Summary
Nanoskala-billeddannelse af kliniske vævsprøver kan forbedre forståelsen af sygdoms patogenesen. Ekspansion patologi (expath) er en version af ekspansion mikroskopi (exm), modificeret for kompatibilitet med standard kliniske vævsprøver, at udforske nanoskala konfiguration af biomolekyler ved hjælp af konventionelle diffraktion begrænset mikroskoper.
Abstract
I moderne patologi, Optisk mikroskopi spiller en vigtig rolle i sygdoms diagnose ved at afsløre mikroskopiske strukturer af kliniske prøver. Men den grundlæggende fysiske diffraktion grænse forhindrer forhør af nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer, når du bruger konventionelle optiske Imaging tilgange. Her beskriver vi en enkel og billig protokol, kaldet ekspansions patologi (ExPath), til optisk billeddannelse i nanoskala af almindeligt forekommende typer af kliniske primær vævsprøver, herunder både fastfrosset eller formalin-fast paraffinindlejret (FFPE) væv Sektioner. Denne metode omgår den optiske diffraktions grænse ved kemisk omdannelse af vævsprøverne til vævs-hydrogel hybrid og fysisk udvidelse af dem isotropisk på tværs af flere skalaer i rent vand. På grund af ekspansion adskilles tidligere opløselige molekyler og kan derfor observeres ved hjælp af et konventionelt optisk mikroskop.
Introduction
Undersøge den molekylære organisering af væv i en tredimensionel (3D) kontekst kan give ny forståelse af biologiske funktioner og sygdomsudvikling. Disse nanoskala-miljøer ligger dog uden for opløsnings mulighederne i konventionelle diffraktions begrænsede mikroskoper (200 − 300 nm), hvor den minimale afstand, d er afgrænset af d α λ/na. Her λ er lysets bølgelængde og na er den numeriske blænde (Na) af billed systemet. For nylig er direkte visualisering af fluorescently mærkede molekyler blevet muliggjort af nyudviklede super opløsnings billedbehandlings teknikker1,2,3, herunder stimuleret udtynding af udledningen (sted), foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM), og struktureret belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse billeddiagnostiske teknikker har revolutioneret forståelsen af biologisk funktion på nanoskalaen, i praksis, de ofte er afhængige af dyre og/eller specialiseret udstyr og billedbehandling trin, kan have langsommere erhvervelse tid sammenlignet med konventionel optisk billeddannelse, kræver fluorophorer med særlige karakteristika (såsom foto-switching kapacitet og/eller høj foto stabilitet). Desuden er det fortsat en udfordring at udføre 3D super-resolution Imaging på vævsprøver.
Udvidelses mikroskopi (ExM), der først blev introduceret i 20154, giver et alternativt middel til nanoskala funktioner (< 70 nm) ved fysisk ekspanderende konserverede prøver indlejret i en swellable polyelektrolyt hydrogel. Her er vigtige biomolekyler og/eller etiketter forankret på stedet til et polymer netværk, der kan udvides isotopisk efter kemisk behandling. Fordi den fysiske ekspansion øger den samlede effektive opløsning, kan molekyler af interesse derefter løses ved hjælp af konventionelle diffraktion-begrænsede billedbehandlingssystemer. Siden offentliggørelsen af den oprindelige protokol, hvor brugerdefinerede syntetiseret fluorescerende etiketter blev forankret til polymer netværk4, nye strategier er blevet brugt til direkte anker proteiner (protein retention exm, eller proexm)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og øge fysiske forstørrelse gennem iterativ udvidelse13 eller tilpasning af gel-kemi8,14,15.
Her præsenterer vi en tilpasset version af proExM, kaldet ekspansion patologi (ExPath)16, som er blevet optimeret til kliniske patologiske formater. Protokollen omdanner kliniske prøver, herunder formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE), hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvede, og fersk frosne humane vævsprøver monteret på glas glider, ind i en tilstand, der er kompatibel med ExM. Proteiner er derefter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering udføres (figur 1)16. Med en 4-fold lineær udvidelse af prøverne, Flerfarvet super opløsning (~ 70 nm) billeder kan opnås ved hjælp af en konventionel Konfokal mikroskop har kun en ~ 300 Nm opløsning og kan også kombineres med andre super-resolution Imaging teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af Stam reagenser og-opløsninger
-
Klargør komponenter til gelerings-løsninger.
