Summary
Nanoskala avbildning av kliniske vevsprøver kan forbedre forståelsen av sykdoms patogenesen. Ekspansjon patologi (ExPath) er en versjon av ekspansjon mikroskopi (ExM), modifisert for kompatibilitet med standard kliniske vevsprøver, for å utforske nanoskala konfigurasjonen av biomolekyler bruker konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop.
Abstract
I moderne patologi spiller optiske mikroskopi en viktig rolle i sykdoms diagnosen ved å avsløre mikroskopiske strukturer av kliniske prøver. Men den grunnleggende fysiske Diffraksjon grensen hindrer avhør av nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer ved bruk av konvensjonelle optiske Imaging tilnærminger. Her beskriver vi en enkel og rimelig protokoll, kalt Utvidelses patologi (ExPath), for nanoskala optisk avbildning av vanlige typer kliniske prøver av primær vev, inkludert både fast frosset eller formalin-fast parafin innebygd (FFPE) vev Deler. Denne metoden omgår den optiske Diffraksjon grensen ved kjemisk transformere vevsprøvene i vev-hydrogel hybrid og fysisk utvide dem isotropically over flere skalaer i rent vann. På grunn av ekspansjon, er tidligere uløselig molekyler separert og kan dermed observeres ved hjelp av en konvensjonell optisk mikroskop.
Introduction
Gransker molekylær organisering av vev i en tredimensjonal (3D) kontekst kan gi ny forståelse av biologiske funksjoner og sykdomsutvikling. Disse nanoskala miljøene er imidlertid utenfor oppløsnings egenskapene til konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop (200 − 300 NM), der minimal kan løses avstand, d er definert av d α λ/na. Her λ er Bølgelengden av lys og na er den numeriske blenderåpning (na) av Imaging system. Nylig har direkte visualisering av fluorescensmerkete merket molekyler blitt gjort mulig av nyutviklet super-oppløsning Imaging teknikker1,2,3, inkludert stimulert utslipp tømming (sted), Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM), Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), og strukturert belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse Imaging teknikkene har revolusjonert forståelsen av biologisk funksjon på nanoskala, i praksis, de ofte stole på dyre og/eller spesialisert utstyr og bildebehandling trinn, kan ha tregere oppkjøpet tid å sammenligne med vanlig optisk tenkelig, forlange fluorophores med spesifikk kjennetegnene (som Foto-skifter evnen og/eller høy photostability). I tillegg er det fortsatt en utfordring å utføre 3D super oppløselig bilde på vevsprøver.
Expansion mikroskopi (ExM), først introdusert i 20154, gir en alternativ måte å Imaging nanoskala funksjoner (< 70 NM) ved å fysisk utvide bevarte prøver innebygd i en swellable polyelectrolyte hydrogel. Her er nøkkel biomolekyler og/eller etiketter forankret i situ til et polymer nettverk som kan isotopically utvides etter kjemisk behandling. Fordi den fysiske utvidelsen øker den totale effektive oppløsningen, kan molekyler av interesse deretter løses ved hjelp av konvensjonelle Diffraksjon bilde systemer. Siden utgivelsen av den opprinnelige protokollen, der tilpassede syntetisert fluorescerende etiketter ble forankret til polymer nett4, har nye strategier blitt brukt til direkte anker proteiner (protein oppbevaring ExM, eller proExM)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og Øk fysisk forstørrelse gjennom gjentakende ekspansjon13 eller tilpasse gel kjemi8,14,15.
Her presenterer vi en tilpasset versjon av proExM, kalt utvidelse patologi (ExPath)16, som har blitt optimalisert for klinisk patologi formater. Protokollen omdanner klinisk prøvene, inkluderer formalin-bestemt parafin-lagt ned i (FFPE), hematoksylin og eosin (H & E) flekkete, og frisk-frosset Human tissue prøver montert opp på barometer lysbilder, i en begrunne forenlig med ExM. Proteiner blir deretter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering utføres (figur 1)16. Med en 4-fold Lineær utvidelse av prøvene, flerfarget super-oppløsning (~ 70 NM) bilder kan fås ved hjelp av en konvensjonell konfokalmikroskopi mikroskop har bare en ~ 300 NM oppløsning og kan også kombineres med andre super-oppløsning Imaging teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av lager reagenser og-løsninger
-
Klargjør gelling løsningskomponenter.
