Summary
Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.
Abstract
En la patología moderna, la microscopía óptica desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades al revelar estructuras microscópicas de muestras clínicas. Sin embargo, el límite fundamental de difracción física impide el interrogatorio de la anatomía a nanoescala y los cambios patológicos sutiles cuando se utilizan enfoques de imágenes ópticas convencionales. Aquí, describimos un protocolo simple y barato, llamado patología de expansión (ExPath), para imágenes ópticas a nanoescala de tipos comunes de muestras de tejido primario clínico, incluyendo tejido de parafina incrustada fija o fija de formalina (FFPE) Secciones. Este método elude el límite de difracción óptica transformando químicamente las muestras de tejido en híbridos de tejido-hidrogel y expandiéndolas físicamente isotrópicamente a través de múltiples escalas en agua pura. Debido a la expansión, las moléculas previamente irresueltas se separan y por lo tanto se pueden observar utilizando un microscopio óptico convencional.
Introduction
Investigar la organización molecular de los tejidos en un contexto tridimensional (3D) puede proporcionar una nueva comprensión de las funciones biológicas y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos entornos a nanoescala están más allá de las capacidades de resolución de los microscopios limitados de difracción convencionales (200-300 nm), donde la distancia mínima resuelta, d se define por d a/NA. Aquí está la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica (NA) del sistema de imágenes. Recientemente, la visualización directa de moléculas etiquetadas fluorescentes ha sido posible gracias a las técnicas de imagen de superresolución recientemente desarrolladas1,2,3, incluyendo el agotamiento de emisiones estimulada (STED), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y microscopía de iluminación estructurada (SIM). Aunque estas técnicas de imagen han revolucionado la comprensión de la función biológica a escala nanométrica, en la práctica, a menudo se basan en equipos costosos y/o especializados y pasos de procesamiento de imágenes, pueden tener un tiempo de adquisición más lento en comparación con imágenes ópticas convencionales, requieren fluoróforos con características específicas (como la capacidad de fotoconmutación y/o alta fotoestabilidad). Además, sigue siendo un desafío realizar imágenes de superresolución 3D en muestras de tejido.
La microscopía de expansión (ExM), introducida por primera vez en 20154, proporciona un medio alternativo de imagen de características a nanoescala (<70 nm) mediante la expansión física de muestras conservadas incrustadas en un hidrogel de polielectrolito hinchable. Aquí, las biomoléculas clave y/o las etiquetas están ancladas in situ a una red de polímeros que se puede expandir isotópicamente después del procesamiento químico. Debido a que la expansión física aumenta la resolución efectiva total, las moléculas de interés se pueden resolver utilizando sistemas de imágenes convencionales con limitación de difracción. Desde la publicación del protocolo original, donde las etiquetas fluorescentes sintetizadas a medida estaban ancladas a la red de polímeros4, se han utilizado nuevas estrategias para anclar directamente proteínas (retención de proteínas ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 y ARN9,10,11,12 al hidrogel, y aumentar el aumento físico a través de la iteración expansión13 o adaptación de la química de gel8,14,15.
Aquí presentamos una versión adaptada de proExM, llamada patología de expansión (ExPath)16,que ha sido optimizada para formatos de patología clínica. El protocolo convierte muestras clínicas, incluyendo parafina incrustada en parafina fija de formalina (FFPE), teñidas de hematoxilina y eosina (H&E), y muestras de tejido humano recién congeladas montadas en diapositivas de vidrio, en un estado compatible con ExM. Las proteínas se anclan al hidrogel y se realiza la homogeneización mecánica (Figura 1)16. Con una expansión lineal de 4 veces de las muestras, las imágenes multicolores de superresolución (70 nm) se pueden obtener utilizando un microscopio confocal convencional con una resolución de sólo 300 nm y también se pueden combinar con otras técnicas de imagen de superresolución.
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Protocol
1. Preparación de reactivos y soluciones de stock
-
Prepare los componentes de la solución gelificante.