Bemærk: opløsning koncentrationer er angivet i g/ml (w/v procent).- Lav følgende stamopløsninger: 38% (w/v) natriumacrylat (SA), 50% (w/v) acrylamid (AA), 2% (w/v) N, N′-methylenebisacrylamid (BIS) og 29,2% (w/v) natriumchlorid (NaCl). Forbindelserne opløses i dobbelt deioniseret vand (ddH2O). Bruge beløbene i tabel 1 som reference forberedte løsninger kan skaleres op eller ned i volumen efter behov. For eksempel, at lave 10 mL af en 38% (w/v) SA opløsning, tilsættes 1,9 g SA til en gradueret 10 mL cylinder og tilsæt ddH2O til et volumen på 5 ml.
- Forbered 9,4 mL monomer opløsning ved en 1,06 x koncentration som vist i tabel 1.
Bemærk: Dette vil resultere i en 1x koncentration efter tilsætning af initiatoren, Accelerator, og inhibitor. Monomer bestanden kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder eller ved-20 °C ved langtidsopbevaring. - Følgende stamopløsninger fremstilles separat i DDH2O: 0,5% (w/v) af inhibitor 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4ht), som hæmmer gelering for at muliggøre diffusion af gelerings opløsningen i væv, 10% (v/v) af Initiatoren tetramethylethylenediamin (TEMED), som accelererer radikal generation af ammonium persulfat (APS), og 10% (w/v) ApS, der indleder gelerings processen.
Bemærk: Stamopløsninger på 4HT og TEMED kan tilberedes i 1 mL aliquoter og opbevares ved-20 °C i mindst 6 måneder. APS har været fundet at tabe effekt efter langtidsopbevaring og er bedst forberedt i små mængder (< 0,1 mL) umiddelbart før gelling.
- Forbered fordøjelses buffer (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] nonionisk overfladeaktivt stof, 0,8 M NaCl) ved at kombinere 25 mL af 1 M Tris pH 8 (3,03 g Tris base i 25 mL ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g nonionisk overfladeaktivt stof og 23,38 g NaCl. Der tilsættes ddH2O for et samlet volumen på 500 ml.
Bemærk: Opløsningen kan skaleres op eller ned efter behov og opbevares ved 4 °C. Proteinase K (ProK) vil blive tilsat umiddelbart før fordøjelsestrinnet. - Forbered 20 mM natriumcitrat opløsning ved at kombinere 2,941 g natriumcitrat tribasidihydrat med 500 mL ddH2O og justere pH til 8,0 ved stuetemperatur (RT). Skala mængden af bestanden efter behov.
- Forbered en stamopløsning af 6-((acryloyl) amino) hexanoinsyre, succinimidyl ester (acryloyl-X, SE; AcX), den forankrings forbindelse. AcX opløses i 500 μL vandfri dimethylsulfoxid (DMSO) for en endelig koncentration på 10 mg/mL.
Bemærk: Opløsningen kan opbevares i et udtørret miljø ved-20 °C i 20 μL aliquoter. - Hvis du ikke bruger kommercielt tilgængelige buffere til immun farvning, kan du forberede blokerende buffer. Brug en blokerende buffer på 5% (v/v) normalt dyre serum og 0,1% (w/v) nonionisk overfladeaktivt stof i 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS), og vælg serum baseret på værtsdyret af de sekundære antistoffer. For eksempel, at forberede 500 mL blokerende buffer for antistoffer rejst i ged, kombinere 25 mL ged serum, 0,45 g nonioniske overfladeaktive, og 1x PBS til et volumen på 500 mL.
2. forberedelse af arkiverede og frisk fremstillede kliniske vævs slides til ExPath
- Konverter vævet til et ExPath kompatibelt format. Vælg et af de fire følgende trin (2.1.1 − 2.1.4) på grundlag af, hvordan præparatet er udarbejdet: FFPE slides, farvede FFPE slides, eller ufaste eller faste frosne væv slides i optimal skæring temperatur (OCT) opløsning.