Merk: løsnings konsentrasjonene er gitt i g/ml (w/v-prosent).- Gjør følgende lager løsninger: 38% (w/v) natrium akrylat (SA), 50% (w/v) akrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamide (BIS) og 29,2% (w/v) natriumklorid (NaCl). Oppløse forbindelsene i dobbelt deionisert vann (ddH2O). Bruk beløpene i tabell 1 som referanse. forberedt løsninger kan skaleres opp eller ned i volum etter behov. For eksempel, for å lage 10 mL av en 38% (w/v) SA-løsning, tilsett 1,9 g SA til en gradert 10 mL sylinder og tilsett ddH2O til et volum på 5 ml.
- Klargjør 9,4 mL monomer oppløsning ved en 1.06 x-konsentrasjon som vist i tabell 1.
Merk: Dette vil resultere i en 1x konsentrasjon etter tilsetning av initiativtaker, akselerator, og hemmer. Den monomer aksjen kan oppbevares ved 4 ° c i inntil 3 måneder, eller ved-20 ° c for langtidslagring. - Klargjør følgende lager løsninger separat i ddH2O: 0,5% (w/v) av hemmer 4-AHA-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-OKSYL (4HT), som hemmer gelation for å muliggjøre spredning av den gelling løsningen i vev, 10% (v/v) av initiativtaker tetrametyletylendiamin (TEMED), som akselererer radikal generasjon av ammonium persulfate (APS), og 10% (w/v) APS som initierer gelling prosessen.
Merk: Lager løsninger av 4HT og TEMED kan tilberedes i 1 mL alikvoter og oppbevares ved-20 ° c i minst 6 måneder. APS har blitt funnet å miste effekt etter langtidslagring og er best forberedt i små mengder (< 0.1 mL) umiddelbart før gelling.
- Klargjør fordøyelsen buffer (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] ioniske overflateaktivt middel, 0,8 M NaCl) ved å kombinere 25 mL 1 M Tris pH 8 (3,03 g av Tris base i 25 mL ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 m pH 8) , 2,25 g ioniske overflateaktivt middel og 23,38 g av NaCl. Legg til ddH2O for et total volum på 500 ml.
Merk: Oppløsningen kan skaleres opp eller ned etter behov og oppbevares ved 4 ° c. Proteinase K (ProK) vil bli lagt til umiddelbart før fordøyelsen trinn. - Forbered 20 mM natrium citrate løsning ved å kombinere 2,941 g natrium citrate tribasic dinatriumfosfatdihydrat med 500 mL ddH2O og justering av pH til 8,0 ved romtemperatur (RT). Skaler volumet på lager etter behov.
- Forbered en lagerløsning av 6-((akryl) amino) hexanoic acid, succinimidyl Ester (akryl-X, SE; AcX), forankring sammensatte. Løs opp AcX i 500 μL av vannfri dimethyl sulfoxide (DMSO) for en endelig konsentrasjon på 10 mg/mL.
Merk: Oppløsningen kan oppbevares i et desiccated miljø ved-20 ° c på 20 μL alikvoter. - Hvis du ikke bruker kommersielt tilgjengelige buffere for immunostaining, klargjør du blokkerings bufferen. Bruk en blokkerings buffer på 5% (v/v) normal animalsk serum og 0,1% (w/v) ioniske overflateaktivt middel i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) og velg serum basert på verts dyret til de sekundære antistoffene. Hvis du for eksempel vil klargjøre 500 mL blokkerings buffer for antistoffer som tas opp i geit, kombinerer du 25 mL geite serum, 0,45 g ioniske overflateaktivt middel og 1x PBS til et volum på 500 mL.
2. utarbeidelse av arkiverte og ferskt forberedt klinisk vev slides for ExPath
- Konvertere vevet til et ExPath kompatibelt format. Velg ett av de fire følgende trinnene (2.1.1 − 2.1.4) basert på hvordan prøven ble klargjort: FFPE-lysbilder, fargede FFPE-lysbilder, eller unfixed eller faste frosne vevs lysbilder i optimal skjære temperatur (OCT)-løsning.
