Summary
L'imaging su nanoscala di campioni di tessuto clinico può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. La patologia di espansione (ExPath) è una versione di microscopia di espansione (ExM), modificata per la compatibilità con campioni di tessuto clinico standard, per esplorare la configurazione su nanoscala delle biomolecole utilizzando microscopi tradizionali a diffrazione limitata.
Abstract
Nella moderna patologia, la microscopia ottica svolge un ruolo importante nella diagnosi della malattia rivelando strutture microscopiche di campioni clinici. Tuttavia, il limite fondamentale di diffrazione fisica impedisce l'interrogatorio dell'anatomia su nanoscala e dei sottili cambiamenti patologici quando si utilizzano approcci di imaging ottico convenzionali. Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico, chiamato patologia di espansione (ExPath), per l'imaging ottico su nanoscala di tipi comuni di campioni di tessuto primario clinico, inclusi sia tessuto incorporato di paraffina fissa-congelato o formalina (FFPE) Sezioni. Questo metodo aggira il limite di diffrazione ottica trasformando chimicamente i campioni di tessuto in ibrido di idrogel tissutale e espandendoli fisicamente isoquinamente su più scale in acqua pura. A causa dell'espansione, le molecole precedentemente irrisolvibili sono separate e quindi possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico convenzionale.
Introduction
Lo studio dell'organizzazione molecolare dei tessuti in un contesto tridimensionale (3D) può fornire una nuova comprensione delle funzioni biologiche e dello sviluppo della malattia. Tuttavia, questi ambienti su nanoscala sono al di là delle capacità di risoluzione dei microscopi tradizionali a diffrazione limitata (200-300 nm), dove la distanza minima risolvibile, d è definita da d / /NA. Qui è la lunghezza d'onda della luce e NA è l'apertura numerica (NA) del sistema di imaging. Recentemente, la visualizzazione diretta delle molecole fluorescenti etichettate è stata resa possibile dalle tecniche di imaging a super-risoluzione di recente sviluppo1,2,3, compreso l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED), microscopia di localizzazione ad attivazione fotofoto (PALM), microscopia da ricostruzione ottica stocastica (STORM) e microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). Sebbene queste tecniche di imaging abbiano rivoluzionato la comprensione della funzione biologica su scala nanometrica, in pratica, spesso si basano su apparecchiature costose e/o specializzate e fasi di elaborazione delle immagini, possono avere tempi di acquisizione più lenti rispetto a l'imaging ottico convenzionale, richiedono fluorofori con caratteristiche specifiche (come la capacità di commutazione fotografica e/o l'elevata fotostabilità). Inoltre, rimane una sfida eseguire l'imaging 3D a super-risoluzione su campioni di tessuto.
La microscopia di espansione (ExM), introdotta per la prima volta nel 20154,fornisce un mezzo alternativo di imaging di funzionalità su nanoscala (<70 nm) espandendo fisicamente campioni conservati incorporati in un idrogel polielettrolitico gonfiabile. Qui, le biomolecole e/o le etichette chiave sono ancorate in situ a una rete polimerica che può essere espansa isotopicamente dopo l'elaborazione chimica. Poiché l'espansione fisica aumenta la risoluzione effettiva totale, le molecole di interesse possono essere risolte utilizzando sistemi di imaging convenzionali con diffrazione limitata. Dalla pubblicazione del protocollo originale, in cui le etichette fluorescenti sintetizzate personalizzate erano ancorate alla rete polimerica4, sono state utilizzate nuove strategie per ancorare direttamente le proteine (Protein retention ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 e RNA9,10,11,12 all'idrogel, e aumentare l'ingrandimento fisico attraverso iterativo espansione13 o adattando la chimica del gel8,14,15.
Qui presentiamo una versione adattata di proExM, chiamata patologia di espansione (ExPath)16, che è stata ottimizzata per i formati di patologia clinica. Il protocollo converte campioni clinici, tra cui campioni di tessuto umano fissati in formalina (FFPE), ematossialina ed eosina (H&E) macchiati e campioni di tessuto umano appena congelati montati su vetrini di vetro, in uno stato compatibile con ExM. Le proteine sono poi ancorate all'idrogel e viene eseguita l'omogeneizzazione meccanica (Figura 1)16. Con un'espansione lineare di 4 volte dei campioni, le immagini a super-risoluzione multicolore (70 nm) possono essere ottenute utilizzando un microscopio confocale convenzionale con una risoluzione di soli 300 nm e possono anche essere combinate con altre tecniche di imaging a super-risoluzione.