NOTA: Las concentraciones de solución se indican en g/mL (p/v por ciento).- Realice las siguientes soluciones de stock: 38% (p/v) acrilato de sodio (SA), 50% (p/v) acrilamida (AA), 2% (p/v) N,N-metilenbisacrilamida (Bis) y 29,2% (p/v) cloruro de sodio (NaCl). Disolver los compuestos en agua doblemente desionizada (ddH2O). Utilice los importes de la Tabla 1 como referencia; soluciones preparadas se pueden escalar o reducir en volumen según sea necesario. Por ejemplo, para hacer 10 ml de una solución SA del 38% (w/v), agregue 1,9 g de SA a un cilindro de 10 ml graduado y agregue ddH2O a un volumen de 5 ml.
- Prepare 9,4 ml de solución monómero a una concentración de 1,06x como se muestra en la Tabla 1.
NOTA: Esto resultará en una concentración de 1x después de la adición del iniciador, acelerador e inhibidor. El stock de monómeros se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 meses, o a -20 oC para el almacenamiento a largo plazo. - Preparar las siguientes soluciones de stock por separado en ddH2O: 0,5% (p/v) del inhibidor 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxyl (4HT), que inhibe la gelación para permitir la difusión de la solución gelificante en los tejidos, 10% (v/v) de la iniciador tetrametiletilendiamina (TEMED), que acelera la generación radical por persulfato de amonio (APS), y 10% (w/v) APS que inicia el proceso de gelificante.
NOTA: Las soluciones de stock de 4HT y TEMED se pueden preparar en alícuotas de 1 ml y almacenarse a -20 oC durante al menos 6 meses. APS se ha encontrado para perder eficacia después de almacenamiento a largo plazo y se prepara mejor en pequeñas cantidades (<0.1 mL) inmediatamente antes de gelificar.
- Preparar tampón de digestión (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] tensioactivo no iónico, 0.8 M NaCl) combinando 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3.03 g de base Tris en 25 mL de ddH2O), 25 mL de EDTA (0.5 M pH 8) , 2,25 g de tensioactivo no iónico, y 23,38 g de NaCl. Añadir ddH2O para un volumen total de 500 mL.
NOTA: La solución se puede escalar o reducir hacia arriba según sea necesario y almacenarse a 4 oC. La proteinasa K (ProK) se añadirá inmediatamente antes del paso de digestión. - Preparar una solución de citrato sódico de 20 ml combinando 2.941 g de citrato sódico tribásico dihidrato con 500 ml de ddH2O y ajustando el pH a 8,0 a temperatura ambiente (RT). Escale el volumen de stock según sea necesario.
- Preparar una solución de stock de 6-((acriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidilo (acriloyl-X, SE; AcX), el compuesto de anclaje. Disolver AcX en 500 ml de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) para una concentración final de 10 mg/ml.
NOTA: La solución se puede almacenar en un entorno desecado a -20 oC en alícuotas de 20 ol. - Si no utiliza tampones disponibles comercialmente para inmunostaining, prepare el tampón de bloqueo. Utilice un tampón de bloqueo de 5% (v/v) de suero animal normal y 0,1% (p/v) tensioactivo no iónico en 1 solución salina con fosfato (PBS) y seleccione el suero en función del animal huésped de los anticuerpos secundarios. Por ejemplo, para preparar un tampón de bloqueo de 500 ml para anticuerpos criados en cabra, combine 25 ml de suero de cabra, 0,45 g de tensioactivo no iónico y 1 x PBS a un volumen de 500 ml.
2. Preparación de diapositivas de tejido sórteo y recién preparadas para ExPath
- Convierta el tejido en un formato compatible con ExPath. Elija uno de los cuatro pasos siguientes (2.1.1-2.1.4) en función de cómo se preparó la muestra: diapositivas FFPE, diapositivas FFPE manchadas o diapositivas de tejido congelado no fijadas o fijas en solución óptima de temperatura de corte (OCT).
NOTA: Estos se basan en pasos de recuperación estándar para muestras de patología y no son específicos del protocolo ExPath.- Muestras clínicas FFPE
- Preparar 30 ml de 95% de etanol, 70% etanol y 50% etanol. Mida 30 ml de xileno, 100% etanol y ddH2O.
