tecido. Coloque o slide em um prato grande o suficiente para caber o slide. Para um slide de 3 polegadas padrão, use um prato de Petri de 100 mm.
3. polimerização in situ de espécimes
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Incubar a amostra na solução de ancoragem.
- Prepare a solução de ancoragem (tipicamente 250 μL é suficiente para cobrir a seção do tecido) diluindo a solução de estoque AcX em 1X PBS para uma concentração de 0, 3 mg/mL para amostras fixadas com fixadores não-aldeído ou 0,1 mg/mL para amostras fixadas com fixadores de aldeído , que têm menos aminas livres disponíveis para reagir com AcX.
- Coloque o slide em um prato de Petri de 100 mm e pipetar a solução de ancoragem sobre o tecido. Incubar por pelo menos 3 h na RT ou durante a noite a 4 ° c.
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Incubar as amostras na solução gelificação.
- Prepare pelo menos 100 vezes o volume excedente de solução gelificação. Por 200 μL, combine o seguinte, em ordem: 188 μL de solução de monômero, 4 μL de solução de estoque de 0,5% 4HT (1:50 diluição, concentração final: 0, 1%), 4 μL de solução de estoque de 10% de TEMED (1:50 diluição, concentração final 0,2%) e 4 μL de solução de estoque de 10% APS (1:50 diluição, concentração final 0,2%).
Nota: A solução de Gelling deve ser feita imediatamente antes do uso. A solução deve ser mantida a 4 ° c e a solução APS deve ser adicionada por último, para evitar a gelagem prematura. - Remova a solução adicional da seção do tecido e coloc a corrediça em um prato de Petri de 100 milímetros. Adicione a solução fresca, gelificação fria à amostra e incubar a mistura no tecido por 30 minutos em 4 ° c, para permitir a difusão da solução no tecido.
- Prepare pelo menos 100 vezes o volume excedente de solução gelificação. Por 200 μL, combine o seguinte, em ordem: 188 μL de solução de monômero, 4 μL de solução de estoque de 0,5% 4HT (1:50 diluição, concentração final: 0, 1%), 4 μL de solução de estoque de 10% de TEMED (1:50 diluição, concentração final 0,2%) e 4 μL de solução de estoque de 10% APS (1:50 diluição, concentração final 0,2%).
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Construa uma câmara na corrediça em torno da amostra (Figura 2a) sem perturbar a solução gelificação.
- Faça espaçadores para a câmara gelando por pedaços de corte fino de vidro de cobertura usando uma faca de diamante.
Nota: Para facilitar a expansão do borne da imagem latente, os espaçadores devem ser próximos na espessura ao espécime do tecido para reduzir a quantidade de gel em branco acima do tecido. O vidro do número 1,5 pode ser usado para amostras clínicas padrão (5 − 10 μm). As partes de vidro da tampa podem ser empilhadas para amostras mais grossas. - Fixe os espaçadores em ambos os lados do tecido usando gotas de água (~ 10 μL).
- Coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre a lâmina, certificando-se de evitar a captura de bolhas de ar sobre o tecido (Figura 2B).
- Faça espaçadores para a câmara gelando por pedaços de corte fino de vidro de cobertura usando uma faca de diamante.
- Incubar a amostra a 37 ° c num ambiente humidificado (como um prato de Petri fechado com uma limpeza úmida) durante 2 h.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A câmara deslizante pode ser armazenada dentro de um prato de Petri selado a 4 ° c.
4. digestão da amostra
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Retire a tampa da câmara de gelificante deslizando suavemente uma lâmina de barbear a lamínula e levantando lentamente o lamínula da superfície do gel. Aparar o gel em branco em torno do tecido para minimizar o volume. Corte o gel assimetricamente para rastrear a orientação do gel após a homogeneização, uma vez que a amostra se tornará transparente.
- Diluir ProK por 1:200 no tampão da digestão (concentração final 4 U/mL) antes do uso. Prepare solução suficiente para submergir completamente o gel; um poço único de uma placa de cultura de células plásticas de quatro poços requer pelo menos 3 mL por poço.
- Incubar a amostra em um recipiente fechado contendo o tampão de digestão por 3 h a 60 ° c. Se a amostra não se desanexar do slide durante a digestão, use uma lâmina de barbear para remover suavemente a amostra.
Nota: O espécime deve completamente ser submergido no amortecedor da digestão para impedir que a amostra seque para fora e coloc em um recipiente coberto (caixa pequena da corrediça, poço plástico, prato de Petri, etc.) que podem ser selados com película.