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Protocol
1. Preparazione di reagenti e soluzioni di magazzino
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Preparare i componenti della soluzione di gelling.
NOTA: le concentrazioni di soluzione sono indicate in g/mL (percentuale w/v).- Effettuare le seguenti soluzioni di stock: 38% (w/v) acrilato di sodio (SA), 50% (w/v) acrilammide (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), e 29.2% (w/v) cloruro di sodio (NaCl). Sciogliere i composti in acqua doppiamente deionizzata (ddH2O). Utilizzare gli importi della tabella 1 come riferimento; soluzioni preparate possono essere scalate verso l'alto o verso il basso in volume in base alle esigenze. Ad esempio, per creare 10 mL di una soluzione SA del 38% (w/v), aggiungere 1,9 g di SA a un cilindro graduato da 10 mL e aggiungere ddH2O a un volume di 5 mL.
- Preparare 9,4 mL di soluzione monomera ad una concentrazione di 1,06x, come illustrato nella tabella 1.
NOT: Questo si tradurrà in una concentrazione 1x dopo l'aggiunta dell'initiator, acceleratore, e inibitore. Lo stock di monomeri è conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi, o a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. - Preparare le seguenti soluzioni azionarie separatamente in ddH2O: 0.5% (w/v) dell'inibitore 4-idrossi-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), che inibisce la gelazione per consentire la diffusione della soluzione di gelling nei tessuti, il 10% (v/v) del tetrametileleneamina (TEMED), che accelera la generazione radicale di persulfato di ammonio (APS) e del 10% (w/v) Che avvia il processo di gelling.
NOT: Le soluzioni stock di 4HT e TEMED possono essere preparate in aliquote da 1 mL e conservate a -20 gradi centigradi per almeno 6 mesi. APS è stato trovato per perdere efficacia dopo l'immagazzinamento a lungo termine ed è meglio preparato in piccole quantità (<0.1 mL) immediatamente prima di gelling.
- Preparare il buffer di digestione (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] surfactant nonionic, 0.8 M NaCl) combinando 25 mL di 1 M Tris pH 8 (3,03 g di base Tris in 25 mL di ddH2O), 25 mL di EDTA (0,5 MH) , 2,25 g di surfactant nonionico e 23,38 g di NaCl. Aggiungere ddH2O per un volume totale di 500 mL.
NOT: La soluzione può essere scalata verso l'alto o verso il basso in base alle esigenze ed essere immagazzinata a 4 gradi centigradi. Proteinase K (ProK) verrà aggiunto immediatamente prima della fase di digestione. - Preparare la soluzione di citrato di 20 mM di sodio combinando 2,941 g di citrato di sodio tribasic diidratare con 500 mL di ddH2O e regolando il pH a 8,0 a temperatura ambiente (RT). Ridimensionare il volume delle scorte in base alle esigenze.
- Preparare una soluzione stock di 6-((acriloil)amino)aminoano)acido exanoico, succinimidyl ester (acriloil-X, SE; AcX), il composto di ancoraggio. Sciogliere l'AcX in 500 o l di anidride anica solforo dimetilo (DMSO) per una concentrazione finale di 10 mg/mL.
NOT: La soluzione può essere conservata in un ambiente desiccato a -20 gradi centigradi in 20 - aliquote. - Se non si utilizzano buffer disponibili in commercio per l'immunostaining, preparare il buffer di blocco. Utilizzare un buffer di blocco del 5% (v/v) siero animale normale e dello 0,1% (w/v) surfactant nonionico in 1x salina con buffer fosfato (PBS) e selezionare il siero in base all'animale ospite degli anticorpi secondari. Ad esempio, per preparare 500 mL di blocco buffer per gli anticorpi sollevati nella capra, combinare 25 mL di siero di capra, 0,45 g di surfactant nonionico e 1x PBS a un volume di 500 mL.