- Coloque la diapositiva con la muestra en una cónica de 50 ml utilizando fórceps y agregue 15 ml de xileno. Tapar el tubo y colocarlo horizontalmente en un agitador orbital a aproximadamente 60 rpm e incubar a RT durante 3 minutos para cada solución. Repita con el xileno de 15 ml restante.
- Repita el paso 2.1.1.2 con 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol y ddH2O en lugar de xileno.
- Diapositivas permanentes manchadas y montadas
- Coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm y cubra con xileno. Retire con cuidado el cubreobjetos con una cuchilla de afeitar. Si el cubreobjetos no se retira fácilmente, vuelva a colocar la corredera en el xileno hasta que el cubreobjetos se afloje.
- Procesar utilizando los pasos para las muestras FFPE (pasos 2.1.1.1-2.1.1.3).
NOTA: En el caso de las diapositivas teñidas H&E, las manchas se eliminan durante el proceso de expansión.
- Diapositivas de tejido congelado no fijadas en solución de PTU
- Fijar el tejido en acetona a -20 oC durante 10 min.
- Lave las muestras con 1 solución de PBS 3 veces durante 10 minutos cada una en RT.
- Diapositivas de tejido clínico congeladas previamente fijadas
- Incubar los portaobjetos durante 2 minutos a RT para derretir la solución OCT.
- Lave la muestra con 1 solución de PBS 3 veces durante 5 minutos cada una en RT.
- Muestras clínicas FFPE
- Realice un tratamiento térmico para la recuperación de antígenos en todas las muestras después de la conversión del formato.
- Agregue una solución de citrato de 20 mM (pH 8 en RT) en un recipiente resistente al calor, como un frasco de tinción deslizante.
NOTA: Debe haber suficiente solución para cubrir el tejido montado en la corredera (50 ml para un frasco de tinción de diapositiva estándar). - Calentar la solución de citrato a 100 oC en el microondas y colocar el portaobjetos en la solución. Transfiera inmediatamente el recipiente a una cámara de incubación e incubar a 60 oC durante 30 min.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los toboganes se pueden colocar en platos Petri y cubiertos en 1x PBS y almacenarse a 4 oC.
- Agregue una solución de citrato de 20 mM (pH 8 en RT) en un recipiente resistente al calor, como un frasco de tinción deslizante.
- Mancha rinde la muestra utilizando protocolos de tinción estándar de inmunofluorescencia (IF)/inmunohistoquímica (IHC).
NOTA: Las concentraciones específicas de anticuerpos primarios y secundarios y las duraciones de tinción dependen de las concentraciones sugeridas por el fabricante o de la optimización para el experimento específico.- Utilice una pluma hidrófoba para dibujar un límite alrededor de la sección o secciones de tejido en la diapositiva para minimizar el volumen de solución necesaria para cubrir el tejido. Coloque el portaobjetos en un plato lo suficientemente grande como para ajustarlo. Para un portaobjetos estándar de 3 pulgadas, utilice una placa Petri de 100 mm.
NOTA: La pluma hidrófoba no interfiere con la polimerización de la muestra ni con el proceso de digestión. - Incubar el tejido con tampón de bloqueo durante 1 h a 37 oC, 2 h a RT o 4 oC durante la noche para reducir la unión inespecífica.
- Diluir los anticuerpos primarios a la concentración deseada en la cantidad adecuada de tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de tinción preferido). Incubar los tejidos con la solución primaria de anticuerpos durante al menos 3 h a RT o 37 oC, o durante la noche a 4 oC.
NOTA: Las muestras deben colocarse en un recipiente humidificado (como un plato de Petri con una toallita húmeda) para evitar que el tejido se seque. Típicamente, los anticuerpos se han diluido a 1:100-1:500 en 200-500 l de tampón, dependiendo del tamaño del tejido y el anticuerpo utilizado. - Lave el tejido con tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de lavado preferido) 3 veces durante 10 minutos a RT.