5. expansão e imagem latente da amostra
- Use uma escova de pintura macia para transferir o espécime em 1X PBS em um recipiente compatível com o sistema de imagem desejado e grande o suficiente para acomodar o gel totalmente expandido. Certifique-se de que o tecido é coloc com o amostra-lado para baixo se imagem latente em um sistema invertido ou para cima se imagem latente em um sistema ereto para minimizar a distância do objetivo da imagem latente à amostra. Vire o gel usando uma escova de pintura macia, se necessário.
Nota: O lado-iluminação de um diodo emissor de luz pode ser usado para fazê-los visíveis no líquido. Uma placa 6-well padrão pode acomodar as amostras que têm um diâmetro pre-expandido menos de 0,6 cm. Uma placa de poço inferior de vidro deve ser usada para a imagem latente em um sistema invertido. - Lave as amostras em 1X PBS em RT por 10 min. Se desejado, re-mancha a amostra com 300 nanômetro DAPI enquanto o processo da digestão lava afastado a mancha de DAPI. Remover PBS e mancha com 300 nM DAPI diluído em 1X PBS por 20 min em RT, seguido por uma lavagem de 10 min com 1X PBS em RT.
Nota: As amostras podem ser cobertas com 1X PBS e armazenadas a 4 ° c antes de prosseguir para a próxima etapa. - Para expandir as amostras, substitua o PBS e lave com um volume excessivo de ddH2o (pelo menos 10x o volume final do gel) 3 − 5 vezes por 10 min cada, no RT.
Nota: Após o 3RD ou 4ª lavagem, a expansão do espécime deve começar a platô. Para o armazenamento, para evitar o crescimento bacteriano, o ddH2o pode ser suplementado com a azida sódica de 0,002% − 0,01% (NaN3). Neste caso, o fator de expansão final é reduzido reversivelmente em 10%. - Realize a imagem latente da fluorescência usando um microscópio convencional do largo-campo, um microscópio confocal, ou o outro sistema da imagem latente da escolha.
Nota: Para evitar géis de deriva, o excesso de líquido pode ser removido do poço. Os géis podem igualmente ser imobilizados com o agarose do baixo-derretimento de 1.5 − 2%. Prepare o agarose do baixo-derretimento de 1.5 − 2% (w/v) na água em um recipiente 2 − 4 vezes o volume de solução. Aqueça a solução em um banho de água de 40 ° c ou em um microondas para 10 − 20 s para derreter a solução. Pipeta o agarose derretido em torno das bordas do gel. Depois de permitir que o agarose para endurecer a RT ou 4 ° c, adicione água à amostra para evitar a desidratação.
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Representative Results
Se o protocolo tiver sido realizado com sucesso (Figura 1), as amostras aparecerão como um gel liso e transparente após a homogeneização mecânica (Figura 3a) e podem se expandir por um fator de 3 − 4,5 x em água (Figura 3B), proporcionando uma resolução efetiva de ~ 70 nm, dependendo do fator de expansão final e do sistemade imagemutilizado 5,16. A Figura 4 mostra imagens de exemplo de uma amostra de rim ffpe de 5 μm de espessura processada usando o protocolo expath. A expansão completa das amostras geladas resultou em um fator de expansão de 4,5 x na água, dando uma resolução efetiva de ~ 63 nm quando imaged usando um objetivo do NA 0,95. O tecido foi primeiro pré-processado com xileno para remoção de parafina e rehidratado (seção 2.1.1), seguido de antígeno-recuperação com o tampão citrato (seção 2,2). O tecido recuperado foi manchado então com os anticorpos para o alfa-Actinin 4 (ACTN4) e o Vimentin, junto com DAPI para visualizar o ADN nuclear e o aglutinina do germe do trigo (WGA), para etiquetar hidratos de carbono. O espécime foi então imaged usando um microscópio confocal do disco de giro (Figura 4a, B, D). Os tecidos foram tratados seguindo o protocolo acima e totalmente expandidos em água (Figura 4C, e). Da mesma forma, a Figura 5 mostra imagens de exemplo de H & e manchada de tecido mamário normal (Figura 5a) que foi tratada com xileno (seção 2.1.2) para remover o vidro de cobertura e, em seguida, tratada como uma amostra de ffpe (seção 2.1.1). Durante a homogeneização, a mancha de H & E é eliminada do tecido. Imagens pós-expansão da amostra manchada de DAPI obtida em um microscópio confocal do disco giratório (Figura 5B) comparado com as imagens da pre-expansão indicam um fator da expansão de 5,1, dando uma definição eficaz de ~ 43 nanômetro quando imaged com uma lente NA 1,15.
