Summary
Nanoskalig avbildning av kliniska vävnadsprover kan förbättra förståelsen av sjukdomens patogenes. Expansion patologi är en version av expansionsmikroskopi (ExM), modifierad för kompatibilitet med vanliga kliniska vävnadsprover, för att utforska nanoskalens konfiguration av biomolekyler med konventionella diffraktions begränsade Mikroskop.
Abstract
I modern patologi spelar optisk mikroskopi en viktig roll vid sjukdomsdiagnos genom att avslöja mikroskopiska strukturer av kliniska prover. Men den grundläggande fysiska diffraktionsgränsen förhindrar förhör av nanoskala anatomi och subtila patologiska förändringar när man använder konventionella optiska Imaging metoder. Här beskriver vi ett enkelt och billigt protokoll, kallad expansion patologi (ExPath), för nanoskala optisk avbildning av vanliga typer av kliniska primär vävnad prover, inklusive både fast frysta eller formalin-fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad Sektioner. Denna metod kringtar den optiska diffraktionsgränsen genom att kemiskt omvandla vävnadsproverna till vävnad-hydrogel hybrid och fysiskt utvidga dem isotropically över flera skalor i rent vatten. På grund av expansion separeras tidigare oresolvable molekyler och kan därför observeras med hjälp av ett konventionellt optiskt mikroskop.
Introduction
Undersöka den molekylära organisationen av vävnader i en tredimensionell (3D) sammanhang kan ge ny förståelse för biologiska funktioner och sjukdomsutveckling. Dessa nanoskaliga miljöer ligger dock bortom upplösningen hos konventionella diffraktions begränsade Mikroskop (200 − 300 nm), där det minimala matchbara avståndet, d definieras av d α λ/na. Här är λ våglängden av ljus och na är den numeriska bländare (na) i bildsystemet. Nyligen har direkt visualisering av fluorescerande märkta molekyler möjliggjorts genom nyutvecklade super-resolution Imaging tekniker1,2,3, inklusive stimulerad emission utarmning (sted), fotoaktive rad lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktion, mikroskopi (STORM) och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM). Även om dessa avbildningstekniker har revolutionerat förståelsen av biologisk funktion i nanoskalan, i praktiken förlitar de sig ofta på dyr och/eller specialiserad utrustning och bildbehandlings steg, kan ha långsammare förvärvs tid jämfört med konventionell optisk avbildning, kräver fluoroforer med specifika egenskaper (t. ex. foto växlings förmåga och/eller hög foto stabilitet). Dessutom är det fortfarande en utmaning att utföra 3D super-upplösning Imaging på vävnadsprover.
Expansion mikroskopi (EXM), som först infördes i 20154, ger ett alternativt sätt att Imaging nanoskala funktioner (< 70 nm) genom att fysiskt utvidga bevarade prover inbäddade i en väll polyelektrolyt hydrogel. Här är viktiga biomolekyler och/eller etiketter förankrade på plats till ett polymernät som kan utökas isotopiskt efter kemisk bearbetning. Eftersom den fysiska expansionen ökar den totala effektiva upplösningen kan molekyler av intresse sedan lösas med konventionella diffraktions-begränsade avbildningssystem. Sedan offentliggörandet av det ursprungliga protokollet, där anpassade syntetiserade fluorescerande etiketter var förankrade till polymer Network4, nya strategier har använts för att direkt förankra proteiner (protein retention EXM, eller proExM)5, 6,7,8,9 och RNA9,10,11,12 till Hydrogelen och öka den fysiska förstoringen genom iterativ expansion13 eller anpassning av gel kemin8,14,15.
Här presenterar vi en anpassad version av proExM, kallad expansion patologi (ExPath)16, som har optimerats för kliniska patologi format. Protokollet omvandlar kliniska prover, inklusive formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE), hematoxylin och eosin (H & E) färgade, och färskt frysta mänskliga vävnadsprover monterade på glas diabilder, i en stat som är kompatibel med ExM. Proteiner är sedan förankrade till hydrogel och mekanisk homogenisering utförs (figur 1)16. Med en 4-faldig linjär expansion av proverna, Multicolor super-resolution (~ 70 nm) bilder kan erhållas med hjälp av en konventionell konfokal Mikroskop med endast en ~ 300 nm upplösning och kan också kombineras med andra super-upplösning Imaging tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av stam reagenser och lösningar
-
Förbered gelbildande-lösningskomponenter.