- Diluir los anticuerpos secundarios (y 300 nM 4o,6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI] si se desea), en el tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de tinción preferido) a una concentración de aproximadamente 10 g/ml. Incubar el tejido de la solución secundaria de anticuerpos durante al menos 1 h a RT o 37 oC.
NOTA: El tiempo se puede ajustar dependiendo de los anticuerpos utilizados y el grosor del tejido. Los anticuerpos secundarios que contienen colorantes de cianina (Cy3, Cy5, Alexa 647) no son compatibles con el protocolo ExM cuando se aplica pre-polimerización. Los colorantes sugeridos incluyen Alexa 488 (verde), Alexa 546 (naranja/rojo) y Atto 647N o CF633 (rojo lejano). DAPI debe volver a aplicarse después de la expansión, ya que se lava durante el proceso de expansión. - Lave el tejido con tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de lavado preferido) 3 veces durante 10 minutos cada uno en RT.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los toboganes se pueden colocar en platos Petri y cubiertos en 1x PBS y almacenarse a 4 oC. - Realice imágenes fluorescentes utilizando un microscopio de campo ancho convencional, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección.
NOTA: Este paso es necesario para determinar la longitud biológica utilizando el factor de expansión comparando imágenes anteriores y posteriores a la expansión. Para facilitar las imágenes posteriores a la expansión, se deben seleccionar regiones de interés fácilmente identificables y se deben recopilar imágenes con un aumento bajo y alto.
- Utilice una pluma hidrófoba para dibujar un límite alrededor de la sección o secciones de tejido en la diapositiva para minimizar el volumen de solución necesaria para cubrir el tejido. Coloque el portaobjetos en un plato lo suficientemente grande como para ajustarlo. Para un portaobjetos estándar de 3 pulgadas, utilice una placa Petri de 100 mm.
3. En situ Polimerización de Especímenes
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Incubar la muestra en solución de anclaje.
- Preparar la solución de anclaje (normalmente 250 l es suficiente para cubrir la sección de tejido) diluyendo la solución de material AcX en 1x PBS a una concentración de 0,03 mg/ml para muestras fijadas con fijadores no aldehídos o 0,1 mg/ml para muestras fijadas con fijadores de aldehído , que tienen menos aminas libres disponibles para reaccionar con AcX.
- Coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm y pipetee la solución de anclaje sobre el tejido. Incubar durante al menos 3 h a RT o durante la noche a 4oC.
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Incubar las muestras en solución gelificante.
- Preparar al menos 100 veces el exceso de volumen de solución gelificante. Por 200 l, combinar lo siguiente, en orden: 188 l de solución de monómero, 4 l de solución de stock de 0,5% 4HT (1:50 dilución, concentración final: 0,01%), 4 l de solución de stock TEMED al 10% (1:50 de dilución, concentración final 0,2%) y 4 l de solución de stock 10% APS (1:500% de solución de stock DE TEMED (1:50% de solución de stock (1:500% de solución de stock (1:500% dilución, concentración final 0,2%).
NOTA: La solución gelificante debe hacerse inmediatamente antes de su uso. La solución debe mantenerse a 4 oC y la solución APS debe añadirse en último lugar, para evitar el gelificante prematuro. - Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm. Añadir una solución gelificante fresca y fría a la muestra e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 oC, para permitir la difusión de la solución en el tejido.
- Preparar al menos 100 veces el exceso de volumen de solución gelificante. Por 200 l, combinar lo siguiente, en orden: 188 l de solución de monómero, 4 l de solución de stock de 0,5% 4HT (1:50 dilución, concentración final: 0,01%), 4 l de solución de stock TEMED al 10% (1:50 de dilución, concentración final 0,2%) y 4 l de solución de stock 10% APS (1:500% de solución de stock DE TEMED (1:50% de solución de stock (1:500% de solución de stock (1:500% dilución, concentración final 0,2%).
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Construir una cámara en el portaobjetos alrededor de la muestra(Figura 2A) sin alterar la solución gelificante.
- Haga espaciadores para la cámara de gelificante cortando delgadamente trozos de vidrio de cubierta usando un cuchillo de diamante.