Merk: disse er basert på standard gjenopprettings trinn for patologi prøver og er ikke spesifikke for ExPath-protokollen.- FFPE kliniske prøver
- Forbered 30 mL 95% etanol, 70% etanol og 50% etanol. Mål ut 30 mL xylen, 100% etanol og ddH2O.
- Plasser lysbildet med prøven i en 50 mL konisk ved hjelp av tang og tilsett 15 mL xylen. Cap røret og plassere den horisontalt på en orbital shaker på ca 60 RPM og ruge ved RT for 3 min for hver løsning. Gjenta med de resterende 15 mL xylen.
- Gjenta trinn 2.1.1.2 med 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol og ddH2O i stedet for xylen.
- Beiset og montert permanente lysbilder
- Plasser raset i en 100 mm Petri parabol og dekk med xylen. Fjern dekkglass forsiktig med et barberblad. Hvis dekkglass ikke er lett fjernes, returner lysbildet til xylen til dekkglass løsner.
- Behandle ved hjelp av trinnene for FFPE-prøver (trinn 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
Merk: Når det gjelder H & E fargede lysbilder, blir flekkene eliminert under utvidelsesprosessen.
- Unfixed frosne vev lysbilder i OCT løsning
- Fest vevet i aceton ved-20 ° c i 10 min.
- Vask prøvene med 1x PBS-løsning 3 ganger i 10 minutter hver på RT.
- Tidligere faste, frosne kliniske vevs skred
- Ruge lysbildene i 2 minutter ved RT for å smelte OCT-løsningen.
- Vask prøven med 1x PBS-løsning 3 ganger i 5 minutter hver på RT.
- FFPE kliniske prøver
- Utfør varmebehandling for antigen henting på alle prøvene etter format konvertering.
- Tilsett 20 mM citrate oppløsning (pH 8 ved RT) i en varmebestandig beholder, for eksempel et bilde farge krukke.
Merk: Det bør være nok løsning for å dekke vevet montert på lysbildet (50 mL for en standard lysbilde farging jar). - Varme opp citrate løsning til 100 ° c i mikrobølgeovnen og plasser raset i løsningen. Umiddelbart overføre beholderen til et inkubasjons kammer og ruge ved 60 ° c i 30 min.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Slides kan plasseres i Petri retter og dekket i 1x PBS og lagret ved 4 ° c.
- Tilsett 20 mM citrate oppløsning (pH 8 ved RT) i en varmebestandig beholder, for eksempel et bilde farge krukke.
- Stain prøven ved hjelp av standard immunofluorescence (IF)/immunohistochemistry (IHC) farge protokoller.
Merk: bestemte primær-og sekundær antistoff konsentrasjoner og farge varigheter avhenger av konsentrasjonene som er foreslått av produsenten, eller ved optimalisering for det spesifikke eksperimentet.- Bruk en hydrofobe penn til å tegne en grense rundt vevs delen (e) på lysbildet for å minimere volumet av løsningen som trengs for å dekke vevet. Plasser lysbildet i en rett som er stor nok til å passe i lysbildet. For en standard 3-tommers slide, bruk en 100 mm Petri parabolen.
Merk: Den hydrofobe pennen forstyrrer ikke polymerisering av prøven eller fordøyelsen prosessen. - Ruge vevet med blokkerings buffer for 1 time ved 37 ° c, 2 timer ved RT eller 4 ° c over natten for å redusere ikke-spesifikk binding.
- Fortynne primære antistoffer å det ønsket konsentrasjonen inne det passende beløpet av ferdig sperring buffer (eller annet foretrakk flekk buffer). Ruge vevet med den primære antistoff oppløsningen i minst 3 timer ved RT eller 37 ° c, eller over natten ved 4 ° c.
Merk: Prøvene bør plasseres i en fuktet beholder (for eksempel en Petri rett med en fuktig tørk) for å hindre at vevet tørker ut. Antistoffer har vanligvis blitt fortynnet til 1:100 − 1:500 på 200 − 500 μL buffer, avhengig av vevs størrelsen og antistoff bruk. - Vask vevet med klargjort blokkerings buffer (eller annen foretrukket vaskebuffer) 3 ganger i 10 min ved RT.