Obs: lösningskoncentrationer ges i g/ml (w/v procent).- Gör följande lagerlösningar: 38% (w/v) natriumakrylat (SA), 50% (w/v) akrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamide (BIS), och 29,2% (w/v) natriumklorid (NaCl). Lös upp föreningarna i dubbelt avjoniserat vatten (ddH2O). Använd beloppen i tabell 1 som referens. beredda lösningar kan skalas upp eller ned i volym efter behov. Till exempel, för att göra 10 mL av en 38% (w/v) SA lösning, tillsätt 1,9 g SA till en graderad 10 mL cylinder och tillsätt ddH2O till en volym av 5 ml.
- Bered 9,4 mL monomerlösning med en 1,06 x-koncentration som visas i tabell 1.
Anmärkning: Detta kommer att resultera i en 1x koncentration efter tillsats av initiativtagaren, Accelerator, och inhibitor. Monomerbeståndet kan förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader eller vid-20 ° c för långtidsförvaring. - Bered följande lagerlösningar separat i DDH2O: 0,5% (w/v) av inhibitor 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4ht), som hämmar gelation för att möjliggöra diffusion av gelbildande Solution i vävnader, 10% (v/v) av initierare tetrametylethylendiamin (TEMED), som påskyndar radikal generering av ammoniumpersulfat (APS), och 10% (w/v) APS som initierar gelbildande processen.
Anmärkning: Stamlösningar av 4HT och TEMED kan beredas i 1 mL-portioner och förvaras vid-20 ° c i minst 6 månader. APS har visat sig förlora effekt efter långtidslagring och är bäst förberedd i små mängder (< 0,1 mL) omedelbart före Gelling.
- Förbered rötnings buffert (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] nonioniskt ytaktivt ämne, 0,8 M NaCl) genom att kombinera 25 mL 1 M Tris pH 8 (3,03 g av Tris bas i 25 mL ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g nonioniskt ytaktivt ämne och 23,38 g NaCl. Tillsätt ddH2O för en total volym på 500 ml.
Anmärkning: Lösningen kan skalas upp eller ner efter behov och förvaras i vid 4 ° c. Proteinas K (ProK) kommer att tillsättas omedelbart före digestionssteget. - Förbered 20 mM natriumcitratlösning genom att kombinera 2,941 g natriumcitrat tribasisk dihydrat med 500 mL ddH2O och justera pH till 8,0 vid rumstemperatur (RT). Skala lagervolymen efter behov.
- Förbered en stamlösning av 6-((akryloyl) amino) hexanoic syra, succinimidyl Ester (akryloyl-X, SE; AcX), förankrings substansen. Lös AcX i 500 μL vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) för en slutlig koncentration på 10 mg/mL.
Anmärkning: Lösningen kan förvaras i en adsorperad miljö vid-20 ° c i 20 μL-portioner. - Om du inte använder kommersiellt tillgängliga buffertar för immunofärgning, Förbered blockeringsbuffert. Använd en blockerande buffert på 5% (v/v) normalt djur serum och 0,1% (w/v) nonioniskt ytaktivt ämne i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och välj serum baserat på värddjuret för de sekundära antikropparna. För att till exempel förbereda 500 mL blockeringsbuffert för antikroppar som föds upp i get, kombinera 25 mL get serum, 0,45 g nonioniskt ytaktivt ämne och 1x PBS till en volym av 500 mL.
2. beredning av arkiverade och nyberedda kliniska vävnad diabilder för ExPath
- Omvandla vävnaden till ett ExPath-kompatibelt format. Välj ett av följande fyra steg (2.1.1 − 2.1.4) baserat på hur preparatet preparerades: FFPE-glas, färgade FFPE-glas eller ofixerade eller fasta frysta vävnads diabilder i optimal skärtemperatur (ULT) lösning.