2. Preparazione di diapositive di tessuto clinico archiviate e appena preparate per ExPath
- Convertire il tessuto in un formato compatibile con ExPath. Scegliere uno dei quattro passaggi seguenti (2.1.1.2.1.4) in base alla modalità di preparazione del campione: diapositive FFPE, vetrini FFPE macchiati o vetrini di tessuto congelati non fissi o fissi in soluzione ottimale per la temperatura di taglio (OCT).
NOTA: questi sono basati su passaggi di ripristino standard per i campioni di patologia e non sono specifici del protocollo ExPath.- Campioni clinici FFPE
- Preparare 30 mL di 95% etanolo, 70% etanolo e 50% di etanolo. Misurare 30 mL di xilene, 100% etanolo e ddH2O.
- Posizionare la diapositiva con il campione in un conicale di 50 mL con forcep e aggiungere 15 mL di xilene. Far quadrare il tubo e posizionarlo orizzontalmente su uno shaker orbitale a circa 60 giri e incubare a RT per 3 min per ogni soluzione. Ripetere con gli altri 15 mL di xilene.
- Ripetere il passaggio 2.1.1.2 con 100% di etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, 50% etanolo e ddH2O al posto dello xilene.
- Scivoli permanenti macchiati e montati
- Mettere il vetrino in un piatto Petri da 100 mm e coprire con lo xilene. Rimuovere con cura il coperchio con una lama da rasoio. Se il coperchio non è facilmente rimosso, riportare la diapositiva allo xilene fino a quando il coperchio si allenta.
- Elaborare utilizzando i passaggi per gli esempi FFPE (passaggi 2.1.1.1.1.1.1.3).
NOT: Nel caso di vetrini macchiati H&E, le macchie vengono eliminate durante il processo di espansione.
- Diapositive di tessuto congelato non fissi nella soluzione OCT
- Fissare il tessuto in acetone a -20 gradi centigradi per 10 min.
- Lavare i campioni con la soluzione 1x PBS 3 volte per 10 min ciascuno a RT.
- Precedentemente fissati, vetrini di tessuto clinico congelati
- Incubare i vetrini per 2 min a RT per fondere la soluzione OCT.
- Lavare il campione con la soluzione 1x PBS 3 volte per 5 min ciascuno a RT.
- Campioni clinici FFPE
- Eseguire il trattamento termico per il recupero dell'antigene su tutti i campioni dopo la conversione del formato.
- Aggiungere una soluzione di citrato da 20 mM (pH 8 a RT) in un contenitore resistente al calore, ad esempio un barattolo di colorazione.
NOT: Ci dovrebbe essere abbastanza soluzione per coprire il tessuto montato sul vetrino (50 mL per un barattolo di colorazione di scivolo standard). - Riscaldare la soluzione del citrato a 100 gradi centigradi nel microonde e posizionare il vetrino nella soluzione. Trasferire immediatamente il contenitore in una camera di incubazione e incubare a 60 gradi centigradi per 30 min.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I vetrini possono essere collocati in piatti Petri e coperti in 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere una soluzione di citrato da 20 mM (pH 8 a RT) in un contenitore resistente al calore, ad esempio un barattolo di colorazione.
- Macchiare il campione utilizzando protocolli standard di colorazione immunofluorescenza (IF)/immunohistochimica (IHC).
NOTA: le concentrazioni specifiche di anticorpi primari e secondari e le durate delle macchie dipendono dalle concentrazioni suggerite dal produttore o dall'ottimizzazione per l'esperimento specifico.- Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un contorno intorno alle sezioni di tessuto sulla diapositiva per ridurre al minimo il volume della soluzione necessaria per coprire il tessuto. Posizionare il vetrino in un piatto abbastanza grande da adattarlo. Per uno scivolo standard da 3 pollici, utilizzare un piatto Petri da 100 mm.
NOT: La penna idrofobica non interferisce con la polimerizzazione del campione né con il processo di digestione. - Incubare il tessuto con un buffer di bloccaggio per 1 h a 37 , 2 h a RT o 4 gradi durante la notte per ridurre il legame non specifico.
- Diluire gli anticorpi primari alla concentrazione desiderata nella quantità appropriata di tampone di blocco preparato (o altro buffer di colorazione preferito). Incubare i tessuti con la soluzione anticorpale primaria per almeno 3 h a RT o 37 gradi centigradi, o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi.