- Fortynne sekundære antistoffer (og 300 nM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] hvis ønskelig), i forberedt blokkerende buffer (eller annen foretrukket farge buffer) til en konsentrasjon på ca 10 μg/mL. Ruge vevet i den sekundære antistoff oppløsningen i minst 1 time ved RT eller 37 ° c.
Merk: Timing kan justeres avhengig av antistoffer som brukes og tykkelsen på vevet. Sekundære antistoffer som inneholder cyanine fargestoffer (Cy3, Cy5, Alexa 647) er ikke kompatible med ExM protokollen når den brukes pre-polymerisering. Foreslåtte fargestoffer inkluderer Alexa 488 (grønn), Alexa 546 (Orange/Red), og ATTO 647N eller CF633 (langt-rødt). DAPI må brukes på nytt etter ekspansjon, da det er vasket bort under utvidelsesprosessen. - Vask vevet med klargjort blokkerings buffer (eller annen foretrukket vaskebuffer) 3 ganger i 10 minutter hver på RT.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Slides kan plasseres i Petri retter og dekket i 1x PBS og lagret ved 4 ° c. - Utfør fluorescerende bilder med et konvensjonelt mikroskop, konfokalmikroskopi mikroskop eller et annet bildebehandlingssystem.
Merk: Dette trinnet er nødvendig for å bestemme biologisk lengde ved hjelp av Utvidelses faktoren ved å sammenligne pre-og post-ekspansjon bilder. For å lette etter ekspansjon Imaging, bør lett identifiserbare regioner av interesse velges og bilder ved både lav og høy forstørrelse bør samles.
- Bruk en hydrofobe penn til å tegne en grense rundt vevs delen (e) på lysbildet for å minimere volumet av løsningen som trengs for å dekke vevet. Plasser lysbildet i en rett som er stor nok til å passe i lysbildet. For en standard 3-tommers slide, bruk en 100 mm Petri parabolen.
3. in situ polymerisering av prøver
-
Ruge prøven i forankringsløsning.
- Klargjør forankrings løsningen (vanligvis 250 μL er nok til å dekke vevs delen) ved å fortynne AcX lagerløsning i 1x PBS til en konsentrasjon på 0,03 mg/mL for prøver som er festet med ikke-aldehyd fiksativene eller 0,1 mg/mL for prøver som er festet med aldehyd fiksativene , som har færre gratis aminer tilgjengelig for å reagere med AcX.
- Plasser raset i en 100 mm Petri parabol og Pipetter forankrings løsningen over vevet. Ruge i minst 3 timer ved RT eller over natten ved 4 ° c.
-
Ruge prøvene i gelling løsning.
- Forbered minst 100-fold overflødig volum av gelling løsning. Per 200 μL, Kombiner følgende, i rekkefølge: 188 μL av monomer oppløsning, 4 μL av 0,5% 4HT lagerløsning (1:50 fortynning, sluttkonsentrasjon: 0,01%), 4 μL av 10% TEMED lagerløsning (1:50 fortynning, endelig konsentrasjon 0,2%), og 4 μL av 10% APS lagerløsning (1:50 fortynning, endelig konsentrasjon 0,2%).
Merk: Gelling løsning bør gjøres umiddelbart før bruk. Oppløsningen skal oppbevares ved 4 ° c og APS-løsningen bør legges til sist, for å forhindre for tidlig gelling. - Fjern overflødig oppløsning fra vevs delen og plasser raset i en 100 mm Petri parabolen. Legg frisk, kald gelling løsning på prøven og ruge blandingen på vevet i 30 min ved 4 ° c, for å muliggjøre diffusjon av oppløsningen i vevet.
- Forbered minst 100-fold overflødig volum av gelling løsning. Per 200 μL, Kombiner følgende, i rekkefølge: 188 μL av monomer oppløsning, 4 μL av 0,5% 4HT lagerløsning (1:50 fortynning, sluttkonsentrasjon: 0,01%), 4 μL av 10% TEMED lagerløsning (1:50 fortynning, endelig konsentrasjon 0,2%), og 4 μL av 10% APS lagerløsning (1:50 fortynning, endelig konsentrasjon 0,2%).