Os dados de exemplo para fatias de rim congeladas não fixas processadas usando o protocolo ExPath podem ser vistos na Figura 6. O tecido foi fixado primeiramente na acetona fria (seção 2.1.3) e manchado com ACTN4, Vimentin, DAPI, e WGA. Comparação de pré-expansão (não mostrada) e imagens pós-expansão indicam um fator de expansão de 4,5. Os dados de comparação das amostras de rim congeladas com acetona à das amostras de FFPE (Figura 4C, E) mostram que há uma diminuição na qualidade da coloração ACTN4 na amostra de ffpe expandida, que pode ser devida a uma degradação da antigenicidade devido ao método de fixação16.
Figura 1: esquema do fluxo de trabalho de patologia de expansão (ExPath). O pré-processamento de lâminas de tecido clinicamente arquivados é realizado pela primeira vez com base no formato de armazenamento. As amostras são manchadas então usando protocolos convencionais da imunocoloração e as imagens da pre-expansão são obtidas. As amostras são tratadas então com acryloyl-X SE (AcX) para escorar proteínas ao Hydrogel. A polimerização in situ é pré-formada antes da homogeneização mecânica usando proteinase K (ProK). As amostras podem então ser expandidas em ddH2O antes da imagem latente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: câmara de geladura para amostras de patologia. (A) dois espaçadores, tais como duas partes de #1. o vidro da tampa de corte com uma faca do diamante, são coloc em um ou outro lado do tecido após ter incubando a amostra na solução gelificação em 4 ° c. Os espaçadores devem ser mais grossos do que as fatias do tecido, para impedir a compressão da amostra. (B) uma tampa, tal como um pedaço de vidro da tampa de #1.1, é usada para cobrir a amostra antes da incubação em 37 ° c. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplo de expansão de amostra. Uma homogenização grossa do borne da amostra do rim de 5 μm, (A) pre-e (B) borne-expansão em DDH2O é mostrada. Os quadrados da grade são 5 milímetros x 5 milímetros. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados representativos de amostras renais de 5 μm de espessura de FFPE. (A) imagem pré-expandida. (B) ampliação da imagem de pré-expansão da região delineada de interesse no painel a e (C) a imagem de pós-expansão correspondente da mesma região de interesse após a amostra ter sido totalmente expandida em água. (D) imagem ampliada da região esboçada de interesse no painel B e (e) a imagem de pós-expansão correspondente da mesma região de interesse após a amostra foi totalmente expandida em água. Rachaduras, distorções e perda de alvos rotulados podem ser o resultado de ancoragem inadequada e/ou homogeneização (F, G). Todas as imagens foram obtidas por meio de microscópio confocal de disco giratório com objetivo de 20x (NA 0,95; imersão em água) (a-E, G) ou 10x (na 0,5) (F). Azul, DAPI; verde, vimentina; vermelho, alfa-actinina 4 (ACTN4); magenta, WGA. Barras de escala = 100 μm (A, F, G, barras de escala amarela indicam imagens pós-expansão); 50 μm (B), 50 μm (C, tamanho físico pós expansão 225 μm; fator de expansão 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, tamanho físico pós-expansão 112,5 μm; fator de expansão 4,5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: resultados representativos de H &Amp; E manchada de tecido mamário normal. (A) imagem de brightfield de tecido manchado de H & E pré-expandido tomado com um objetivo de 40x (0,95 na). (B) imagem de DAPI pós-expansão da mesma região de interesse depois que a amostra foi totalmente expandida em água. A imagem foi obtida em um microscópio confocal do disco girando usando um objetivo de 40x (NA 1,15; imersão da água). Barras de escala = 10 μm (a, abarra de escala amarela indica imagens pós-expansão) e 2 μm (B, tamanho físico pós-expansão 50,1 μm; fator de expansão 5,1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: resultados representativos de amostras de rim frescas congeladas após a expansão, obtidas em um microscópio confocal de disco giratório com um objetivo de 40x (NA 1,15; imersão em água). Azul = vimentina; verde = alfa-actinina 4 (ACTN4); vermelho = colágeno IV; cinzento = DAPI. Barra de escala = 10 μm (tamanho físico pós-expansão 45 μm; fator de expansão 4,5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente | Concentração de estoque | Volume de estoque (mL) | Concentração final | Montante final por 10 mL |
| Acrilato de sódio | 0,380 g/mL | 2,25 | 0, 86 g/mL | 0,86 g |
| Acrilamida | 0,500 g/mL | 0,50 | 0, 25 g/mL | 0,25 g |
| N, N′-methylenebisacrylamide | 0, 20 g/mL | 0,50 | 0, 1 g/mL | 0,10 g |
| Cloreto de sódio | 0,292 g/mL | 4, 0 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x | 1, 0 | 1x | 1x |
| Água | 1,15 | |||
| Volume total | 9,40 |
Tabela 1: componentes da solução de monómero. Todas as concentrações são dadas em termos de g/mL (w/v), exceto PBS.