NOT: I campioni devono essere collocati in un contenitore umidificato (come un piatto Petri con una salvietta umida) per evitare che il tessuto si secchi. Tipicamente, gli anticorpi sono stati diluiti a 1:100-1:500 in 200'500 - L di tampone, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell'anticorpo utilizzato. - Lavare il tessuto con tampone di bloccaggio preparato (o altro buffer di lavaggio preferito) 3 volte per 10 min a RT.
- Diluire gli anticorpi secondari (e 300 nM 4,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] se lo si desidera), in buffer di blocco preparato (o altro buffer di colorazione preferito) ad una concentrazione di circa 10g/mL. Incubare il tessuto nella soluzione anticorpale secondaria per almeno 1 h a RT o 37 gradi centigradi.
NOT: La tempistica può essere regolata a seconda degli anticorpi utilizzati e dello spessore del tessuto. Gli anticorpi secondari contenenti coloranti cianini (Cy3, Cy5, Alexa 647) non sono compatibili con il protocollo ExM quando applicati pre-polimerizzazione. I coloranti suggeriti includono Alexa 488 (verde), Alexa 546 (arancione/rosso) e Atto 647N o CF633 (in rosso). DAPI deve essere riapplicato dopo l'espansione, in quanto viene lavato via durante il processo di espansione. - Lavare il tessuto con tampone di bloccaggio preparato (o altro buffer di lavaggio preferito) 3 volte per 10 min ciascuno a RT.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I vetrini possono essere collocati in piatti Petri e coperti in 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi. - Eseguire l'imaging fluorescente utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging di scelta.
NOT: Questo passaggio è necessario per determinare la lunghezza biologica utilizzando il fattore di espansione confrontando le immagini pre e post-espansione. Per facilitare l'imaging post-espansione, è necessario selezionare le regioni di interesse facilmente identificabili e raccogliere immagini con ingrandimento basso e alto.
- Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un contorno intorno alle sezioni di tessuto sulla diapositiva per ridurre al minimo il volume della soluzione necessaria per coprire il tessuto. Posizionare il vetrino in un piatto abbastanza grande da adattarlo. Per uno scivolo standard da 3 pollici, utilizzare un piatto Petri da 100 mm.
3. In Situ polimerizzazione degli esemplari
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Incubare il campione nella soluzione di ancoraggio.
- Preparare la soluzione di ancoraggio (in genere 250 l è sufficiente a coprire la sezione del tessuto) diluindo la soluzione stock AcX in 1x PBS a una concentrazione di 0,03 mg/mL per campioni fissati con fissati non all'aldeide o 0,1 mg/mL per i campioni fissati con fissati all'aldeide , che hanno meno ammine libere disponibili per reagire con AcX.
- Collocare il vetrino in un piatto Petri da 100 mm e pipettare la soluzione di ancoraggio sul tessuto. Incubare per almeno 3 h a RT o peruna pernottamento a 4 gradi centigradi.
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Incubare i campioni in soluzione di gelling.
- Preparare almeno 100 volte il volume in eccesso di soluzione di gelling. In base al valore di 200, combinare le seguenti opzioni, nell'ordine: 188 l di soluzione monomera, 4 unità di stock 4HT dello 0,5% (1:50 di diluizione, concentrazione finale: 0,01%), 4 L del 10% di soluzione stock TEMED (1:50 di diluizione, concentrazione finale 0,2%) e 4 unità di diluizione, concentrazione finale 0,2%).
NOT: Soluzione gelling deve essere fatta immediatamente prima dell'uso. La soluzione deve essere mantenuta a 4 gradi centigradi e la soluzione APS deve essere aggiunta per ultima, per evitare gelling prematuro. - Rimuovere la soluzione in eccesso dalla sezione del tessuto e posizionare il vetrino in una piastra di Petri da 100 mm. Aggiungere una soluzione gellona fresca e fredda al campione e incubare la miscela sul tessuto per 30 min a 4 gradi centigradi, per consentire la diffusione della soluzione nel tessuto.