Bemærk: disse er baseret på standard genoprettelses trin for patologiske prøver og er ikke specifikke for ExPath-protokollen.- FFPE kliniske prøver
- Forbered 30 mL 95% ethanol, 70% ethanol og 50% ethanol. Mål 30 mL xylen, 100% ethanol og ddH2O.
- Placer diaset med prøven i en 50 mL konisk ved hjælp af pincet, og tilsæt 15 mL xylen. Rør røret og Placer det horisontalt på en orbital shaker på ca. 60 rpm og Inkuber ved RT i 3 min for hver opløsning. Gentag med de resterende 15 mL xylen.
- Gentag trin 2.1.1.2 med 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol og ddH2O i stedet for xylen.
- Farvede og monterede permanente slides
- Placer diaset i en 100 mm Petri skål, og dæk med xylen. Fjern forsigtigt dæksedlen med et barberblad. Hvis dæksedlen ikke er let at fjerne, skal du returnere sliden til xylen, indtil dækglas-loosens.
- Proces ved hjælp af trinnene for FFPE-prøver (trin 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
Bemærk: I tilfælde af H & E farvede slides, er pletter elimineret under ekspansions processen.
- Ikke fastfrosne væv slides i OLT løsning
- Fastgør vævet i acetone ved-20 °C i 10 min.
- Prøverne vaskes med 1x PBS opløsning 3 gange i 10 minutter hver på RT.
- Tidligere faste, frosne kliniske vævs slides
- Inkuber diasene i 2 minutter ved RT for at smelte OLT-løsningen.
- Prøven vaskes med 1x PBS-opløsning 3 gange i 5 minutter hver på RT.
- FFPE kliniske prøver
- Udfør varmebehandling for antigen hentning på alle prøver efter format konvertering.
- Der tilsættes 20 mM citratopløsning (pH 8 ved RT) i en varmebestandig beholder, f. eks.
Bemærk: Der bør være tilstrækkelig løsning til at dække vævet monteret på diaset (50 mL for en standard slide farvning jar). - Citrat opløsningen opvarmes til 100 °C i mikrobølgeovnen, og sliden placeres i opløsningen. Beholderen overføres straks til et inkubations kammer, og det inkubates ved 60 °C i 30 minutter.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Slides kan anbringes i Petri skåle og dækkes med 1x PBS og opbevares ved 4 °C.
- Der tilsættes 20 mM citratopløsning (pH 8 ved RT) i en varmebestandig beholder, f. eks.
- Stikprøven plette ved hjælp af standard immunofluorescens (IF)/immunohistochemistry (IHC) farvningsprotokoller.
Bemærk: specifikke primære og sekundære antistofkoncentrationer og farvnings varigheder afhænger af de koncentrationer, der foreslås af producenten, eller af optimering for det specifikke eksperiment.- Brug en hydrofobe pen til at tegne en grænse omkring vævs sektionen (erne) på diaset for at minimere den mængde opløsning, der er nødvendig for at dække vævet. Placer diaset i en skål, der er stor nok til at passe til diaset. For en standard 3-tommer slide, brug en 100 mm Petri skål.
Bemærk: Hydrofobe pennen forstyrrer ikke Polymeriseringen af prøven eller fordøjelsesprocessen. - Inkuber vævet med blokerende buffer i 1 time ved 37 °C, 2 timer ved RT eller 4 °C natten over for at reducere den uspecifikke binding.
- De primære antistoffer fortyndes til den ønskede koncentration i den passende mængde af den forberedte blokerende buffer (eller anden foretrukken farvnings buffer). Væv med den primære antistof opløsning inkubates i mindst 3 timer ved RT eller 37 °C eller natten over ved 4 °C.
Bemærk: Prøverne skal anbringes i en befugtet beholder (f. eks. en Petri skål med en fugtig serviet) for at forhindre, at vævet tørrer ud. Typisk er antistoffer blevet fortyndet til 1:100 − 1:500 i 200 − 500 μL buffer, afhængigt af vævs størrelse og antistof, der anvendes. - Vask vævet med forberedt blokerende buffer (eller anden foretrukken vaskebuffer) 3 gange i 10 minutter ved RT.
