Summary
La formation image à l'échelle nanométrique d'échantillons de tissus cliniques peut améliorer la compréhension de la pathogénie de la maladie. La pathologie d'expansion (ExPath) est une version de la microscopie d'expansion (ExM), modifiée pour la compatibilité avec les échantillons cliniques standard de tissu, pour explorer la configuration nanométrique des biomolécules utilisant des microscopes limités de diffraction conventionnelle.
Abstract
Dans la pathologie moderne, la microscopie optique joue un rôle important dans le diagnostic de la maladie en révélant des structures microscopiques de spécimens cliniques. Cependant, la limite fondamentale de diffraction physique empêche l'interrogation de l'anatomie à l'échelle nanométrique et les changements pathologiques subtils lors de l'utilisation d'approches conventionnelles d'imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole simple et peu coûteux, appelé pathologie d'expansion (ExPath), pour l'imagerie optique à l'échelle nanométrique des types communs de spécimens cliniques de tissu primaire, y compris le tissu incorporé de paraffine fixe-congelée ou formalin-fixe (FFPE) Sections. Cette méthode contourne la limite de diffraction optique en transformant chimiquement les échantillons de tissus en hybride tissu-hydrogel et en les élargissant physiquement isotropically à travers de multiples échelles dans l'eau pure. En raison de l'expansion, les molécules précédemment insolubles sont séparées et peuvent donc être observées à l'aide d'un microscope optique conventionnel.
Introduction
L'étude de l'organisation moléculaire des tissus dans un contexte tridimensionnel (3D) peut fournir une nouvelle compréhension des fonctions biologiques et du développement de la maladie. Cependant, ces environnements à l'échelle nanométrique sont au-delà des capacités de résolution des microscopes à diffraction conventionnelle limitée (200 à 300 nm), où la distance minimale résolvable, d est définie par d '/NA. Voici la longueur d'onde de la lumière et NA est l'ouverture numérique (NA) du système d'imagerie. Récemment, la visualisation directe des molécules étiquetées fluorescentes a été rendue possible grâce aux techniques d'imagerie super-résolution nouvellement développées1,2,3, y compris l'épuisement des émissions stimulées (STED), microscopie de localisation photo activée (PALM), microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et microscopie structurée d'éclairage (SIM). Bien que ces techniques d'imagerie aient révolutionné la compréhension de la fonction biologique à l'échelle nanométrique, dans la pratique, elles reposent souvent sur des équipements coûteux et/ou spécialisés et des étapes de traitement d'image, peuvent avoir plus peu de temps d'acquisition que l'imagerie optique conventionnelle, nécessitent des fluorophores ayant des caractéristiques spécifiques (comme la capacité de commutation de photo et/ou une photostabilité élevée). En outre, il reste un défi d'effectuer l'imagerie 3D super-résolution sur des spécimens de tissus.
La microscopie d'expansion (ExM), introduite pour la première fois en 20154, fournit un autre moyen d'imagerie des caractéristiques à l'échelle nanométrique (70 nm) en élargissant physiquement les échantillons conservés incorporés dans un hydrogel polyélectrolyte enflé. Ici, les biomolécules clés et/ou les étiquettes sont ancrées in situ à un réseau de polymères qui peut être isotopiquement étendu après traitement chimique. Parce que l'expansion physique augmente la résolution effective totale, les molécules d'intérêt peuvent alors être résolues en utilisant des systèmes d'imagerie conventionnels à diffraction limitée. Depuis la publication du protocole original, où les étiquettes fluorescentes synthétisées personnalisées ont été ancrées au réseau de polymères4, de nouvelles stratégies ont été utilisées pour ancrer directement les protéines (rétention de protéines ExM, ou proExM)5, 6,7,8,9 et RNA9,10,11,12 à l'hydrogel, et augmenter le grossissement physique par itératif expansion13 ou l'adaptation de la chimie gel8,14,15.
Ici, nous présentons une version adaptée de proExM, appelé pathologie d'expansion (ExPath)16, qui a été optimisé pour les formats de pathologie clinique. Le protocole convertit les échantillons cliniques, y compris les échantillons de paraffine fixe synéral fixe s'est métastatique (FFPE), l'hématoxylin et l'éosine (H-E) tachés, et les échantillons de tissus humains fraîchement congelés montés sur des lames de verre, en un état compatible avec LM. Les protéines sont ensuite ancrées à l'hydrogel et l'homogénéisation mécanique est effectuée (Figure 1)16. Avec une expansion linéaire 4 fois des échantillons, des images multicolores de super-résolution (70 nm) peuvent être obtenues à l'aide d'un microscope confocal conventionnel ayant seulement une résolution de 300 nm et peuvent également être combinés avec d'autres techniques d'imagerie de super-résolution.