- Preparare almeno 100 volte il volume in eccesso di soluzione di gelling. In base al valore di 200, combinare le seguenti opzioni, nell'ordine: 188 l di soluzione monomera, 4 unità di stock 4HT dello 0,5% (1:50 di diluizione, concentrazione finale: 0,01%), 4 L del 10% di soluzione stock TEMED (1:50 di diluizione, concentrazione finale 0,2%) e 4 unità di diluizione, concentrazione finale 0,2%).
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Costruire una camera sulla diapositiva intorno al campione (Figura 2A) senza disturbare la soluzione gelling.
- Crea distanziali per la camera gelling tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello di a diamante.
NOT: Per facilitare l'imaging dopo l'espansione, i distanziali devono essere vicini allo spessore del campione di tessuto per ridurre la quantità di gel bianco sopra il tessuto. Il vetro numero 1,5 può essere utilizzato per campioni clinici standard (5-10 m). I pezzi di vetro di copertura possono essere impilati per campioni più spessi. - Fissare i distanziali su entrambi i lati del tessuto utilizzando goccioline d'acqua (10 dollari l).
- Posizionare con cura un coperchio di vetro di copertura sopra il vetrino, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria sul tessuto (Figura 2B).
- Crea distanziali per la camera gelling tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello di a diamante.
- Incubare il campione a 37 gradi centigradi in un ambiente umidificato (come un piatto Petri chiuso con una salvietta umida) per 2 h.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. La camera di scorrimento può essere conservata all'interno di una piastra Petri sigillata a 4 gradi centigradi.
4. Digestione del campione
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Rimuovere il coperchio della camera gelling facendo scorrere delicatamente una lama di rasoio sotto il coperchio e sollevando lentamente il coperchio dalla superficie del gel. Tagliare il gel bianco intorno al tessuto per ridurre al minimo il volume. Tagliare il gel in modo asimmetrico per monitorare l'orientamento del gel dopo l'omogeneizzazione, poiché il campione diventerà trasparente.
- Diluire ProK di 1:200 nel buffer di digestione (concentrazione finale 4 U/mL) prima dell'uso. Preparare abbastanza soluzione per sommergere completamente il gel; un singolo pozzo di una piastra di coltura di cellule plastiche a quattro pozzetti richiede almeno 3 mL per pozzo.
- Incubare il campione in un contenitore chiuso contenente il buffer di digestione per 3 h a 60 gradi centigradi. Se il campione non si stacca dal vetrino durante la digestione, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere delicatamente il campione.
NOT: Il campione deve essere completamente immerso nel tampone di digestione per evitare che il campione si secchi e posto in un contenitore coperto (piccola scatola di scorrimento, pozzo di plastica, piatto Petri, ecc.) che può essere sigillato con pellicola.
5. Esempio di espansione e imaging
- Utilizzare un pennello morbido per trasferire il campione in 1x PBS in un contenitore compatibile con il sistema di imaging desiderato e abbastanza grande da ospitare il gel completamente espanso. Assicurarsi che il tessuto sia posizionato con il campione verso il basso se l'imaging su un sistema invertito o verso l'alto se l'imaging su un sistema verticale per ridurre al minimo la distanza dall'obiettivo di imaging al campione. Capovolgere il gel con un pennello morbido, se necessario.
NOT: L'illuminazione laterale da un LED può essere utilizzata per renderli visibili in liquido. Una piastra standard a 6 pozzetto può ospitare campioni con un diametro pre-espanso inferiore a 0,6 cm. Una piastra inferiore in vetro deve essere utilizzata per l'imaging su un sistema invertito. - Lavare i campioni in 1x PBS a RT per 10 min. Se lo si desidera, macchiare nuovamente il campione con 300 nM DAPI come il processo di digestione lava via la macchia DAPI. Rimuovere PBS e colorazione con 300 nM DAPI diluito in 1x PBS per 20 min a RT, seguito da un lavaggio di 10 min con 1x PBS a RT.
NOT: I campioni possono essere coperti con 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi prima di procedere alla fase successiva. - Per espandere i campioni, sostituire il PBS e lavare con un volume in eccesso di ddH2O (almeno 10 volte il volume finale del gel) 3-5 volte per 10 min ciascuno, a RT.
NOT: Dopo illavaggio 3 rd o 4th, l'espansione del campione dovrebbe iniziare ad plateau. Per lo stoccaggio, per prevenire la crescita batterica, il ddH2O può essere integrato con 0.002% azide di sodio (NaN3). In questo caso, il fattore di espansione finale viene ridotto reversibilmente del 10%. - Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging di scelta.