- Sekundære antistoffer fortyndes (og 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol [DAPI], hvis det ønskes), i en forberedt blokerende buffer (eller anden foretrukken farvnings buffer) til en koncentration på ca. 10 μg/mL. Væv i den sekundære antistof opløsning inkubates i mindst 1 time ved RT eller 37 °C.
Bemærk: Timing kan justeres afhængigt af de anvendte antistoffer og tykkelsen af vævet. Sekundære antistoffer, der indeholder cyanine-farvestoffer (Cy3, Cy5, Alexa 647), er ikke kompatible med ExM-protokollen, når de anvendes præ-polymerisering. Foreslåede farvestoffer omfatter Alexa 488 (grøn), Alexa 546 (orange/Red) og atto 647N eller CF633 (far-Red). DAPI skal genanvendes efter ekspansion, da det vaskes væk under ekspansions processen. - Vask vævet med forberedt blokerende buffer (eller anden foretrukken vaskebuffer) 3 gange i 10 min hver på RT.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Slides kan anbringes i Petri skåle og dækkes med 1x PBS og opbevares ved 4 °C. - Udføre fluorescerende billeddannelse ved hjælp af en konventionel bred felt mikroskop, confokale mikroskop, eller andre Imaging System valg.
Bemærk: Dette trin er nødvendigt for at bestemme biologisk længde ved hjælp af ekspansions faktoren ved at sammenligne præ-og post-ekspansion billeder. For at lette billeddannelse efter ekspansion bør der udvælges let identificerbare interesseområder, og der bør indsamles billeder ved både lav og høj forstørrelse.
- Brug en hydrofobe pen til at tegne en grænse omkring vævs sektionen (erne) på diaset for at minimere den mængde opløsning, der er nødvendig for at dække vævet. Placer diaset i en skål, der er stor nok til at passe til diaset. For en standard 3-tommer slide, brug en 100 mm Petri skål.
3. in situ-polymerisering af prøver
-
Indinkuber præparatet i forankrings opløsningen.
- Ankre-opløsningen (typisk 250 μL er nok til at dække vævs afsnittet) ved fortynding af AcX-stamopløsningen i 1x PBS til en koncentration på 0,03 mg/mL for prøver, der er fastgjort med ikke-aldehyd fikseringsmidler eller 0,1 mg/mL for prøver, som er fikseret med aldehyfikater , som har færre frie aminer til rådighed til at reagere med AcX.
- Placer diaset i en 100 mm Petri skål, og afpipettér forankrings opløsningen over vævet. Inkuber i mindst 3 timer ved RT eller natten over ved 4 °C.
-
Prøverne i gelerings opløsningen inkubates.
- Forbered mindst 100-Fold overskydende volumen af gelerings opløsning. Pr. 200 μL kombineres følgende i rækkefølge: 188 μL monomer opløsning, 4 μL 0,5% 4HT stamopløsning (1:50 fortynding, slutkoncentration: 0,01%), 4 μL 10% TEMED stamopløsning (1:50 fortynding, slutkoncentration 0,2%) og 4 μL 10% APS stamopløsning (1:50 fortynding, endelig koncentration 0,2%).
Bemærk: Gelerings opløsningen skal foretages umiddelbart før brug. Opløsningen skal opbevares ved 4 °C, og APS-opløsningen bør tilføjes sidst for at forhindre for tidlig gelling. - Fjern overskydende opløsning fra vævs afsnittet, og Placer diaset i en 100 mm Petri skål. Tilsæt frisk, kold gelerings opløsning til prøven og Inkuber blandingen på vævet i 30 minutter ved 4 °C, så opløsningen kan udbredes til vævet.
- Forbered mindst 100-Fold overskydende volumen af gelerings opløsning. Pr. 200 μL kombineres følgende i rækkefølge: 188 μL monomer opløsning, 4 μL 0,5% 4HT stamopløsning (1:50 fortynding, slutkoncentration: 0,01%), 4 μL 10% TEMED stamopløsning (1:50 fortynding, slutkoncentration 0,2%) og 4 μL 10% APS stamopløsning (1:50 fortynding, endelig koncentration 0,2%).