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Protocol
1. Préparation des réactifs et des solutions stock
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Préparer les composants de la solution de gélification.
REMARQUE : Les concentrations de solutions sont administrées en g/mL (w/v pour cent).- Faire les solutions de stock suivantes : 38 % (w/v) acrylate de sodium (SA), 50 % (w/v) acrylamide (AA), 2 % (w/v) N,N-N-méthylenebisacrylamide (Bis) et 29,2 % (w/v) chlorure de sodium (NaCl). Dissoudre les composés dans de l'eau doublement déionisée (ddH2O). Utiliser les montants du tableau 1 comme référence; les solutions préparées peuvent être à la hausse ou à la baisse en volume au besoin. Par exemple, pour faire 10 ml d'une solution SA de 38 % (w/v), ajouter 1,9 g SA à un cylindre gradué de 10 ml et ajouter ddH2O à un volume de 5 ml.
- Préparer 9,4 ml de solution monomère à une concentration de 1,06x, comme le montre le tableau 1.
REMARQUE: Cela se traduira par une concentration de 1x après l'ajout de l'initiateur, l'accélérateur et l'inhibiteur. Le stock de monomères peut être stocké à 4 oC pendant une période allant jusqu'à 3 mois, ou à -20 oC pour un stockage à long terme. - Préparer les solutions de stock suivantes séparément en ddH2O: 0,5% (w/v) de l'inhibiteur 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), qui inhibe la gelation pour permettre la diffusion de la solution de gélification dans les tissus, 10% (v/v) de la initiator tetramethylenediamine (TEMED), qui accélère la génération radicale par l'ammonium persulfate (APS), et 10% (w/v) APS qui initie le processus de gélification.
REMARQUE: Les solutions de stock de 4HT et TEMED peuvent être préparées en aliquots de 1 ml et stockées à -20 oC pendant au moins 6 mois. APS a été trouvé à perdre l'efficacité après le stockage à long terme et est mieux préparé en petites quantités (lt;0,1 ml) immédiatement avant le gélification.
- Préparer un tampon de digestion (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5 % [w/v] surfactant nonionic, 0,8 M NaCl) en combinant 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3,03 g de base Tris en 25 mL de ddH2O), 25 mL d'EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g de surfactant nonionique, et 23,38 g de NaCl. Ajouter ddH2O pour un volume total de 500 ml.
REMARQUE: La solution peut être mise à l'échelle vers le haut ou vers le bas au besoin et être stockée à 4 oC. Proteinase K (ProK) sera ajouté immédiatement avant l'étape de digestion. - Préparer une solution de citrate de sodium de 20 mM en combinant 2,941 g de dihydrate tribasic de citrate de sodium avec 500 mL de ddH2O et en ajustant le pH à 8,0 à température ambiante (RT). Échelle du volume de stock au besoin.
- Préparer une solution de stock de 6-(acryloyl)amino)acide hexanoïque, ester succinimidyl (acryloyl-X, SE; AcX), le composé d'ancrage. Dissoudre l'AcX dans 500 oL de sulfoxide de diméthyle anhyus (DMSO) pour une concentration finale de 10 mg/mL.
REMARQUE: La solution peut être stockée dans un environnement desséché à -20 oC dans 20 aliquots ll. - Si vous n'utilisez pas de tampons disponibles dans le commerce pour immunostaining, préparer le tampon de blocage. Utilisez un tampon de blocage de 5 % (v/v) de sérum animal normal et de 0,1 % (w/v) surfactant nonionique dans la saline 1x tamponnée par phosphate (PBS) et sélectionnez le sérum à partir de l'animal hôte des anticorps secondaires. Par exemple, pour préparer un tampon de blocage de 500 ml pour les anticorps élevés dans la chèvre, combiner 25 ml de sérum de chèvre, 0,45 g de surfactant nonionique et 1x PBS à un volume de 500 ml.