NOT: Per evitare che i gel si allassino, il liquido in eccesso può essere rimosso dal pozzo. I gel possono anche essere immobilizzati con agarose a bassa fusione dell'1,5%. Preparare in acqua l'agarose a bassa fusione in acqua in un contenitore di 2 x 4 volte il volume della soluzione. Scaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 40 gradi centigradi o in un forno a microonde per 10/20 s per sciogliere la soluzione. Pipette l'agarose fuso intorno ai bordi del gel. Dopo aver lasciato che l'agarose si indurisse a RT o 4 gradi centigradi, aggiungere acqua al campione per prevenire la disidratazione.
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Representative Results
Se il protocollo è stato eseguito con successo (Figura 1), i campioni appariranno come gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica (Figura 3A) e potranno espandersi di un fattore di 3-4,5x in acqua (Figura 3B), fornendo una risoluzione efficace di 70 nm a seconda del fattore di espansione finale e del sistema di imaging utilizzato5,16. Nella figura 4 sono illustrate immagini di esempio di un campione di rene FFPE di spessore di 5 m elaborato utilizzando il protocollo ExPath. La completa espansione dei campioni geliati ha portato a un fattore di espansione 4,5x in acqua, dando una risoluzione efficace di 63 nm quando viene immaginato utilizzando un obiettivo di 0,95 NA. Il tessuto è stato prima pre-elaborato con xilene per rimuovere la paraffina e reidratato (sezione 2.1.1), seguito dal recupero dell'antigene con il tampone di citrati (sezione 2.2). Il tessuto recuperato è stato poi macchiato con anticorpi per alfa-actinina 4 (ACTN4) e vimentina, insieme a DAPI per visualizzare il DNA nucleare e l'agglutinina del germo di grano (WGA), per etichettare i carboidrati. L'esemplare è stato poi immaginato utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Figura 4A,B,D). I tessuti sono stati trattati seguendo il protocollo di cui sopra e completamente ampliati in acqua (Figura 4C,E). Analogamente, la figura 5 mostra immagini di esempio del tessuto mammario normale macchiato H&E (Figura 5A) trattate con xilene (sezione 1.2) per rimuovere il vetro di copertura e quindi trattate come un campione FFPE (sezione 2.1.1). Durante l'omogeneizzazione, la macchia H&E viene eliminata dal tessuto. Le immagini post-espansione del campione colorato DAPI ottenuto su un microscopio confocale a disco rotante (Figura 5B) rispetto alle immagini pre-espansione indicano un fattore di espansione di 5.1, offrendo una risoluzione effettiva di 43 nm quando viene visualizzata una una lente NA 1.15.
I dati di esempio per le sezioni di rene congelate non fissate elaborate utilizzando il protocollo ExPath sono visibili nella Figura 6. Il tessuto è stato prima fissato in acetone freddo (sezione 2.1.3) e macchiato con ACTN4, vimentina, DAPI e WGA. Il confronto tra le immagini di pre-espansione (non mostrate) e post-espansione indicano un fattore di espansione di 4,5. I dati di confronto dei campioni di rene congelati fissati con l'acetone a quelli dei campioni FFPE (Figura 4C,E) mostrano che vi è una diminuzione della qualità della colorazione ACTN4 nel campione FFPE espanso, che può essere dovuta a una degradazione dell'antigenicità grazie al metodo di fissazione16.