NOTA: Para facilitar la toma de imágenes después de la expansión, los espaciadores deben estar cerca de espesor de la muestra de tejido para reducir la cantidad de gel en blanco por encima del tejido. El vidrio número 1.5 se puede utilizar para muestras clínicas estándar (5 a 10 m). Las piezas de vidrio de la cubierta se pueden apilar para muestras más gruesas. - Fije los espaciadores a ambos lados del tejido con gotas de agua (-10 l).
- Coloque cuidadosamente una tapa de vidrio de la cubierta sobre la diapositiva, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire sobre el tejido(Figura 2B).
- Haga espaciadores para la cámara de gelificante cortando delgadamente trozos de vidrio de cubierta usando un cuchillo de diamante.
- Incubar la muestra a 37oC en un ambiente humidificado (como un plato de Petri cerrado con una toallita húmeda) durante 2 h.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La cámara deslizante se puede almacenar dentro de una placa Petri sellada a 4 oC.
4. Digestión de muestra
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Retire la tapa de la cámara de gelificante deslizando suavemente una cuchilla de afeitar debajo de la cubierta y levantando lentamente la cubierta de la superficie del gel. Recorte el gel en blanco alrededor del tejido para minimizar el volumen. Corte el gel asimétricamente para realizar un seguimiento de la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra se volverá transparente.
- Diluir ProK por 1:200 en tampón de digestión (concentración final 4 U/ml) antes de su uso. Preparar suficiente solución para sumergir completamente el gel; un solo pozo de una placa de cultivo de células de plástico de cuatro pocillos requiere al menos 3 ml por pozo.
- Incubar la muestra en un recipiente cerrado que contenga el tampón de digestión durante 3 h a 60 oC. Si la muestra no se desprende de la corredera durante la digestión, utilice una cuchilla de afeitar para retirar suavemente la muestra.
NOTA: La muestra debe estar completamente sumergida en el tampón de digestión para evitar que la muestra se seque y se coloque en un recipiente cubierto (caja de diapositivas pequeña, pozo de plástico, plato Petri, etc.) que se pueda sellar con película.
5. Expansión de muestras e imágenes
- Utilice un pincel suave para transferir la muestra en 1pbS en un recipiente compatible con el sistema de imágenes deseado y lo suficientemente grande como para acomodar el gel completamente expandido. Asegúrese de que el tejido se coloca con el lado de la muestra hacia abajo si la toma de imágenes en un sistema invertido o hacia arriba si la toma de imágenes en un sistema vertical para minimizar la distancia desde el objetivo de imagen hasta la muestra. Voltear el gel con un pincel suave si es necesario.
NOTA: La iluminación lateral de un LED se puede utilizar para hacerlos visibles en líquido. Una placa estándar de 6 pocillos puede acomodar muestras que tienen un diámetro pre-expandido inferior a 0,6 cm. Se debe utilizar una placa de pozo inferior de vidrio para tomar imágenes en un sistema invertido. - Lave las muestras en 1pbS a RT durante 10 minutos. Si lo desea, vuelva a manchar la muestra con 300 nM DAPI a medida que el proceso de digestión lava la mancha DAPI. Retire PBS y manchar con 300 nM DAPI diluido en 1pbS durante 20 minutos en RT, seguido de un lavado de 10 minutos con 1pbS en RT.
NOTA: Las muestras pueden ser cubiertas con 1pbS y almacenadas a 4 oC antes de continuar con el siguiente paso. - Para ampliar las muestras, reemplace el PBS y lave con un volumen excesivo de ddH2O (al menos 10 veces el volumen final del gel) 3 x 5 veces durante 10 minutos cada uno, en RT.
NOTA: Después dellavado 3 o4, la expansión del espécimen debe comenzar a meseta. Para el almacenamiento, para prevenir el crecimiento bacteriano, el ddH2O se puede complementar con 0.002% -0.01% azida sódica (NaN3). En este caso, el factor de expansión final se reduce de forma reversible en un 10%. - Realice imágenes por fluorescencia utilizando un microscopio de campo ancho convencional, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección.