2. Préparation de diapositives de tissus cliniques archivées et fraîchement préparées pour ExPath
- Convertissez le tissu en un format compatible ExPath. Choisissez l'une des quatre étapes suivantes (2.1.1-2.1.4) en fonction de la façon dont le spécimen a été préparé : diapositives FFPE, lames de FFPE tachées ou des lames de tissu congelénon non fixes ou fixes dans une solution optimale de température de coupe (OCT).
REMARQUE : Celles-ci sont basées sur des étapes de récupération standard pour les échantillons de pathologie et ne sont pas spécifiques au protocole ExPath.- Échantillons cliniques FFPE
- Préparer 30 ml d'éthanol à 95 %, 70 % d'éthanol et 50 % d'éthanol. Mesurer 30 ml de xylène, 100% d'éthanol et ddH2O.
- Placez la diapositive avec l'échantillon dans un conique de 50 ml à l'aide de forceps et ajoutez 15 ml de xylène. Ponctuez le tube et placez-le horizontalement sur un shaker orbital à environ 60 tr/min et incubez à RT pendant 3 min pour chaque solution. Répéter l'opération avec les 15 ml de xylène restants.
- Répétez l'étape 2.1.1.2 avec 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol, 50% d'éthanol et ddH2O à la place du xylène.
- Glissades permanentes tachées et montées
- Placer la glissière dans un plat Petri de 100 mm et couvrir de xylène. Retirez soigneusement la glissière à l'aide d'une lame de rasoir. Si la glissière de couverture n'est pas facilement enlevée, retournez la glissière au xylène jusqu'à ce que la glissière se desserre.
- Processus à l'aide des étapes pour les échantillons FFPE (étapes 2.1.1-2.1.1.3).
REMARQUE: Dans le cas des lames tachées de H et E, les taches sont éliminées pendant le processus d'expansion.
- Glissades de tissu congelées non fixées dans la solution OCT
- Fixer le tissu dans l'acétone à -20 oC pendant 10 min.
- Laver les échantillons avec 1x solution PBS 3 fois pendant 10 min chacun à RT.
- Diapositives cliniques préalablement fixes et congelées
- Incuber les toboggans pendant 2 min à RT pour faire fondre la solution OCT.
- Laver l'échantillon avec 1x solution PBS 3 fois pendant 5 min chacun à RT.
- Échantillons cliniques FFPE
- Effectuer un traitement thermique pour la récupération d'antigène sur tous les échantillons après la conversion du format.
- Ajouter une solution de citrate de 20 mm (pH 8 à RT) dans un contenant résistant à la chaleur, comme un pot de coloration à glissière.
REMARQUE: Il devrait y avoir assez de solution pour couvrir le tissu monté sur la glissière (50 ml pour un pot de coloration de diapositive standard). - Chauffer la solution de citrate à 100 oC au micro-ondes et placer la lame dans la solution. Transférer immédiatement le récipient dans une chambre d'incubation et incuber à 60 oC pendant 30 min.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les toboggans peuvent être placés dans des plats Petri et recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC.
- Ajouter une solution de citrate de 20 mm (pH 8 à RT) dans un contenant résistant à la chaleur, comme un pot de coloration à glissière.
- Tainer l'échantillon à l'aide de protocoles standard de coloration immunofluorescence (IF)/immunohistochemistry (IHC).
REMARQUE : Les concentrations et les durées spécifiques des anticorps primaires et secondaires dépendent des concentrations suggérées par le fabricant ou de l'optimisation pour l'expérience spécifique.- Utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une limite autour de la section tissulaire (s) sur la diapositive afin de minimiser le volume de solution nécessaire pour couvrir le tissu. Placez la glissière dans un plat assez grand pour s'adapter à la glissière. Pour un toboggan standard de 3 pouces, utilisez un plat Petri de 100 mm.
REMARQUE: Le stylo hydrophobe n'interfère pas avec la polymérisation de l'échantillon ni le processus de digestion. - Incuber le tissu avec un tampon de blocage pendant 1 h à 37 oC, 2 h à RT, ou 4 oC pendant la nuit pour réduire la liaison non spécifique.
- Diluer les anticorps primaires à la concentration désirée dans la quantité appropriée de tampon de blocage préparé (ou tout autre tampon de coloration préféré). Incuber les tissus avec la solution d'anticorps primaire pendant au moins 3 h à RT ou 37 oC, ou pendant la nuit à 4 oC.