Obs: dessa är baserade på standard återställningssteg för patologi prover och är inte specifika för ExPath-protokollet.- FFPE kliniska prover
- Bered 30 mL 95% etanol, 70% etanol och 50% etanol. Mät upp 30 mL xylen, 100% etanol och ddH2O.
- Placera bilden med provet i en 50 mL konisk med hjälp av pinkoppar och tillsätt 15 mL xylen. Locket röret och placera den horisontellt på en orbital shaker vid cirka 60 rpm och inkubera vid RT för 3 min för varje lösning. Upprepa med resterande 15 mL xylen.
- Upprepa steg 2.1.1.2 med 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol och ddH2O i stället för xylen.
- Färgade och monterade permanenta diabilder
- Placera bilden i en 100 mm petriskål och täck med xylen. Ta försiktigt bort täckslip med hjälp av ett rakblad. Om täckglaset inte är lätt att ta bort, returnera bilden till xylen tills täckglaset lossnar.
- Processen med hjälp av stegen för FFPE-prov (steg 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
Anmärkning: När det gäller H & E färgade diabilder, fläckarna elimineras under expansionsprocessen.
- Ofixerade frysta vävnad diabilder i OCT lösning
- Fixera vävnaden i aceton vid-20 ° c i 10 min.
- Tvätta proverna med 1x PBS-lösning 3 gånger i 10 minuter vardera vid RT.
- Tidigare fasta, frysta kliniska vävnads diabilder
- Inkubera bilderna i 2 minuter vid RT för att smälta ULT-lösningen.
- Tvätta provet med 1x PBS-lösning 3 gånger i 5 minuter vardera vid RT.
- FFPE kliniska prover
- Utför värmebehandling för antigen hämtning på alla prover efter format konvertering.
- Tillsätt 20 mM citratlösning (pH 8 vid RT) i en värmetålig behållare, till exempel en bild färgning burk.
Anmärkning: Det bör finnas tillräckligt med lösning för att täcka den vävnad som är monterad på bilden (50 mL för en standardbild färgning burk). - Värm citratlösningen till 100 ° c i mikrovågsugnen och placera bilden i lösningen. Överför omedelbart behållaren till en inkubations kammare och inkubera vid 60 ° c i 30 min.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Diabilder kan placeras i petriskålar och täcks i 1x PBS och förvaras vid 4 ° c.
- Tillsätt 20 mM citratlösning (pH 8 vid RT) i en värmetålig behållare, till exempel en bild färgning burk.
- Färga provet med hjälp av standardiserade immunofluorescensfärgningsprotokoll (IF)/immunohistokemi (IHC).
Anmärkning: specifika primära och sekundära antikropps koncentrationer och färgning varaktigheter är beroende av de koncentrationer som föreslagits av tillverkaren eller genom optimering för det specifika experimentet.- Använd en hydrofoba penna för att dra en gräns runt vävnaden avsnitt på bilden för att minimera den mängd lösning som behövs för att täcka vävnaden. Placera bilden i en skål som är tillräckligt stor för att passa bilden. För en standard 3-tums Slide, Använd en 100 mm petriskål.
Anmärkning: Den hydrofoba pennan stör inte polymerisation av provet eller rötningsprocessen. - Inkubera vävnaden med blockerande buffert för 1 h vid 37 ° c, 2 h vid RT eller 4 ° c över natten för att reducera icke-specifik bindning.
- Späd primära antikroppar mot den önskade koncentrationen i lämplig mängd beredd blockeringsbuffert (eller annan föredragen färgbuffert). Inkubera vävnaderna med den primära antikroppslösningen i minst 3 timmar vid RT eller 37 ° c, eller över natten vid 4 ° c.