NOTA: Para evitar que los geles se desvíen, el exceso de líquido se puede eliminar del pozo. Los geles también se pueden inmovilizar con agarosa de fusión baja de 1,5-2%. Preparar agarosa de baja fusión en agua en un recipiente 2 x 4 veces el volumen de la solución. Caliente la solución en un baño de agua de 40oC o en un microondas durante 10 a 20 s para derretir la solución. Pipetear la agarosa derretida alrededor de los bordes del gel. Después de permitir que la agarosa se endurezque a RT o 4 oC, agregue agua a la muestra para evitar la deshidratación.
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Representative Results
Si el protocolo se ha llevado a cabo con éxito(Figura 1), las muestras aparecerán como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica(Figura 3A) y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5x en agua(Figura 3B), proporcionando una resolución efectiva de 70 nm dependiendo del factor de expansión final y el sistema de imágenes utilizado5,16. La Figura 4 muestra imágenes de ejemplo de una muestra de riñón FFPE de 5 m de espesor procesada mediante el protocolo ExPath. La expansión total de las muestras gelificadas dio como resultado un factor de expansión de 4,5x en agua, dando una resolución efectiva de 63 nm cuando se imágen utilizando un objetivo de 0,95 NA. El tejido fue preprocesado primero con xileno para eliminar la parafina y rehidratado (sección 2.1.1), seguido de la recuperación de antígenos con el tampón de citrato (sección 2.2). El tejido recuperado se tiñó entonces con anticuerpos para alfa-actinina 4 (ACTN4) y vimentina, junto con DAPI para visualizar ADN nuclear y aglutinina de germino de trigo (WGA), para etiquetar carbohidratos. El espécimen fue entonces imageado usando un microscopio confocal de disco giratorio(Figura 4A,B,D). Los tejidos fueron tratados siguiendo el protocolo anterior y completamente expandidos en agua(Figura 4C,E). Del mismo modo, la Figura 5 muestra imágenes de ejemplo de tejido mamario normal teñido de H&E(Figura 5A) que se trató con xileno (sección 2.1.2) para extraer el vidrio de la cubierta y luego se trató como una muestra de FFPE (sección 2.1.1). Durante la homogeneización, la mancha de H&E se elimina del tejido. Las imágenes posteriores a la expansión de la muestra teñida de DAPI obtenida en un microscopio confocal de disco giratorio(Figura 5B)en comparación con las imágenes previas a la expansión indican un factor de expansión de 5,1, lo que proporciona una resolución efectiva de 43 nm cuando se una lente NA 1.15.
Los datos de ejemplo de los sectores renales congelados no fijos procesados con el protocolo ExPath se pueden ver en la Figura 6. El tejido se fijó por primera vez en acetona fría (sección 2.1.3) y se tiñó con ACTN4, vimentin, DAPI y WGA. La comparación de las imágenes previas a la expansión (no mostradas) y posteriores a la expansión indica un factor de expansión de 4,5. Los datos de comparación de las muestras de riñón congelado fijas en acetona con las de las muestras de FFPE(Figura 4C,E)muestran que hay una disminución en la calidad de la tinción ACTN4 en la muestra de FFPE expandida, que puede deberse a una degradación de la antigenicidad debido al método de fijación16.