-
Lag et kammer på lysbildet rundt prøven (figur 2a) uten å forstyrre den gelling løsningen.
- Lag avstandsstykker for gelling kammeret ved tynt skjære biter av dekkglass ved hjelp av en diamant kniv.
Merk: For å lette Imaging innlegg ekspansjon, bør avstandsstykker være tett i tykkelse til vevsprøven å redusere mengden av blank gel over vevet. Antall 1,5 glass kan brukes til standard kliniske prøver (5 − 10 μm). Cover glass brikker kan stables for tykkere prøver. - Fest avstandsstykker på hver side av vevet ved hjelp av vanndråper (~ 10 μL).
- Plasser forsiktig et deksel glass lokk over lysbildet, og pass på å unngå å fange luftbobler over vevet (figur 2B).
- Lag avstandsstykker for gelling kammeret ved tynt skjære biter av dekkglass ved hjelp av en diamant kniv.
- Ruge prøven ved 37 ° c i et fuktet miljø (for eksempel en lukket Petri-tallerken med en fuktig serviett) for 2 timer.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Skyve kammeret kan oppbevares i en forseglet Petri-tallerken ved 4 ° c.
4. eksempel på fordøyelse
-
Fjern lokket på gelling kammeret ved å forsiktig skyve et barberblad under dekkglass og langsomt løfte dekkglass av gel overflaten. Trim den blanke gelen rundt vevet for å minimere volum. Skjær gel asymmetrisk å spore retningen av gel etter homogenisering, siden prøven blir gjennomsiktig.
- Fortynne ProK av 1:200 i fordøyelsen buffer (siste konsentrasjon 4 U/mL) før bruk. Forbered nok løsning å helt senke gel; en enkelt brønn av en fire-brønn plast cellekultur plate krever minst 3 mL per brønn.
- Ruge prøven i en lukket beholder som inneholder fordøyelses bufferen for 3 timer ved 60 ° c. Hvis prøven ikke løsner fra lysbildet under fordøyelsen, bruker du et barberblad til å fjerne prøven forsiktig.
Merk: Prøven skal være helt neddykket i fordøyelsen buffer for å hindre at prøven tørker ut og plasseres i en overbygd container (liten Slide Box, plast brønn, Petri parabol, etc.) som kan tettes med film.
5. eksempel utvidelse og bildebehandling
- Bruk en myk pensel til å overføre prøven til 1x PBS i en beholder som er kompatibel med det ønskede bilde systemet og stor nok til å romme den fullstendig utvidede gelen. Kontroller at vevet er plassert med prøven ned hvis Imaging på et invertert system eller opp hvis Imaging på et oppreist system for å minimere avstanden fra Imaging målsetting til prøven. Vend gelen ved hjelp av en myk maling pensel hvis nødvendig.
Merk: Side-belysning fra en LED kan brukes til å gjøre dem synlige i væske. En standard 6-brønn plate kan romme prøver som har en pre-utvidet diameter mindre enn 0,6 cm. Et glassbunn brønn plate bør brukes til bildebehandling på en invertert system. - Vask prøvene i 1x PBS ved RT i 10 minutter. Hvis ønskelig, re-flekken prøven med 300 nM DAPI som fordøyelsen prosessen vasker bort DAPI flekken. Fjern PBS og flekken med 300 nM DAPI fortynnet i 1x PBS for 20 min ved RT, etterfulgt av en 10 min vask med 1x PBS på RT.
Merk: Prøvene kan dekkes med 1x PBS og lagres ved 4 ° c før du går videre til neste trinn. - For å utvide prøvene, Bytt PBS og vask med et overflødig volum på ddH2O (minst 10x det endelige gel volum) 3 − 5 ganger i 10 min hver, på RT.
Merk: Etter 3Rd eller 4th vask bør prøven ekspansjon begynne å platå. For lagring, for å hindre bakteriell vekst, kan ddH2O suppleres med 0.002% − 0,01% natrium Natriumazid (Nan3). I dette tilfellet er den endelige Utvidelses faktoren reverserbart redusert med 10%. - Utfør fluorescens avbildning ved bruk av et konvensjonelt mikroskop, konfokalmikroskopi mikroskop eller et annet bildebehandlingssystem.