-
Der bygges et kammer på diaset rundt om prøven (figur 2a) uden at forstyrre gelerings opløsningen.
- Lav afstandsstykker til gelerings kammeret ved hjælp af en diamant kniv med tyndt skærende dele af dækglas.
Bemærk: For at lette Imaging post ekspansion, bør Spacers være tæt i tykkelse til vævsprøven for at reducere mængden af blank gel over vævet. Nummer 1,5 glas kan anvendes til standard kliniske prøver (5 − 10 μm). Cover glas stykker kan stables for tykkere prøver. - Fastgør afstandsstykker på hver side af vævet ved hjælp af dråber vand (~ 10 μL).
- Anbring forsigtigt et dæksel glaslåg over sliden, og sørg for at undgå at fælde luftbobler over vævet (figur 2B).
- Lav afstandsstykker til gelerings kammeret ved hjælp af en diamant kniv med tyndt skærende dele af dækglas.
- Prøven inkubates ved 37 °C i et befugtet miljø (f. eks. en lukket Petri skål med en fugtig serviet) i 2 timer.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Slide kammeret kan opbevares inde i en forseglet Petri skål ved 4 °C.
4. prøve fordøjelse
-
Fjern låget på gelerings kammeret ved forsigtigt at skubbe et barberblad under dæksedlen og langsomt løfte dæksedlen af gelens overflade. Trim den blanke gel rundt om vævet for at minimere lydstyrken. Skær gelen asymmetrisk til at spore retningen af gelen efter homogenisering, da prøven vil blive gennemsigtig.
- Fortynd ProK med 1:200 i fordøjelses bufferen (slutkoncentration 4 e/mL) før brug. Forbered nok løsning til helt nedsænkes gelen; en enkelt brønd af en fire-brønd plastik cellekultur plade kræver mindst 3 mL per brønd.
- Prøven inkubates i en lukket beholder, der indeholder fordøjelses bufferen i 3 timer ved 60 °C. Hvis prøven ikke løsnes fra diaset under fordøjelsen, skal du bruge en barberkniv til forsigtigt at fjerne prøven.
Bemærk: Prøven skal være helt nedsænket i fordøjelses bufferen for at forhindre, at prøven tørrer ud og anbringes i en overdækket beholder (lille glide boks, plastik brønd, Petri skål osv.), der kan forsegles med film.
5. prøve udvidelse og billeddannelse
- Brug en blød pensel til at overføre prøven til 1x PBS i en container, der er kompatibel med det ønskede billedbehandlingssystem og stort nok til at rumme den fuldt ekspanderede gel. Sørg for, at vævet anbringes med prøve siden nedad, hvis der afbildes på et inverteret system, eller hvis billeddannelse på et opretstående system minimerer afstanden fra billedbehandlings målsætningen til prøven. Vend gelen ved hjælp af en blød maler børste, hvis det er nødvendigt.
Bemærk: Side belysning fra en lysdiode kan bruges til at gøre dem synlige i væske. En standard 6-brønd plade kan rumme prøver, der har en præ-ekspanderet diameter mindre end 0,6 cm. En glasbund brønd plade bør anvendes til billeddannelse på et inverteret system. - Prøverne vaskes i 1x PBS ved RT i 10 min. Hvis det ønskes, re-plette prøven med 300 nM DAPI som fordøjelsesprocessen skyller væk DAPI pletten. Fjern PBS og Stain med 300 nM DAPI fortyndet i 1x PBS i 20 min ved RT, efterfulgt af en 10 min vask med 1x PBS på RT.
Bemærk: Prøverne kan dækkes med 1x PBS og opbevares ved 4 °C, før du fortsætter til næste trin. - For at udvide prøverne, Udskift PBS og vask med et overskydende volumen af ddH2O (mindst 10x den endelige gel volumen) 3 − 5 gange for 10 min hver, på rt.
Bemærk: Efter 3Rd eller 4th vask, bør prøvens ekspansion begynde at plateau. Til opbevaring, for at forhindre bakteriel vækst, ddH2O kan suppleres med 0,002% − 0,01% natriumazid (Nan3). I dette tilfælde reduceres den endelige ekspansions faktor reversibelt med 10%. - Udføre fluorescens Imaging ved hjælp af en konventionel bred felt mikroskop, confokale mikroskop, eller andre Imaging System valg.