Anmärkning: Proverna ska placeras i en fuktad behållare (t. ex. en petriskål med fuktig torka) för att förhindra att vävnaden torkar ut. Vanligtvis har antikroppar späddes till 1:100 − 1:500 i 200 − 500 μL buffert, beroende på den vävnads storlek och antikropp som används. - Tvätta vävnaden med förberedd blockeringsbuffert (eller annan önskad tvättbuffert) 3 gånger i 10 minuter vid RT.
- Späd sekundära antikroppar (och 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] om så önskas), i förberedd blockeringsbuffert (eller annan föredragen färgbuffert) till en koncentration på cirka 10 μg/mL. Inkubera vävnaden i den sekundära antikroppslösningen i minst 1 h vid RT eller 37 ° c.
Anmärkning: Timing kan justeras beroende på vilka antikroppar som används och tjockleken på vävnaden. Sekundära antikroppar som innehåller cyanine-färgämnen (Cy3, Cy5, Alexa 647) är inte kompatibla med ExM-protokollet vid tillämpad prepolymerisation. Föreslagna färgämnen inkluderar Alexa 488 (grön), Alexa 546 (orange/röd), och Atto 647N eller CF633 (långt-röd). DAPI måste appliceras på nytt efter expansion, eftersom det tvättas bort under expansionsprocessen. - Tvätta vävnaden med förberedd blockeringsbuffert (eller annan önskad tvättbuffert) 3 gånger för 10 min vardera vid RT.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Diabilder kan placeras i petriskålar och täcks i 1x PBS och förvaras vid 4 ° c. - Utför fluorescerande avbildning med ett konventionellt brett fält Mikroskop, konfokalmikroskop eller annat avbildningssystem som du väljer.
Anmärkning: Detta steg krävs för att bestämma biologisk längd med hjälp av expansions faktorn genom att jämföra pre-och post-expansion bilder. För att underlätta efter expansion Imaging, bör lätt identifierbara regioner av intresse väljas och bilder på både låg och hög förstoring bör samlas in.
- Använd en hydrofoba penna för att dra en gräns runt vävnaden avsnitt på bilden för att minimera den mängd lösning som behövs för att täcka vävnaden. Placera bilden i en skål som är tillräckligt stor för att passa bilden. För en standard 3-tums Slide, Använd en 100 mm petriskål.
3. in situ-polymerisation av prover
-
Inkubera preparatet i förankra lösningen.
- Bered förankrings lösningen (typiskt 250 μL räcker för att täcka vävnads sektionen) genom att späda AcX-lagerlösningen i 1x PBS till en koncentration av 0,03 mg/mL för prover som är fasta med fixeringsmedel för icke-aldehyd eller 0,1 mg/mL för prover som är fasta med aldehydfixativ , som har färre fria aminer tillgängliga för att reagera med AcX.
- Placera bilden i en 100 mm petriskål och Pipettera förankrings lösningen över vävnaden. Inkubera i minst 3 timmar vid RT eller över natten vid 4 ° c.
-
Inkubera proverna i gelbildande Solution.
- Bered minst 100-faldig överskottsvolym av gelbildande Solution. Per 200 μL, kombinera följande, i ordning: 188 μL monomerlösning, 4 μL 0,5% 4HT stamlösning (1:50 spädning, slutkoncentration: 0,01%), 4 μL 10% TEMED stamlösning (1:50 utspädning, slutlig koncentration 0,2%) och 4 μL 10% APS stamlösning (1:50 utspädning, slutlig koncentration 0,2%).
Anmärkning: Gelling Solution ska göras omedelbart före användning. Lösningen bör hållas vid 4 ° c och APS-lösningen bör läggas till sist, för att förhindra för tidig Gelling. - Ta bort överflödig lösning från vävnads sektionen och placera bilden i en 100 mm petriskål. Tillsätt färsk, kall gelbildande lösning till provet och inkubera blandningen på vävnaden i 30 min vid 4 ° c, för att medge spridning av lösningen i vävnaden.