Merk: For å hindre gels fra drivende, kan overflødig væske fjernes fra brønnen. Gels kan også immobilisert med 1,5 − 2% lav-smelte agarose. Forbered 1.5 − 2% (w/v) lav-smelte agarose i vann i en container 2 − 4 ganger volumet av løsningen. Varm løsningen i et vannbad på 40 ° c eller i en mikrobølgeovn i 10 − 20 s for å smelte oppløsningen. Pipetter smeltet agarose rundt kantene av gel. Når du tillater agarose å herde ved RT eller 4 ° c, tilsett vann til prøven for å hindre dehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis protokollen har blitt utført (figur 1), vil prøvene vises som en flat og transparent gel etter mekanisk homogenisering (Figur 3a) og kan utvides med en faktor på 3 − 4,5 x i vann (Figur 3B), gir en effektiv oppløsning på ~ 70 NM avhengig av den endelige Utvidelses faktoren og Imaging system som brukes5,16. Figur 4 viser eksempler på bilder av en tykk FFPE nyre prøve på 5 μm som behandles ved hjelp av ExPath-protokollen. I sin helhet ekspansjon av det gelled eksemplar resultere inne en 4.5 x ekspansjon faktoren inne vann, ga en effektiv resolution av ~ 63 NM når avbildet benytter en 0,95 NA mål. Vevet ble først pre-behandlet med xylen for å fjerne parafin og rehydrert (§ 2.1.1), etterfulgt av antigen-gjenfinning med citrate buffer (§ 2,2). Den gjenopprettede vevet ble deretter farget med antistoffer for alpha-actinin 4 (ACTN4) og vimentin, sammen med DAPI å visualisere kjernefysisk DNA og hvete bakterie agglutinin (WGA), for å merke karbohydrater. Prøven ble deretter avbildet ved hjelp av en roterende disk konfokalmikroskopi mikroskop (Figur 4a, B, D). Vev ble behandlet etter ovennevnte protokoll og fullt utvidet i vann (Figur 4C, E). Tilsvarende figur 5 viser eksempel bilder av H & E beiset normalt brystvevet (figur 5A) som ble behandlet med xylen (§ 2.1.2) for å fjerne dekselet glass og deretter behandlet som en FFPE prøve (§ 2.1.1). Under homogenisering, den H & E flekken er eliminert fra vevet. Post-ekspansjon bilder av DAPI farget prøven innhentet på en roterende disk konfokalmikroskopi mikroskop (figur 5B) sammenlignet med pre-ekspansjon bilder indikerer en Utvidelses faktor på 5,1, noe som gir en effektiv oppløsning på ~ 43 NM når avbildet med en NA 1,15 linse.
Eksempel data for unfixed frosne nyre sektorer som behandles ved hjelp av ExPath-protokollen, kan ses i figur 6. Vevet ble først løst i kaldt aceton (§ 2.1.3) og beiset med ACTN4, vimentin, DAPI, og WGA. Sammenligning av forhånds utvidelse (ikke vist) og bilder etter utvidelse indikerer en Utvidelses faktor på 4,5. Sammenlignings data fra aceton-faste frosne nyre prøver som i FFPE prøvene (Figur 4C, E) viser at det er en NEDGANG i kvaliteten på ACTN4 FARGING i den utvidede FFPE prøven, som kan skyldes en degradering av antigenisiteten på grunn av fikserings metoden16.