Bemærk: For at forhindre geler fra drifting, kan overskydende væske fjernes fra brønden. Gels kan også være immobiliseret med 1,5 − 2% lavsmelte agopstået. Forbered 1,5 − 2% (w/v) lavsmelte agopstået i vand i en beholder 2 − 4 gange volumen af opløsningen. Opvarmer opløsningen i et 40 °C-vandbad eller i en mikrobølgeovn til 10 − 20 s for at smelte opløsningen. Pipette den smeltede agopstået omkring kanterne af gelen. Efter at have ladet agopstod at hærde ved RT eller 4 °C tilsættes vand til prøven for at forhindre dehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis protokollen er gennemført med succes (figur 1), vil prøverne fremstå som en flad og transparent gel efter mekanisk homogenisering (figur 3a) og kan udvides med en faktor på 3 − 4,5 x i vand (figur 3B) giver en effektiv opløsning på ~ 70 nm afhængigt af den endelige ekspansions faktor og Imaging system, der anvendes5,16. Figur 4 viser eksempel billeder af en 5 ΜM tyk FFPE nyre prøve behandlet ved hjælp af expath protokollen. Fuld ekspansion af de Gerede prøver resulterede i en 4,5 x ekspansions faktor i vand, hvilket giver en effektiv opløsning på ~ 63 nm, når der er afbildet ved hjælp af en 0,95 na mål. Vævet blev først forbehandlet med xylen for at fjerne paraffin og rehydreret (pkt. 2.1.1), efterfulgt af antigen-hentning med citratbuffer (punkt 2,2). Den gendannede væv blev derefter farvet med antistoffer for Alpha-actinin 4 (ACTN4) og vimentin, sammen med dapi at visualisere nukleare DNA og hvedekim kold (WGA), at mærke kulhydrater. Præparatet blev derefter afbildet ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop (figur 4a, B, D). Væv blev behandlet efter ovennævnte protokol og fuldt udbygget i vand (figur 4C, E). På samme måde viser figur 5 eksempler på billeder af H & E farvet normalt brystvæv (figur 5A), der blev behandlet med xylen (afsnit 2.1.2) for at fjerne dækglasset og derefter behandles som en FFPE-prøve (punkt 2.1.1). Under homogenisering er H & E plet elimineret fra vævet. Post-ekspansion billeder af DAPI farvet prøve opnået på en roterende disk confokale mikroskop (figur 5B) sammenlignet med præ-ekspansion billeder indikerer en ekspansions faktor på 5,1, giver en effektiv opløsning på ~ 43 nm når afbildet med en NA 1,15 linse.
Eksempeldata for ikke-fastfrosne nyre skiver, der er behandlet med ExPath-protokollen, kan ses i figur 6. Vævet blev først fikseret i kold acetone (pkt. 2.1.3) og plettet med ACTN4, vimentin, DAPI og WGA. Sammenligning af præ-ekspansion (ikke vist) og post-ekspansion billeder indikerer en ekspansions faktor på 4,5. Sammenligningsdata fra de acetone-fastfrosne nyre prøver til FFPE-prøverne (figur 4C, E) viser, at der er et fald i kvaliteten af den ACTN4 farvning i den ekspanderede FFPE-prøve, hvilket kan skyldes en forringelse af antigeniciteten på grund af fikserings metode16.