REMARQUE: Les échantillons doivent être placés dans un contenant humidifié (comme un plat Petri avec une lingette humide) pour empêcher le tissu de se dessécher. En règle générale, les anticorps ont été dilués à 1:100-1:500 dans 200 à 500 l de tampon, selon la taille des tissus et l'anticorps utilisé. - Laver le tissu avec un tampon de blocage préparé (ou un autre tampon de lavage préféré) 3 fois pendant 10 min à RT.
- Diluer les anticorps secondaires (et 300 nM 4,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] si désiré), dans le tampon de blocage préparé (ou autre tampon de coloration préféré) à une concentration d'environ 10 g/mL. Incuber le tissu dans la solution d'anticorps secondaire pendant au moins 1 h à RT ou 37 oC.
REMARQUE: Le moment peut être ajusté en fonction des anticorps utilisés et de l'épaisseur du tissu. Les anticorps secondaires contenant des colorants à la cyanine (Cy3, Cy5, Alexa 647) ne sont pas compatibles avec le protocole ExM lorsqu'ils sont appliqués avant la polypolymérisation. Les colorants suggérés comprennent Alexa 488 (vert), Alexa 546 (orange/rouge) et Atto 647N ou CF633 (rouge lointain). Le DAPI doit être réappliqué après l'expansion, car il est emporté pendant le processus d'expansion. - Laver le tissu avec un tampon de blocage préparé (ou un autre tampon de lavage préféré) 3 fois pendant 10 min chacun à RT.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les toboggans peuvent être placés dans des plats Petri et recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC. - Effectuez l'imagerie fluorescente à l'aide d'un microscope à large champ conventionnel, d'un microscope confocal ou d'un autre système d'imagerie de choix.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour déterminer la longueur biologique en utilisant le facteur d'expansion en comparant les images avant et après l'expansion. Pour faciliter l'imagerie post-expansion, des régions d'intérêt facilement identifiables devraient être sélectionnées et des images à faible et à haut grossissement devraient être recueillies.
- Utilisez un stylo hydrophobe pour tracer une limite autour de la section tissulaire (s) sur la diapositive afin de minimiser le volume de solution nécessaire pour couvrir le tissu. Placez la glissière dans un plat assez grand pour s'adapter à la glissière. Pour un toboggan standard de 3 pouces, utilisez un plat Petri de 100 mm.
3. Polymérisation in situ des spécimens
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Incuber le spécimen dans une solution d'ancrage.
- Préparer la solution d'ancrage (généralement 250 L est suffisant pour couvrir la section tissulaire) en diluant la solution de stock AcX en 1x PBS à une concentration de 0,03 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixatifs non aldéhyde ou 0,1 mg/mL pour les échantillons fixés avec des fixatifs d'aldéhyde , qui ont moins d'amines gratuites disponibles pour réagir avec AcX.
- Placez la glissière dans un plat Petri de 100 mm et pipette la solution d'ancrage sur le tissu. Incuber pendant au moins 3 h à RT ou toute la nuit à 4 oC.
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Incuber les échantillons dans une solution de gélification.
- Préparer au moins 100 fois le volume excédentaire de la solution de gélification. Pour 200 L, combinez les éléments suivants, dans l'ordre : 188 L de solution monomère, 4 L de 0,5 % 4HT solution de stock (1:50 dilution, concentration finale : 0,01 %), 4 'L de 10 % solution de stock TEMED (1:50 dilution, concentration finale 0,2 %), et 4 'L de 10 % solution d'actions APS (1:50 dilution, concentration finale de 0,2 %.
REMARQUE: La solution de gel doit être faite immédiatement avant utilisation. La solution doit être maintenue à 4 oC et la solution APS doit être ajoutée en dernier, afin d'éviter les gélifications prématurées. - Retirer l'excédent de solution de la section tissulaire et placer la glissière dans un plat Petri de 100 mm. Ajouter une solution de gélification fraîche et froide à l'échantillon et incuber le mélange sur le tissu pendant 30 min à 4 oC, afin de permettre la diffusion de la solution dans le tissu.
- Préparer au moins 100 fois le volume excédentaire de la solution de gélification. Pour 200 L, combinez les éléments suivants, dans l'ordre : 188 L de solution monomère, 4 L de 0,5 % 4HT solution de stock (1:50 dilution, concentration finale : 0,01 %), 4 'L de 10 % solution de stock TEMED (1:50 dilution, concentration finale 0,2 %), et 4 'L de 10 % solution d'actions APS (1:50 dilution, concentration finale de 0,2 %.