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de la patología de expansión (ExPath). El preprocesamiento de diapositivas de tejido clínicamente archivadas se realiza primero en función del formato de almacenamiento. A continuación, las muestras se tiñen utilizando protocolos de inmunomancha convencionales y se obtienen imágenes previas a la expansión. Las muestras se tratan con acriloilo-X SE (AcX) para anclar proteínas al hidrogel. La polimerización in situ se preformado antes de la homogeneización mecánica utilizando proteinasa K (ProK). Las muestras se pueden ampliar en ddH2O antes de la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cámara de gelión para muestras de patología. (A) Dos espaciadores, como dos piezas de vidrio de #1,5 cubiertas cortadas con un cuchillo de diamante, se colocan a ambos lados del tejido después de incubar la muestra en solución de gelificante a 4 oC. Los espaciadores deben ser más gruesos que las rodajas de tejido, para evitar la compresión de la muestra. (B) Se utiliza una tapa, como un trozo de vidrio de #1,5, para cubrir la muestra antes de la incubación a 37 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de expansión de muestra. Se muestra una muestra renal de 5 m de espesor después de la homogeneización, (A) antes y(B)después de la expansión en ddH2O. Los cuadrados de cuadrícula son de 5 mm x 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de muestras renales de FFPE de 5 m de espesor. (A) Imagen preexpandida. (B) Imagen de preexpansión ampliada de la región de interés esbozada en el panel A y (C) la imagen posterior a la expansión correspondiente de la misma región de interés después de que la muestra se expandiera completamente en agua. (D) Imagen ampliada de la región de interés esbozada en el panel B y (E) la imagen posterior a la expansión correspondiente de la misma región de interés después de que la muestra se expandió completamente en agua. El agrietamiento, las distorsiones y la pérdida de objetivos etiquetados pueden ser el resultado de un anclaje y/o homogeneización inadecuados (F,G). Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 20x (NA 0.95; inmersión en agua) (A-E,G) o 10x (NA 0.5) objetivo (F). Azul, DAPI; verde, vimentin; rojo, alfa-actinina 4 (ACTN4); magenta, WGA. Las barras de escala de 100 m(A,F,G, las barras de escala amarilla indican imágenes posteriores a la expansión); 50 m(B), 50 m(C), tamaño físico después de la expansión 225 m; factor de expansión 4.5); 25 m(D); 25 m(E, tamaño físico después de la expansión 112,5 m; factor de expansión 4.5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos del tejido mamario normal teñido de H&E. (A) Imagen de Brightfield de tejido teñido De Y&E pre-expandido tomado con un objetivo de 40x (0.95 NA). (B) Imagen DAPI posterior a la expansión de la misma región de interés después de que la muestra se expandiera completamente en agua. La imagen se obtuvo en un microscopio confocal de disco giratorio utilizando un objetivo de 40x (NA 1.15; inmersión en agua). Barras de escala de 10 m(A, la barra de escala amarilla indica imágenes posteriores a la expansión) y 2 m(B, tamaño físico después de la expansión 50,1 m; factor de expansión 5.1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados representativos de muestras renales congeladas frescas después de la expansión, obtenidas en un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 40x (NA 1.15; inmersión en agua). Azul- vimentin; verde - alfa-actinina 4 (ACTN4); rojo - colágeno IV; gris - DAPI. Barra de escala a 10 m (tamaño físico después de la expansión 45 m; factor de expansión 4.5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Concentración de stock | Volumen de stock (mL) | Concentración final | Importe final por 10 mL |
| Acrilato de sodio | 0.380 g/ml | 2.25 | 0.086 g/mL | 0,86 g |
| Acrilamida | 0.500 g/ml | 0.50 | 0.025 g/mL | 0,25 g |
| N,N-Metilebisacrylamida | 0.020 g/ml | 0.50 | 0.001 g/ml | 0,10 g |
| Cloruro de sodio | 0.292 g/ml | 4.00 | 0.117 g/ml | 1.17 g |
| Pbs | 10x | 1.00 | 1x | 1x |
| Agua | 1.15 | |||
| Volumen total | 9.40 |
Tabla 1: Componentes de la solución de monómero. Todas las concentraciones se indican en términos de g/mL (p/v) excepto PBS.
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Discussion
Aquí, presentamos el protocolo ExPath16,una variante de proExM5 que se puede aplicar a los tipos más comunes de muestras de biopsia clínica utilizadas en patología, incluyendo FFPE, H&E y muestras congeladas frescas en diapositivas de vidrio. La conversión de formatos, la recuperación de antígenos y la inmunomanchación de las muestras siguen protocolos comúnmente utilizados que no son específicos de ExPath. A diferencia del protocolo proExM original9,ExPath se basa en una mayor concentración de EDTA en el tampón de digestión, lo que mejora la expansión de los tejidos fijados de formalina, como se demuestra en el estudio original ExPath16. El protocolo ha sido validado en muestras clínicas de 5 a 10 m de espesorde 16,pero también podría aplicarse a muestras de tejido más gruesas con alguna modificación. Los pasos más críticos en este protocolo son: 1) la sincronización de los pasos de la gelación; 2) configuración de la cámara de gelación; 3) parámetros para la homogeneización de muestras; y 4) manejo del gel.