Figura 1: Schematico del flusso di lavoro di patologia di espansione (ExPath). La pre-elaborazione dei vetrini di tessuto archiviati clinicamente viene eseguita per la prima volta in base al formato di archiviazione. I campioni vengono poi macchiati utilizzando protocolli di immunostaining convenzionali e si ottengono immagini di pre-espansione. I campioni vengono poi trattati con acriloil-X SE (AcX) per ancorare le proteine all'idrogel. La polimerizzazione in situ è preformata prima dell'omogeneizzazione meccanica utilizzando la proteinasi K (ProK). I campioni possono quindi essere espansi in ddH2O prima dell'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Camera di Gelation per campioni di patologia. (A) Due distanziali, come due pezzi di vetro di copertura #1,5 tagliati con un coltello di diamante, sono collocati su entrambi i lati del tessuto dopo aver incubato il campione in soluzione gelling a 4 gradi centigradi. I distanziali devono essere più spessi delle fette di tessuto, per evitare la compressione del campione. (B) Un coperchio, come un pezzo di vetro di copertura #1,5, viene utilizzato per coprire il campione prima dell'incubazione a 37 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di espansione del campione. Viene mostrato un campione di rene spesso 5 m dopo l'omogeneizzazione, (A) prima e(B)post-espansione in ddH2O. I quadrati della griglia sono 5 mm x 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi di campioni di rene FFPE di 5 m di spessore. (A) Immagine preespansa. (B) Immagine di pre-espansione ingrandita della regione delineata di interesse nel pannello A e (C) l'immagine post-espansione corrispondente della stessa regione di interesse dopo che il campione è stato completamente ampliato in acqua. (D) Immagine ingrandita della regione delineata di interesse nel pannello B e (E) l'immagine post-espansione corrispondente della stessa regione di interesse dopo che il campione è stato completamente ampliato in acqua. Cracking, distorsioni e perdita di bersagli etichettati possono essere il risultato di un'ancoraggio e/o un'omogeneizzazione inadeguate (F,G). Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con un obiettivo 20x (NA 0.95; immersione dell'acqua) (A-E,G) o 10x (NA 0.5) obiettivo (F). Blu, DAPI; verde, vimentina; rosso, alfa-actinina 4 (ACTN4); magenta, WGA. Barre di scala: 100 m (A, F, G, barre in scala gialle indicano immagini post-espansione); 50 m (B), 50 m (C, dimensione fisica dopo l'espansione 225 m; fattore di espansione 4,5); 25 m (D); 25 m (E, dimensione fisica dopo l'espansione 112,5 m; fattore di espansione 4,5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi di H&E macchiato tessuto mammario normale. (A) Immagine di Brightfield di tessuto macchiato H&E pre-espanso preso con un obiettivo 40x (0,95 NA). (B) Immagine DAPI post-espansione della stessa regione di interesse dopo che il campione è stato completamente ampliato in acqua. L'immagine è stata ottenuta su un microscopio confocale a disco rotante utilizzando un obiettivo 40x (NA 1.15; immersione idrica). Barre di scala: 10 m(A, la barra della scala gialla indica le immagini post-espansione) e 2 m(B, dimensione fisica dopo l'espansione 50,1 m; fattore di espansione 5,1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi di campioni di rene freschi congelati dopo l'espansione, ottenuti al microscopio confocale del disco rotante con un obiettivo 40x (NA 1.15; immersione in acqua). Blu e vimentina; verde - alfa-actinina 4 (ACTN4); rosso - collagene IV; grigio - DAPI. Barra della scala: 10 m (dimensione fisica dopo l'espansione 45 m; fattore di espansione 4,5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| componente | Concentrazione di scorte | Volume delle scorte (mL) | Concentrazione finale | Importo finale per 10 mL |
| Acrilato di sodio | 0,380 g/mL | 2.25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Acrilammide | 0,500 g/mL | 0.50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N,N'-Metilenebisacrylamide | 0,020 g/mL | 0.50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| Cloruro di sodio | 0,292 g/mL | 4.00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x (10x) | 1.00 | 1x (in modo non il | 1x (in modo non il |
| acqua | 1.15 | |||
| Volume totale | 9.40 |
Tabella 1: Componenti della soluzione monomer. Tutte le concentrazioni sono indicate in termini di g/mL (w/v) ad eccezione di PBS.
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Discussion
Qui, presentiamo il protocollo ExPath16, una variante di proExM5 che può essere applicata ai tipi più comuni di campioni di biopsia clinica utilizzati in patologia, tra cui FFPE, H&E macchiati, e campioni freschi congelati su vetrini di vetro. La conversione del formato, il recupero dell'antigene e l'immunostaining dei campioni seguono protocolli di uso comune che non sono specifici di ExPath. A differenza del protocollo proExM originale9, ExPath si basa su una maggiore concentrazione di EDTA nel buffer di digestione, che migliora l'espansione dei tessuti fissati alla formalina, come dimostrato nello studio originale ExPath16. Il protocollo è stato convalidato in campioni clinici di16, ma potrebbe anche essere applicato a campioni di tessuto più spessi con qualche modifica. I passaggi più critici in questo protocollo sono: 1) la tempistica delle fasi di gelazione; 2) impostazione della camera di gelazione; 3) parametri per l'omogeneizzazione del campione; e 4) la manipolazione del gel.