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Construire une chambre sur la diapositive autour de l'échantillon(figure 2A) sans déranger la solution de gélification.
- Faire des espaces pour la chambre de gélification en coupant finement des morceaux de verre de couverture à l'aide d'un couteau en diamant.
REMARQUE: Pour faciliter l'imagerie après l'expansion, les espaceurs doivent être proches de l'épaisseur du spécimen de tissu pour réduire la quantité de gel blanc au-dessus du tissu. Le verre numéro 1.5 peut être utilisé pour des échantillons cliniques standard (5 à 10 m). Les morceaux de verre de couverture peuvent être empilés pour des échantillons plus épais. - Fixer les espaceurs de chaque côté du tissu à l'aide de gouttelettes d'eau (10 l).
- Placez soigneusement un couvercle en verre de couverture au-dessus de la glissière, en veillant à éviter de piéger les bulles d'air sur le tissu (Figure 2B).
- Faire des espaces pour la chambre de gélification en coupant finement des morceaux de verre de couverture à l'aide d'un couteau en diamant.
- Incuber l'échantillon à 37 oC dans un environnement humidifié (comme un plat Petri fermé avec une lingette humide) pendant 2 h.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. La chambre de diapositive peut être stockée à l'intérieur d'un plat Petri scellé à 4 oC.
4. Digestion d'échantillon
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Retirez le couvercle de la chambre de gélification en glissant doucement une lame de rasoir sous la glissière et en soulevant lentement la glissière de la surface du gel. Couper le gel blanc autour du tissu pour minimiser le volume. Couper le gel de façon asymétrique pour suivre l'orientation du gel après homogénéisation, puisque l'échantillon deviendra transparent.
- Diluer ProK par 1:200 dans le tampon de digestion (concentration finale 4 U/mL) avant utilisation. Préparer une solution suffisante pour immerger complètement le gel; un seul puits d'une plaque de culture de cellules en plastique à quatre puits nécessite au moins 3 ml par puits.
- Incuber l'échantillon dans un récipient fermé contenant le tampon de digestion pendant 3 h à 60 oC. Si l'échantillon ne se détache pas de la glissière pendant la digestion, utilisez une lame de rasoir pour enlever délicatement l'échantillon.
REMARQUE: Le spécimen doit être complètement immergé dans un tampon de digestion pour empêcher l'échantillon de se dessécher et placé dans un récipient couvert (petite boîte à glissière, puits en plastique, plat Petri, etc.) qui peut être scellé avec du film.
5. Expansion et imagerie de l'échantillon
- Utilisez un pinceau souple pour transférer le spécimen en 1x PBS dans un récipient compatible avec le système d'imagerie désiré et assez grand pour accueillir le gel entièrement expansé. Assurez-vous que le tissu est placé avec le côté de l'échantillon vers le bas si l'imagerie sur un système inversé ou vers le haut si l'imagerie sur un système droit pour minimiser la distance de l'objectif d'imagerie à l'échantillon. Retourner le gel à l'aide d'un pinceau doux si nécessaire.
REMARQUE: L'éclairage latéral d'une LED peut être utilisé pour les rendre visibles en liquide. Une plaque standard de 6 puits peut accueillir des échantillons dont le diamètre pré-élargi est inférieur à 0,6 cm. Une plaque de puits de fond en verre doit être utilisée pour l'imagerie sur un système inversé. - Laver les échantillons en 1x PBS à RT pendant 10 min. Si désiré, re-tache de l'échantillon avec 300 nM DAPI que le processus de digestion lave la tache DAPI. Enlever PBS et la tache avec 300 nM DAPI dilué en 1x PBS pendant 20 min à RT, suivie d'un lavage de 10 min avec 1x PBS à RT.
REMARQUE: Les échantillons peuvent être recouverts de 1x PBS et stockés à 4 oC avant de passer à l'étape suivante. - Pour élargir les échantillons, remplacer le PBS et laver avec un volume excédentaire de ddH2O (au moins 10 fois le volume de gel final) 3 à 5 fois pendant 10 min chacun, à RT.