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Discussion
Aqui, nós apresentamos o protocolo16de expath, uma variação de proExM5 que pode ser aplicado aos tipos os mais comuns de amostras clínicas da biópsia usadas na patologia, incluindo ffpe, H & e espécimes manchados, e fresco-congelados em corrediças de vidro. A conversão do formato, a recuperação do antígeno, e a imunomarcação dos espécimes seguem os protocolos comumente usados que não são específicos a ExPath. Diferentemente do protocolo proExM original9, o expath conta com uma maior concentração de EDTA no tampão de digestão, o que melhora a expansão dos tecidos fixos formalina, como demonstrado no estudo original do expath16. O protocolo foi validado em espécimes clínicos grossos de 5 − 10 μm16, mas poderia igualmente ser aplicado às amostras mais grossas do tecido com alguma modificação. As etapas as mais críticas neste protocolo são: 1) o sincronismo das etapas do gelificação; 2) instalação da câmara de Geladura; 3) parâmetros para homogeneização da amostra; e 4) manuseio do gel.
O parâmetro mais crítico para este protocolo é o timing das etapas de gelação. Se a solução de gelificação polimeriza prematuramente, a amostra não será suficientemente ancorada à matriz de gel. A ancoragem inadequada e a gelação prematura podem causar distorções, limitar a expansão e resultar na perda de moléculas alvo (Figura 4F, G). A iniciação da gelação é dependente da temperatura, conseqüentemente é importante manter a solução gelificação misturada em 4 ° c antes de coloc a no espécime do alvo. O iniciador, APS, deve ser preparado recentemente e adicionado imediatamente antes de aplicar a solução gelificação. A APS não é estável na RT e pode perder a eficácia depois de passar por ciclos de congelamento-degelo. A ancoragem insuficiente pode igualmente ser o resultado da reactividade reduzida do composto de ancoragem, AcX, que pode perder a atividade após o armazenamento a longo prazo ou após o contato com água. O AcX foi encontrado para reter a atividade após 6 meses do armazenamento em um ambiente Desiccated em-20 ° c. Se a gelação prematura não for a causa suspeita de distorção, uma nova solução de estoque de AcX pode ser preparada.
Durante a instalação da câmara de geladura, as bolhas de ar podem ficar presas a tampa de vidro da tampa. Se essas bolhas estiverem em cima ou tocando diretamente na amostra, elas podem causar distorções. Podem ser afastaram-se do espécime adicionando mais solução gelificação através do lado da câmara. Para ajudar a evitar bolhas de ar, uma pequena gota de solução gelificação pode ser depositada na tampa antes de colocá-lo sobre o tecido.
A digestão da amostra é dependente do tempo, da temperatura, assim como das propriedades do tecido, tais como a espessura e o tipo do tecido. Digestão inadequada também pode causar distorções e resultar em um fator de expansão que é menor do que o esperado. Se houver suspeita de digestão incompleta, o tempo de digestão e/ou a concentração de ProK podem ser aumentados, especialmente no caso de tecidos mais grossos. O ProK também pode perder atividade ao longo do tempo. Para preservar a sua atividade, o ProK deve ser armazenado a-20 ° c e pode ser alicitado em volumes menores para evitar ciclos de descongelamento livre.
Deve-se tomar cuidado ao manusear amostras homogeneizadas, especialmente quando totalmente expandidas. Se o espécime é difícil de localizar quando submerso em líquido, iluminando o recipiente de diferentes ângulos pode dispersar a luz incidente para permitir a visualização do gel. Géis totalmente expandidos são frágeis e podem quebrar durante o manuseio. Recomenda-se a utilização de escovas macias e espátulas plásticas para transferir os géis expandidos.
O protocolo expath fornece uma alternativa rentável às técnicas atuais da imagem latente e da microscopia de elétron da superresolução para interrogar estruturas do nanoescala em espécimes clínicos da biópsia. Embora ProK forneça mesmo a expansão da amostra após a homogeneização, a perda de proteínas impede a interrogação de outros alvos do borne-expansão do interesse. No entanto, o protocolo pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório molhado regular. Mais importante ainda, a imagem latente de características do nanoescala pode ser realizada em microscópios Wide-Field ou confocal convencionais que são encontrados geralmente em laboratórios da biologia e em facilidades do núcleo da imagem latente.
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Disclosures
YZ e OB são dois dos inventores que preencheram e obtiveram proteção de patentes em um subconjunto das tecnologias descritas aqui (patentes dos EUA US20190064037A1, WO2018157074A1 e WO2018157048A1).
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo fundo de start-up da faculdade da Universidade de Carnegie Mellon (YZ) e do prêmio novo Inovator do diretor de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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