Il parametro più critico per questo protocollo è la temporizzazione delle fasi di gelazione. Se la soluzione di gelling polimerizza prematuramente, il campione non sarà sufficientemente ancorato alla matrice del gel. Un ancoraggio inadeguato e la gela prematura possono causare distorsioni, limitare l'espansione e provocare la perdita di molecole bersaglio (Figura 4F,G). L'avvio della gelazione dipende dalla temperatura, quindi è importante mantenere la soluzione mista di gelling a 4 gradi centigradi prima di posizionarla sul campione bersaglio. L'iniziatore, APS, deve essere preparato al momento e aggiunto immediatamente prima di applicare la soluzione di gelling. APS non è stabile a RT e può perdere efficacia dopo essere stato sottoposto a cicli di congelamento-disgelo. Un ancoraggio insufficiente può anche essere il risultato di una ridotta reattività del composto di ancoraggio, AcX, che può perdere attività dopo lo stoccaggio a lungo termine o dopo il contatto con l'acqua. AcX è stato trovato per mantenere l'attività dopo 6 mesi di stoccaggio in un ambiente desiccato a -20 gradi centigradi. Se la gelazione prematura non è la causa sospetta di distorsione, può essere preparata una nuova soluzione di stock di AcX.
Durante la configurazione della camera di gelazione, le bolle d'aria possono rimanere intrappolate sotto il coperchio del vetro di copertura. Se queste bolle si trovano sopra o toccano direttamente il campione, possono causare distorsioni. Possono essere allontanati dal campione aggiungendo più soluzione di gelling attraverso il lato della camera. Per aiutare a prevenire le bolle d'aria, una piccola goccia di soluzione di gelling può essere depositata sul coperchio prima di posizionarlo sopra il tessuto.
La digestione del campione dipende dal tempo, dalla temperatura, dalle proprietà dei tessuti, come lo spessore e il tipo di tessuto. Una digestione inadeguata può anche causare distorsioni e provocare un fattore di espansione inferiore al previsto. Se si sospetta una digestione incompleta, il tempo di digestione e/o la concentrazione di ProK possono essere aumentati, in particolare nel caso di tessuti più spessi. ProK può anche perdere attività nel tempo. Per preservare la sua attività, ProK deve essere immagazzinato a -20 gradi centigradi e può essere infilato in volumi più piccoli per evitare cicli di sgelo libero.
Prestare attenzione quando si maneggiano campioni omogeneizzati, in particolare quando completamente ampliato. Se il campione è difficile da individuare quando immerso in liquido, illuminare il contenitore da diverse angolazioni può disperdere la luce incidente per consentire la visualizzazione del gel. I gel completamente espansi sono fragili e possono rompersi durante la manipolazione. L'uso di spazzole morbide e spatole di plastica è raccomandato per trasferire i gel espansi.
Il protocollo ExPath fornisce un'alternativa conveniente alle attuali tecniche di imaging a super-risoluzione e microscopia elettronica per interrogare strutture su nanoscala in campioni di biopsia clinica. Anche se ProK fornisce anche l'espansione del campione dopo l'omogeneizzazione, la perdita di proteine impedisce l'interrogatorio di altri obiettivi di interesse dopo l'espansione. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente eseguito in qualsiasi laboratorio bagnato regolare. Ancora più importante, l'imaging di caratteristiche su nanoscala può essere effettuato su microscopi convenzionali a campo largo o confocale che si trovano comunemente nei laboratori di biologia e nelle strutture di base di imaging.
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Disclosures
Yz e OB sono due degli inventori che hanno richiesto e ottenuto la protezione brevettuale su un sottoinsieme delle tecnologie descritte qui (brevetti USA20190064037A1, WO2018157074A1 e WO2018157048A1).
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Start-up fund della Carnegie Mellon University (Yz) e dal NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD025926-01 a Yz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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