REMARQUE: Après le lavage de 3e ou 4e, l'expansion du spécimen devrait commencer à plafonner. Pour le stockage, pour prévenir la croissance bactérienne, le ddH2O peut être complété par 0,002% 0,01% d'azide de sodium (NaN3). Dans ce cas, le facteur d'expansion final est réversiblement réduit de 10%. - Effectuez l'imagerie par fluorescence à l'aide d'un microscope à large champ conventionnel, d'un microscope confocal ou d'un autre système d'imagerie de choix.
REMARQUE: Pour empêcher les gels de dériver, l'excès de liquide peut être retiré du puits. Les gels peuvent également être immobilisés avec une agarose à faible fonte de 1,5 à 2 %. Préparer une agarose à faible fonte de 1,5 à 2 % (w/v) dans l'eau dans un récipient deux fois plus grand que le volume de solution. Chauffer la solution dans un bain d'eau de 40 oC ou au micro-ondes pendant 10 à 20 s pour faire fondre la solution. Pipette l'agarose fondue autour des bords du gel. Après avoir laissé l'agarose durcir à LA RT ou à 4 oC, ajouter de l'eau à l'échantillon pour prévenir la déshydratation.
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Representative Results
Si le protocole a été réalisé avec succès (figure 1), les échantillons apparaîtront comme un gel plat et transparent après homogénéisation mécanique (Figure 3A) et peuvent se dilater par un facteur de 3 à 4,5x dans l'eau (Figure 3B), fournissant une résolution efficace de 70 nm selon le facteur d'expansion final et le système d'imagerie utilisé5,16. La figure 4 montre par exemple des images d'un échantillon de rein FFPE de 5 m d'épaisseur traité à l'aide du protocole ExPath. L'expansion complète des échantillons gélifiés a donné un facteur d'expansion de 4,5x dans l'eau, ce qui donne une résolution efficace de 63 nm lorsqu'il est photographié à l'aide d'un objectif de 0,95 NA. Le tissu a d'abord été pré-traité avec du xylène pour enlever la paraffine et réhydraté (section 2.1.1), suivi de la récupération d'antigène avec le tampon de citrate (section 2.2). Le tissu récupéré a ensuite été taché d'anticorps pour l'alpha-actinine 4 (ACTN4) et la vimentine, ainsi que DAPI pour visualiser l'ADN nucléaire et l'agglutinine de germe de blé (WGA), pour étiqueter les glucides. Le spécimen a ensuite été photographié à l'aide d'un microscope confocal disque tournant (Figure 4A,B,D). Les tissus ont été traités selon le protocole ci-dessus et complètement élargis dans l'eau(figure 4C,E). De même, la figure 5 montre par exemple des images de tissu mammaire normal taché de H et E ( figure5A) qui a été traitée avec du xylène (section 2.1.2) pour enlever le verre de couverture, puis traitée comme un échantillon FFPE (section 2.1.1). Lors de l'homogénéisation, la tache de H et E est éliminée du tissu. Les images post-expansion de l'échantillon taché DAPI obtenue sur un microscope confocal de disque tournant (figure 5B) comparé aux images de pré-expansion indiquent un facteur d'expansion de 5,1, donnant une résolution efficace de 43 nm lorsqu'il est imagené avec une lentille NA 1.15.
Exemple de données pour les tranches de rein congelées non fixées traitées à l'aide du protocole ExPath peuvent être vus dans la figure 6. Le tissu a d'abord été fixé dans l'acétone froide (section 2.1.3) et taché d'ACTN4, de vimentin, de DAPI et de WGA. La comparaison des images de pré-expansion (non montrée) et post-expansion indique un facteur d'expansion de 4,5. Les données de comparaison des échantillons de rein congelés fixés à l'acétone à ceux des échantillons de ffPE (figure 4C,E) montrent qu'il y a une diminution de la qualité de la coloration ACTN4 dans l'échantillon ÉLARGI de FFPE, ce qui peut être dû à une dégradation de l'antigénicité en raison de la méthode de fixation16.