Figur 1: skjematisk av arbeidsflyten for Utvidelses patologi (ExPath). Pre-prosessering av klinisk arkiverte vev lysbilder først utføres basert på lagringsformat. Prøvene blir deretter farget ved hjelp av konvensjonelle immunostaining protokoller og pre-ekspansjon bilder er innhentet. Prøvene blir deretter behandlet med akryl-X SE (AcX) for å forankre proteiner til hydrogel. In situ polymerisering er preformed før mekanisk homogenisering ved hjelp av proteinase K (ProK). Prøvene kan deretter utvides i ddH2O før bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gelation kammer for patologi prøver. (A) to avstandsstykker, slik som to stykker av #1 .5 deksel glass kuttet med en diamant kniv, er plassert på hver side av vevet etter incubating prøven i gelling løsning ved 4 ° c. Avstandsstykker skal være tykkere enn vevet skiver, for å hindre komprimering av prøven. (B) et lokk, for eksempel et #1 .5 deksel glass, brukes til å dekke prøven før inkubasjons ved 37 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempel på utvidelse av prøven. En 5 μm tykk nyre prøve innlegg homogenisering, (A) pre-og (B) post-ekspansjon i ddH2O vises. Rutenettrutene er 5 mm x 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater fra 5 μm TYKKE FFPE nyre prøver. (A) pre-utvidet bilde. (B) forstørret pre-ekspansjon bilde av den skisserte regionen av interesse i panel A og (C) tilsvarende post-ekspansjon bilde av samme region av interesse etter at prøven ble fullstendig utvidet i vann. (D) forstørret bilde av det disponerte interesseområdet i panel B og (E) det tilsvarende post Utvidelses bildet av samme interesseområde etter at prøven ble fullstendig utvidet i vann. Sprekker, forvrengninger og tap av merkede mål kan være et resultat av utilstrekkelig forankring og/eller homogenisering (F, G). Alle bilder ble innhentet ved hjelp av en spinnende disk konfokalmikroskopi mikroskop med en 20x (NA 0,95; vann nedsenking) objektiv (a-E, G) eller 10X (na 0,5) objektiv (F). Blå, DAPI; grønn, vimentin; rød, alpha-actinin 4 (ACTN4); magenta, WGA. Skala bars = 100 μm (A, F, G, gul skala barer indikere post-ekspansjon bilder); 50 μm (B), 50 μm (C, fysisk størrelse etter ekspansjon 225 μm; Utvidelses faktor 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, fysisk størrelse etter ekspansjon 112,5 μm; ekspansjons faktor 4,5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative resultater fra H &Amp; E farget normalt brystvevet. (A) Brightfield bilde av pre-expanded H & E farget vev tatt med en 40x (0,95 na) objektiv. (B) post-ekspansjon DAPI bilde av samme område av interesse etter at prøven ble fullstendig utvidet i vann. Bildet ble innhentet på en roterende disk konfokalmikroskopi mikroskop ved hjelp av en 40x (NA 1,15; vann nedsenking) mål. Skala bars = 10 μm (A, den gule skalaen linjen indikerer post-ekspansjon bilder) og 2 μm (B, fysisk størrelse post ekspansjon 50,1 μm; Utvidelses faktor 5,1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representative resultater av ferske frosne nyre prøver etter ekspansjon, innhentet på en spinnende disk konfokalmikroskopi mikroskop med en 40x (NA 1,15; vann nedsenking) mål. Blå = vimentin; grønn = alpha-actinin 4 (ACTN4); rød = kollagen IV; Grey = DAPI. Scale bar = 10 μm (fysisk størrelse etter ekspansjon 45 μm; ekspansjons faktor 4,5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Stock konsentrasjon | Lager volum (mL) | Endelig konsentrasjon | Slutt beløp per 10 mL |
| Natrium akrylat | 0,380 g/mL | 2,25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Akrylamid | 0,500 g/mL | 0,50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N, N′-Methylenebisacrylamide | 0,020 g/mL | 0,50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| Natriumklorid | 0,292 g/mL | 4,00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x | 1,00 | 1x | 1x |
| Vann | 1,15 | |||
| Totalt volum | 9,40 |
Tabell 1: komponenter i monomer løsning. Alle konsentrasjoner er gitt i form av g/mL (w/v) unntatt PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan brukes på de vanligste typene klinisk biopsi prøvene brukes i patologi, inkludert FFPE, H & E beiset, og fersk-frosne eksemplarer på glass lysbilder. Format konvertering, antigen gjenfinning, og immunostaining av prøvene følger ofte brukte protokoller som ikke er spesifikke for ExPath. I motsetning til den opprinnelige proExM protokollen9, ExPath avhengig av en høyere konsentrasjon av EDTA i fordøyelsen buffer, noe som forbedrer utvidelsen av formalin vev, som demonstrert i den opprinnelige ExPath studien16. Protokollen er validert i 5 − 10 μm tykke kliniske prøver16, men kan også brukes på tykkere vevsprøver med noen endringer. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er: 1) tidspunktet for de gelation trinnene; 2) oppsett av gelation kammeret; 3) parametere for prøve homogenisering; og 4) håndtering av gelen.