El parámetro más crítico para este protocolo es la sincronización de los pasos de gelación. Si la solución gelificante se polimeriza prematuramente, la muestra no estará suficientemente anclada a la matriz de gel. El anclaje inadecuado y la gelación prematura pueden causar distorsiones, limitar la expansión y dar lugar a la pérdida de moléculas diana(Figura 4F, G). El inicio de la gelación depende de la temperatura, por lo que es importante mantener la solución de gelificante mixta a 4 oC antes de colocarla en la muestra objetivo. El iniciador, APS, debe estar recién preparado y añadido inmediatamente antes de aplicar la solución gelificante. APS no es estable en RT y puede perder eficacia después de someterse a ciclos de congelación-descongelación. El anclaje insuficiente también puede ser el resultado de una menor reactividad del compuesto de anclaje, AcX, que puede perder actividad después del almacenamiento a largo plazo o después del contacto con el agua. Se ha encontrado que AcX conserva la actividad después de 6 meses de almacenamiento en un entorno desecado a -20 oC. Si la gelación prematura no es la causa sospechosa de distorsión, se puede preparar una nueva solución de stock de AcX.
Durante la configuración de la cámara de gelión, las burbujas de aire pueden quedar atrapadas debajo de la tapa de cristal de la cubierta. Si estas burbujas están encima de la muestra o tocan directamente la muestra, pueden causar distorsiones. Se pueden alejar de la muestra añadiendo más solución gelificante a través del lado de la cámara. Para ayudar a prevenir las burbujas de aire, se puede depositar una pequeña gota de solución gelificante en la tapa antes de colocarla sobre el tejido.
La digestión de la muestra depende del tiempo, la temperatura, así como de las propiedades del tejido, como el grosor y el tipo de tejido. La digestión inadecuada también puede causar distorsiones y dar lugar a un factor de expansión menor de lo esperado. Si se sospecha de digestión incompleta, el tiempo de digestión y/o la concentración de ProK pueden aumentar, particularmente en el caso de tejidos más gruesos. ProK también puede perder actividad con el tiempo. Para preservar su actividad, ProK debe almacenarse a -20 oC y puede alícitarse en volúmenes más pequeños para evitar ciclos de descongelación libre.
Se debe tener cuidado al manipular muestras homogeneizadas, especialmente cuando se expanden completamente. Si la muestra es difícil de localizar cuando se sumerge en líquido, iluminar el recipiente desde diferentes ángulos puede dispersar la luz incidente para permitir la visualización del gel. Los geles completamente expandidos son frágiles y pueden romperse durante la manipulación. Se recomienda el uso de cepillos suaves y espátulas de plástico para transferir los geles expandidos.
El protocolo ExPath proporciona una alternativa rentable a las técnicas actuales de imágenes de superresolución y microscopía electrónica para interrogar estructuras a nanoescala en muestras de biopsia clínica. Aunque ProK proporciona una expansión uniforme de la muestra después de la homogeneización, la pérdida de proteínas impide el interrogatorio de otros objetivos de interés después de la expansión. Sin embargo, el protocolo se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio húmedo regular. Lo más importante es que las imágenes de las características a nanoescala se pueden llevar a cabo en microscopios convencionales de campo ancho o confocales que se encuentran comúnmente en laboratorios de biología e instalaciones de núcleo de imágenes.
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Disclosures
YZ y OB son dos de los inventores que han presentado y obtenido protección por patente en un subconjunto de las tecnologías descritas aquí (patentes estadounidenses US20190064037A1, WO2018157074A1 y WO2018157048A1).
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el fondo de start-up de la Facultad de la Universidad Carnegie Mellon (YZ) y el Nuevo Premio Innovador del Director de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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