- Bered minst 100-faldig överskottsvolym av gelbildande Solution. Per 200 μL, kombinera följande, i ordning: 188 μL monomerlösning, 4 μL 0,5% 4HT stamlösning (1:50 spädning, slutkoncentration: 0,01%), 4 μL 10% TEMED stamlösning (1:50 utspädning, slutlig koncentration 0,2%) och 4 μL 10% APS stamlösning (1:50 utspädning, slutlig koncentration 0,2%).
-
Konstruera en kammare på bilden runt provet (figur 2a) utan att störa gelbildande-lösningen.
- Gör distanserna för gelbildande Chamber genom att tunt skära bitar av täckglas med hjälp av en diamantkniv.
Anmärkning: För att underlätta Imaging post expansion bör distaner vara nära i tjocklek till vävnadsprov för att minska mängden av blank gel ovanför vävnaden. Nummer 1,5 glas kan användas för standardiserade kliniska prover (5 − 10 μm). Täck glasbitar kan staplas för tjockare prover. - Fäst distansarna på vardera sidan av vävnaden med hjälp av vattendroppar (~ 10 μL).
- Placera försiktigt ett täckglaslock över bilden och se till att du undviker att fånga upp luftbubblor över vävnaden (figur 2B).
- Gör distanserna för gelbildande Chamber genom att tunt skära bitar av täckglas med hjälp av en diamantkniv.
- Inkubera provet vid 37 ° c i en fuktad miljö (t. ex. en sluten petriskål med fuktig tork) i 2 timmar.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. Bild kammaren kan förvaras inuti en förseglad petriskål vid 4 ° c.
4. prov matsmältning
-
Ta bort locket på geleringskammaren genom att försiktigt skjuta ett rakblad under täckglaset och sakta lyfta täckglaset från gelytan. Trimma den tomma gelen runt vävnaden för att minimera volymen. Skär gelen asymmetriskt för att spåra riktningen av gelen efter homogenisering, eftersom provet kommer att bli transparent.
- Späd ProK med 1:200 i digestionsbufferten (slutlig koncentration 4 U/mL) före användning. Förbered tillräckligt med lösning för att helt dränera gelen; en enda brunn av en fyra-brunn plast cellkultur tallrik behöver minst 3 mL per brunn.
- Inkubera provet i en sluten behållare som innehåller digestionsbufferten i 3 h vid 60 ° c. Om provet inte lossnar från bilden under matsmältningen, Använd ett rakblad för att försiktigt ta bort provet.
Anmärkning: Preparatet bör vara helt nedsänkt i rötnings buffert för att förhindra att provet torkar ut och placeras i en täckt behållare (liten Slide Box, plast väl, petriskål, etc.) som kan förseglas med film.
5. prov expansion och bildbehandling
- Använd en mjuk pensel för att överföra preparatet till 1x PBS i en behållare som är kompatibel med det önskade avbildnings systemet och tillräckligt stort för att rymma den helt expanderade gelen. Se till att vävnaden är placerad med prov-sidan nedåt om avbildning på ett inverterat system eller upp om avbildning på ett upprätt system för att minimera avståndet från bild målet till provet. Vänd gelen med en mjuk pensel om det behövs.
Anmärkning: Sido belysningen från en lysdiod kan användas för att göra dem synliga i vätska. En standard 6-brunn plattan kan rymma prover som har en förexpanderad diameter mindre än 0,6 cm. En glasbotten brunn plattan bör användas för avbildning på ett inverterat system. - Tvätta proverna i 1x PBS vid RT i 10 minuter. Om så önskas, re-Stain provet med 300 nM DAPI som digestionsprocessen tvättar bort DAPI fläcken. Ta bort PBS och fläcken med 300 nM DAPI utspädd i 1x PBS för 20 min vid RT, följt av en 10 min tvätta med 1x PBS vid RT.
Anmärkning: Proverna kan täckas med 1x PBS och förvaras vid 4 ° c innan du fortsätter till nästa steg. - För att expandera proverna, Byt ut PBS och tvätta med en överskottsvolym av ddH2O (minst 10X den slutliga gel volymen) 3 − 5 gånger för 10 min vardera, vid RT.