Den mest kritiske parameteren for denne protokollen er tidspunktet for de gelation trinnene. Hvis den gelling løsningen for tidlig polymeriseres, vil prøven ikke være tilstrekkelig forankret til gel matrise. Utilstrekkelig forankring og for tidlig gelation kan forårsake forvrengninger, begrense ekspansjon og føre til tap av målmolekyler (Figur 4F, G). Initiering av gelation er temperatur avhengig, derfor er det viktig å holde den blandede gelling oppløsningen ved 4 ° c før du plasserer den på mål prøven. Initiativtaker, APS, skal tilberedes og legges til umiddelbart før den gelling løsningen tas i bruk. APS er ikke stabil ved RT og kan miste effekt etter å ha gjennomgått fryse-tine sykluser. Utilstrekkelig forankring kan også være et resultat av redusert reaktivitet av forankrings forbindelsen, AcX, som kan miste aktivitet etter langtidslagring eller etter kontakt med vann. AcX har blitt funnet å beholde aktivitet etter 6 måneders lagring i et desiccated miljø ved-20 ° c. Hvis prematur gelation er ikke den mistenkte årsaken til forvrengning, en ny lagerløsning av AcX kan tilberedes.
Under oppsettet av gelation kammeret, kan luftbobler bli fanget under dekselet glass lokket. Hvis disse boblene er oppå eller direkte berører prøven, kan de forårsake forvrengninger. De kan flyttes bort fra prøven ved å legge til mer gelling løsning gjennom siden av kammeret. For å hindre luftbobler, kan en liten dråpe gelling løsning avsettes på lokket før du plasserer den over vevet.
Eksempel på fordøyelsen er avhengig av tid, temperatur, samt vev egenskaper, som tykkelse og vev type. Utilstrekkelig fordøyelse kan også forårsake forvrengninger og resultere i en Utvidelses faktor som er mindre enn forventet. Hvis ufullstendig fordøyelse mistenkes, kan fordøyelsen tid og/eller ProK konsentrasjon økes, spesielt i tilfelle av tykkere vev. ProK kan også miste aktivitet over tid. For å bevare sin aktivitet bør ProK oppbevares ved-20 ° c og kan aliquoted i mindre volumer for å unngå fri-tine-sykluser.
Forsiktighet bør utvises ved håndtering av homogenisert prøver, spesielt når det er fullt utvidet. Hvis prøven er vanskelig å finne når neddykket i væske, belyse beholderen fra forskjellige vinkler kan spre hendelsen lys for å tillate visualisering av gel. Fullt utvidet gels er skjøre og kan brekke under håndtering. Bruk av myke børster og plast spatler anbefales å overføre den utvidede gels.
Den ExPath protokollen gir et kostnadseffektivt alternativ til dagens super-oppløsning Imaging og elektron mikroskopi teknikker for å forhøre nanoskala strukturer i kliniske biopsi eksemplarer. Selv om ProK gir enda utvidelse av prøven etter homogenisering, hindrer tap av proteiner avhør av andre mål av interesse etter ekspansjon. Protokollen kan imidlertid enkelt utføres i alle vanlige våte laboratorier. Viktigst, Imaging av nanoskala funksjoner kan utføres på konvensjonelle Wide-feltet eller konfokalmikroskopi mikroskop som vanligvis finnes i biologi laboratorier og Imaging Core anlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ og OB er to av de oppfinnere som har arkivert for og innhentet patent beskyttelse på en undergruppe av teknologiene som er beskrevet her (US patenter US20190064037A1, WO2018157074A1, og WO2018157048A1).
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av fakultetet oppstart fondet fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director ' s New innovatør Award (DP2 OD025926-01 til YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