Figure 1 : Schéma du flux de travail de la pathologie d'expansion (ExPath). Le prétraitement des diapositives de tissus archivées cliniquement est d'abord effectué en fonction du format de stockage. Les échantillons sont ensuite tachés à l'aide de protocoles d'immunostaining conventionnels et des images de pré-expansion sont obtenues. Les échantillons sont ensuite traités avec acryloyl-X SE (AcX) pour ancrer les protéines de l'hydrogel. La polymérisation in situ est préformée avant l'homogénéisation mécanique à l'aide de la protéase K (ProK). Les échantillons peuvent ensuite être étendus en ddH2O avant l'imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Chambre de gel pour les échantillons de pathologie. (A) Deux espaceurs, tels que deux morceaux de #1,5 verre de couverture coupés avec un couteau en diamant, sont placés de chaque côté du tissu après avoir incubé l'échantillon dans une solution de gélification à 4 oC. Les espaceurs doivent être plus épais que les tranches de tissu, pour empêcher la compression de l'échantillon. (B) Un couvercle, tel qu'un morceau de verre de couverture #1,5, est utilisé pour couvrir l'échantillon avant l'incubation à 37 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemple d'expansion de l'échantillon. Un échantillon de rein de 5 m d'épaisseur après homogénéisation, (A) pré- et (B) post-expansion dans ddH2O est montré. Les carrés de grille sont de 5 mm x 5 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats représentatifs d'échantillons de rein FFPE d'une épaisseur de 5 m. (A) Image pré-élargie. (B) Image agrandie avant l'expansion de la région d'intérêt décrite dans le panneau A et (C) l'image correspondante post-expansion de la même région d'intérêt après que l'échantillon a été entièrement élargi dans l'eau. (D) Image agrandie de la région d'intérêt décrite dans le panneau B et (E) l'image correspondante post-expansion de la même région d'intérêt après que l'échantillon a été entièrement élargi dans l'eau. La fissuration, les distorsions et la perte de cibles étiquetées peuvent être le résultat d'un ancrage et/ou d'une homogénéisation inadéquats (F,G). Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal disque tournant avec un objectif 20x (NA 0,95; immersion de l'eau) (A-E,G) ou 10x (NA 0,5) objectif (F). Bleu, DAPI; vert, vimentin; rouge, alpha-actinine 4 (ACTN4); magenta, WGA. Les barres d'échelle de 100 m(A,F,G, barres à échelle jaune indiquent des images post-expansion); 50 m (B), 50 m (C, taille physique après l'expansion du poste 225 m; facteur d'expansion 4,5); 25 m (D); 25 m(E, taille physique après l'expansion 112,5 m; facteur d'expansion 4,5). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Résultats représentatifs du tissu mammaire normal taché par h et E. (A) Image Brightfield de tissus tachés de H et E pré-expansés pris avec un objectif 40x (0,95 NA). (B) Image DAPI post-expansion de la même région d'intérêt après que l'échantillon a été entièrement élargi dans l'eau. L'image a été obtenue sur un microscope confocal de disque tournant utilisant un objectif 40x (NA 1.15 ; immersion d'eau). Barres d'échelle de 10 m(A, la barre d'échelle jaune indique les images post-expansion) et 2 m(B, taille physique après l'expansion 50,1 'm; facteur d'expansion 5.1). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Résultats représentatifs d'échantillons de rein congelés frais après expansion, obtenus sur un microscope confocal de disque tournant avec un objectif 40x (NA 1.15 ; immersion d'eau). Bleu et vimentin; vert et alpha-actinine 4 (ACTN4); rouge et collagène IV; gris et DAPI. Barre d'échelle de 10 m (expansion du poste de taille physique 45 m; facteur d'expansion 4,5). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| composant | Concentration des stocks | Volume de stock (mL) | Concentration finale | Montant final par 10 ml |
| Acrylate de sodium | 0,380 g/mL | 2.25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Acrylamide | 0,500 g/mL | 0.50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N,N--Methylenebisacrylamide | 0,020 g/mL | 0.50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| chlorure | 0,292 g/mL | 4.00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x 10x | 1.00 | 1x 1x | 1x 1x |
| eau | 1.15 | |||
| Volume total | 9.40 |
Tableau 1 : Composants de la solution monomère. Toutes les concentrations sont données en termes de g/mL (w/v) à l'exception du PBS.