Anmärkning: Efter 3RD eller 4: e tvätt, bör preparens expansion börja platå. För lagring, för att förhindra bakterietillväxt, ddH2O kan kompletteras med 0,002% − 0,01% natriumazid (Nan3). I detta fall reduceras den slutliga expansions faktorn reversibelt med 10%. - Utför fluorescensavbildning med ett konventionellt brett fält Mikroskop, konfokalmikroskop eller annat avbildningssystem som du väljer.
Anmärkning: För att förhindra att geler från drivande, överflödig vätska kan avlägsnas från brunnen. Geler kan också immobiliseras med 1,5 − 2% låg smält aguppstod. Förbered 1,5 − 2% (w/v) låg smält aguppstod i vatten i en behållare 2 − 4 gånger volymen av lösningen. Värm lösningen i en 40 ° c vattenbad eller i en mikrovågsugn för 10 − 20 s att smälta lösningen. Pipettera den smälta aguppstod runt kanterna på gelen. Tillsätt vatten till provet efter att ha fått Agreste att härda vid RT eller 4 ° c för att förhindra uttorkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om protokollet har genomförts framgångsrikt (figur 1), kommer proverna att visas som en platt och transparent gel efter mekanisk homogenisering (figur 3a) och kan utökas med en faktor på 3 − 4,5 x i vatten (figur 3B). ger en effektiv upplösning på ~ 70 nm beroende på den slutliga expansions faktorn och Imaging system som används5,16. Figur 4 visar exempel bilder av en 5 ΜM tjock FFPE njure prov bearbetas med hjälp av expath protokollet. Full expansion av de geléartad proverna resulterade i en 4,5 x expansions faktor i vatten, vilket ger en effektiv upplösning på ~ 63 nm när avbildas med en 0,95 na mål. Vävnaden förbehandlades först med xylen för att avlägsna paraffin och rehydrerat (avsnitt 2.1.1), följt av antigen-hämtning med citratbufferten (avsnitt 2,2). Den återvunna vävnaden var sedan färgas med antikroppar för alpha-actinin 4 (ACTN4) och vimentin, tillsammans med DAPI för att visualisera kärn-DNA och vetegroddar kall (WGA), att märka kolhydrater. Preparatet avbildades sedan med ett snurrande disk konfokalmikroskop (figur 4a, B, D). Vävnader behandlades enligt ovanstående protokoll och helt expanderat i vatten (figur 4C, E). På samma sätt visar figur 5 exempel bilder av H & E färgade normal bröstvävnad (figur 5A) som behandlades med xylen (avsnitt 2.1.2) för att ta bort täckglaset och sedan behandlas som ett FFPE-prov (avsnitt 2.1.1). Under homogenisering elimineras H & E fläcken från vävnaden. Efter expansion bilder av DAPI målat prov erhålls på en snurrande disk konfokal Mikroskop (figur 5B) jämfört med pre-expansion bilder indikerar en expansions faktor 5,1, vilket ger en effektiv upplösning på ~ 43 nm när avbildas med ett NA 1,15-objektiv.
Exempeldata för ofixerade frysta njurskivor som bearbetas med ExPath-protokollet kan ses i figur 6. Vävnaden var först fast i kallt aceton (avsnitt 2.1.3) och färgas med ACTN4, vimentin, DAPI, och WGA. Jämförelse av pre-expansion (visas inte) och efter expansion bilder indikerar en expansions faktor 4,5. Jämförelsedata från de aceton-fasta frysta njurproverna till FFPE-proverna (figur 4C, E) visar att det finns en försämrad kvalitet på ACTN4 färgning i det expanderade FFPE-provet, vilket kan bero på en försämring av antigenicitet på grund av fixeringsmetoden16.