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Discussion
Ici, nous présentons le protocole ExPath16, une variante de proExM5 qui peut être appliquée aux types les plus communs d'échantillons de biopsie clinique utilisés en pathologie, y compris FFPE, H et E souillés, et des spécimens fraîchement congelés sur des lames de verre. La conversion de format, la récupération d'antigène, et l'immunostaining des spécimens suivent les protocoles couramment utilisés qui ne sont pas spécifiques à ExPath. Contrairement au protocole proExM d'origine9, ExPath s'appuie sur une concentration plus élevée d'EDTA dans le tampon de digestion, ce qui améliore l'expansion des tissus fixes en formaline, comme l'a démontré l'étude originale ExPath16. Le protocole a été validé dans des échantillons cliniques de 5 à 10 m d'épaisseur16,mais pourrait également être appliqué à des échantillons de tissus plus épais avec une certaine modification. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont : 1) le moment des étapes de gel; 2) mise en place de la chambre de gel; 3) paramètres pour l'homogénéisation de l'échantillon; et 4) la manipulation du gel.
Le paramètre le plus critique pour ce protocole est le moment des étapes de gel. Si la solution de gélification polymérise prématurément, l'échantillon ne sera pas suffisamment ancré à la matrice de gel. Un ancrage inadéquat et une gélification prématurée peuvent causer des distorsions, limiter l'expansion et entraîner la perte de molécules cibles(figure 4F,G). L'initiation de la gélification dépend de la température, il est donc important de maintenir la solution de gélification mixte à 4 oC avant de la placer sur le spécimen cible. L'initiateur, APS, doit être fraîchement préparé et ajouté immédiatement avant d'appliquer la solution de gélification. L'APS n'est pas stable à RT et peut perdre de l'efficacité après avoir subi des cycles de gel-dégel. Un ancrage insuffisant peut également être le résultat d'une réactivité réduite du composé d'ancrage, AcX, qui peut perdre de l'activité après un stockage à long terme ou après le contact avec l'eau. AcX a été trouvé pour maintenir l'activité après 6 mois de stockage dans un environnement desséché à -20 oC. Si la gélation prématurée n'est pas la cause présumée de distorsion, une nouvelle solution de stock d'AcX peut être préparée.
Pendant la configuration de la chambre de gelation, les bulles d'air peuvent être emprisonnées sous le couvercle en verre de couverture. Si ces bulles sont au-dessus ou touchent directement l'échantillon, elles peuvent causer des distorsions. Ils peuvent être déplacés loin du spécimen en ajoutant plus de solution de gélification par le côté de la chambre. Pour aider à prévenir les bulles d'air, une petite goutte de solution de gélification peut être déposée sur le couvercle avant de le placer sur le tissu.
La digestion des échantillons dépend du temps, de la température, ainsi que des propriétés tissulaires, comme l'épaisseur et le type de tissu. Une digestion inadéquate peut également causer des distorsions et entraîner un facteur d'expansion plus faible que prévu. Si une digestion incomplète est soupçonnée, le temps de digestion et/ou la concentration de ProK peuvent être augmentés, en particulier dans le cas des tissus plus épais. ProK peut également perdre de l'activité au fil du temps. Pour préserver son activité, ProK doit être stocké à -20 oC et peut être aliquoted en plus petits volumes pour éviter les cycles de dégel libre.
Il faut faire attention lors de la manipulation d'échantillons homogénéisés, en particulier lorsqu'ils sont complètement élargis. Si le spécimen est difficile à localiser lorsqu'il est immergé dans du liquide, illuminant le récipient sous différents angles peut disperser la lumière incidente pour permettre la visualisation du gel. Les gels entièrement expansés sont fragiles et peuvent se briser pendant la manipulation. L'utilisation de brosses molles et de spatules en plastique est recommandée pour transférer les gels expansés.
Le protocole ExPath offre une alternative rentable aux techniques actuelles d'imagerie par super résolution et de microscopie électronique pour interroger les structures à l'échelle nanométrique dans des échantillons de biopsie clinique. Bien que ProK fournit même l'expansion de l'échantillon après l'homogénéisation, la perte de protéines empêche l'interrogatoire d'autres cibles d'intérêt après l'expansion. Cependant, le protocole peut être facilement exécuté dans n'importe quel laboratoire humide régulier. Plus important encore, l'imagerie des dispositifs à l'échelle nanométrique peut être réalisée sur des microscopes conventionnels à large champ ou confocals que l'on trouve couramment dans les laboratoires de biologie et les installations de base d'imagerie.
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Disclosures
YZ et OB sont deux des inventeurs qui ont demandé et obtenu une protection par brevet sur un sous-ensemble des technologies décrites ici (brevets américains US20190064037A1, WO2018157074A1 et WO2018157048A1).
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage de la Faculté de l'Université Carnegie Mellon (YZ) et le prix du directeur des NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 à YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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