Figur 1: schematiskt för arbetsflödet expansion patologi (ExPath). Förbehandling av kliniskt arkiverade vävnads bilder utförs först baserat på lagringsformatet. Proverna färgas sedan med hjälp av konventionella immunfärgnings protokoll och pre-expansion bilder erhålls. Proverna behandlas sedan med akryloyl-X SE (AcX) för att förankra proteiner till Hydrogelen. In situ polymerisation är förformad före mekanisk homogenisering med proteinas K (ProK). Proverna kan sedan utökas i ddH2O före avbildning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Gelations kammare för patologi prov. A) två distanserna, till exempel två stycken #1,5 täckglas med en diamantkniv, placeras på vardera sidan av vävnaden efter att provet inkuberas i gelbildande Solution vid 4 ° c. Distaner bör vara tjockare än vävnaden skivor, för att förhindra komprimering av provet. B) ett lock, såsom ett stycke #1.,5 täckglas, används för att täcka provet före inkubering vid 37 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på utökning av provet. En 5 μm tjock njure prov efter homogenisering, (a) pre-och (B) efter expansion i DDH2O visas. Rutnäts rutorna är 5 mm x 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat från 5 μm tjocka FFPE-njurprover. (A) förexpanderad bild. B) förstorad för expansions bild av det konturerade området av intresse i panel A ochC) motsvarande efter expansions bild av samma intresse region efter det att provet har expanderats helt i vatten. D) en förstorad bild av det konturerade området av intresse i panel B oche) motsvarande efter expansions bild av samma intresse region efter det att provet har expanderats helt i vatten. Sprickbildning, förvrängningar och förlust av märkta mål kan vara resultatet av otillräcklig förankring och/eller homogenisering (F, G). Alla bilder erhölls med hjälp av en snurrande disk konfokala Mikroskop med en 20x (NA 0,95; vatten nedsänkning) mål (a-E, G) eller 10X (na 0,5) mål (F). Blått, DAPI; grön, vimentin; röd, alfa-actinin 4 (ACTN4); magenta, WGA. Skalstreck = 100 μm (A, F, G, gula staplar indikerar efter expansions bilder); 50 μm (B), 50 μm (C, fysisk storlek efter expansion 225 μm; expansions faktor 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, fysisk storlek efter expansion 112,5 μm; expansions faktor 4,5). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa resultat från H &Amp; E färgade normal bröstvävnad. (A) brightfield bild av pre-expanderad H & E färgade vävnad tagna med en 40x (0,95 na) mål. B) DAPI-avbildning efter expansion av samma intresse region efter det att provet har expanderats helt i vatten. Bilden erhölls på en snurrande disk konfokala Mikroskop med hjälp av en 40x (NA 1,15; vatten nedsänkning) mål. Skalstreck = 10 μm (A, den gula skalstreck indikerar efter expansion bilder) och 2 μm (B, fysisk storlek efter expansion 50,1 μm; expansions faktor 5,1). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa resultat av färska frysta njurprover efter expansion, erhållna på en snurrande disk konfokalmikroskop med en 40x (NA 1,15; vatten nedsänkning) mål. Blå = vimentin; grön = alfa-actinin 4 (ACTN4); röd = kollagen IV; Grey = DAPI. Scale bar = 10 μm (fysisk storlek efter expansion 45 μm; expansions faktor 4,5). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Lager koncentration | Lagervolym (mL) | Slutliga koncentrationen | Slutligt belopp per 10 mL |
| Natriumakrylat | 0,380 g/mL | 2,25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Akrylamid | 0,500 g/mL | 0,50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N, N′-Methylenebisacrylamid | 0,020 g/mL | 0,50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| Natriumklorid | 0,292 g/mL | 4,00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10X | 1,00 | 1x | 1x |
| Vatten | 1,15 | |||
| Total volym | 9,40 |
Tabell 1: komponenter i monomerlösningen. Alla koncentrationer ges i termer av g/mL (w/v) utom PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan appliceras på de vanligaste typerna av kliniska biopsi prover som används i patologi, inklusive ffpe, H & E färgade, och färska frysta exemplar på glas diabilder. Format konvertering, antigen hämtning och immunofärgning av proverna följer vanliga protokoll som inte är specifika för ExPath. Till skillnad från den ursprungliga proExM protokoll9, expath förlitar sig på en högre koncentration av EDTA i rötnings bufferten, vilket förbättrar utbyggnaden av formalin-fasta vävnader, vilket framgår av den ursprungliga expath studie16. Protokollet har validerats i 5 − 10 μm tjocka kliniska prover16, men kan också appliceras på tjockare vävnadsprover med viss modifiering. De mest kritiska stegen i detta protokoll är: 1) tidpunkten för geleringsstegen. 2) inställning av gelations kammaren; 3) parametrar för prov homogenisering; och 4) hantering av gelen.
Den mest kritiska parametern för detta protokoll är tidpunkten för gelations stegen. Om gelbildande Solution Polymeriserar i förtid, kommer provet inte att vara tillräckligt förankrat i gelmatrisen. Otillräcklig förankring och för tidig gelation kan orsaka snedvridningar, begränsa expansionen och resultera i förlust av målmolekyler (figur 4F, G). Initiering av gelering är temperaturberoende, därför är det viktigt att hålla den blandade gelbildande Solution vid 4 ° c innan den placeras på mål preparatet. Initiativtagaren, APS, bör vara nyberedd och läggas omedelbart innan den gelbildande lösning. APS är inte stabilt vid RT och kan förlora effekt efter att ha genomgått frys-Tina cykler. Otillräcklig förankring kan också vara resultatet av minskad reaktivitet av förankrings substansen, AcX, som kan förlora aktivitet efter långtidsförvaring eller efter kontakt med vatten. AcX har befunnits behålla aktiviteten efter 6 månaders lagring i en Desiccated miljö vid-20 ° c. Om för tidig gelation inte är den misstänkta orsaken till distorsion, kan en ny stamlösning av AcX förberedas.
Under installationen av gelation kammaren, kan luftbubblor fastna under locket glaslocket. Om dessa bubblor är ovanpå eller direkt vidrör provet, kan de orsaka snedvridningar. De kan flyttas bort från preparatet genom att lägga till mer gelbildande lösning genom sidan av kammaren. För att förhindra luftbubblor, en liten droppe gelbildande lösning kan deponeras på locket innan du placerar den över vävnaden.
Prov matsmältningen är beroende av tid, temperatur, samt vävnads egenskaper, såsom tjocklek och vävnadstyp. Otillräcklig matsmältning kan också orsaka snedvridningar och resultera i en expansions faktor som är mindre än förväntat. Om ofullständig matsmältning misstänks, kan digestionstiden och/eller ProK koncentrationen ökas, särskilt när det gäller tjockare vävnader. ProK kan också förlora aktivitet över tid. För att bevara sin verksamhet, bör ProK förvaras vid-20 ° c och kan aliciteras i mindre volymer för att undvika fritining cykler.
Försiktighet bör iakttas vid hantering av homogeniserade prover, särskilt när den är helt expanderad. Om preparatet är svårt att lokalisera när det är nedsänkt i vätska, lysande behållaren från olika vinklar kan sprida infallande ljus för att möjliggöra visualisering av gelen. Helt expanderade geler är ömtåliga och kan brytas under hantering. Användning av mjuka borstar och plastspatlar rekommenderas att överföra de expanderade geler.
ExPath-protokollet ger ett kostnadseffektivt alternativ till nuvarande super-resolution Imaging och elektronmikroskopi tekniker för att förhöra nanoskala strukturer i kliniska biopsi prover. Även om ProK ger en jämn expansion av provet efter homogenisering, förhindrar förlusten av proteiner förhör av andra mål av intresse efter expansion. Protokollet kan dock enkelt utföras i alla vanliga våta labb. Viktigast av allt, avbildning av nanoskala funktioner kan utföras på konventionella wide-fält eller konfokala Mikroskop som är vanliga i biologi laboratorier och Imaging Core anläggningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ och OB är två av de uppfinnare som har ansökt om och erhållit patentskydd på en delmängd av de tekniker som beskrivs här (US patent US20190064037A1, WO2018157074A1 och WO2018157048A1).
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av fakultetens start fond från Carnegie Mellon University (YZ) och NIH Director ' s New Innovator Award (DP2 OD025926-01 till YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