Figur 1: skematisk af arbejdsgangen for udvidelses patologi (ExPath). Forbehandling af klinisk arkiverede vævs slides udføres først baseret på lagrings formatet. Prøverne farves derefter ved hjælp af konventionelle immunofarvnings protokoller og præ-udvidelses billeder opnås. Prøverne behandles derefter med acryloyl-X SE (AcX) for at forankre proteiner i hydrogel. In situ polymerisering er præformeret før mekanisk homogenisering ved hjælp af proteinase K (ProK). Prøverne kan derefter udvides i ddH2O før billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Gelationkammer til patologiske prøver. A) to spacere, såsom to stykker af #1... glasdæksel med en diamant kniv, anbringes på hver side af vævet efter inkubeering af prøven i gelerings opløsning ved 4 °c. Spacerne skal være tykkere end vævs skiver, for at forhindre komprimering af prøven. B) et låg, såsom et stykke #1... glas, anvendes til at dække prøven inden inkubation ved 37 °c. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempel på udvidelse af stikprøven. En 5 μm tyk nyre prøve efter homogenisering, (A) præ-og (B) efter ekspansion i DDH2O er vist. Gitter kvadrater er 5 mm x 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater fra 5 μm tykke FFPE-nyre prøver. (A) præ-udvidet billede. B) forstørret præ-ekspansions billede af det skitserede område af interesse i panel A ogC) det tilsvarende post ekspansions billede af den samme interesseregion, efter at prøven var fuldt udbygget i vand. D) forstørret billede af den skitserede region af interesse i panel B ogE) det tilsvarende post ekspansions billede af den samme interesseregion, efter at prøven var fuldt udbygget i vand. Revner, forvrængninger og tab af mærkede mål kan skyldes utilstrækkelig forankring og/eller homogenisering (F, G). Alle billeder blev opnået ved hjælp af en roterende disk confokale mikroskop med en 20x (NA 0,95; vand nedsænkning) mål (a-E, G) eller 10x (na 0,5) mål (F). Blå, DAPI; grøn, vimentin; rød, alpha-actinin 4 (ACTN4); magenta, WGA. Skala stænger = 100 μm (A, F, G, gule skala søjler indikerer post-ekspansion billeder); 50 μm (B), 50 μm (C, efter ekspansion i fysisk størrelse 225 μm; udvidelses faktor 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, fysisk størrelse post ekspansion 112,5 μm; ekspansions faktor 4,5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative resultater fra H &Amp; E farvet normalt brystvæv. (A) brightfield billede af præ-ekspanderet H & E farvede væv taget med en 40x (0,95 na) mål. (B) dapi-billede efter ekspansion af den samme interesseregion, når prøven blev fuldt udbygget i vand. Billedet blev opnået på en roterende disk confokale mikroskop ved hjælp af en 40x (NA 1,15; vand nedsænkning) mål. Skala søjler = 10 μm (A, den gule skala linje indikerer post-ekspansion billeder) og 2 μm (B, fysisk størrelse post ekspansion 50,1 μm; ekspansions faktor 5,1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative resultater af friske frosne nyre prøver efter ekspansion, opnået på en roterende disk confokale mikroskop med en 40x (NA 1,15; vand nedsænkning) mål. Blå = vimentin; grøn = Alpha-actinin 4 (ACTN4); rød = kollagen IV; grå = DAPI. Scale bar = 10 μm (fysisk størrelse post ekspansion 45 μm; ekspansions faktor 4,5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Bestand koncentration | Lagervolumen (mL) | Endelig koncentration | Endeligt beløb pr. 10 mL |
| Natriumacrylat | 0,380 g/mL | 2,25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Acrylamid | 0,500 g/mL | 0,50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N, N′-Methylenebisacrylamid | 0,020 g/mL | 0,50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| Natriumchlorid | 0,292 g/mL | 4,00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x | 1,00 | 1x | 1x |
| Vand | 1,15 | |||
| Samlet mængde | 9,40 |
Tabel 1: komponenter af monomer opløsning. Alle koncentrationer angives udtrykt i g/mL (w/v), undtagen PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi ExPath Protocol16, en variant af proExM5 , der kan anvendes på de mest almindeligt forekommende typer af kliniske biopsiprøver, der anvendes i PATOLOGI, herunder ffpe, H & E farvede, og fersk frosne prøver på glas skred. Format konvertering, antigen hentning og immunofarvning af prøverne følger almindeligt anvendte protokoller, der ikke er specifikke for ExPath. I modsætning til den oprindelige proExM protokol9, er expath afhængig af en højere koncentration af EDTA i fordøjelses bufferen, hvilket forbedrer udvidelsen af formalin-fast væv, som det fremgår af det oprindelige expath-studie16. Protokollen er blevet valideret i 5 − 10 μm tykke kliniske prøver16, men kan også anvendes til tykkere vævsprøver med nogle ændringer. De mest kritiske trin i denne protokol er: 1) timingen af gelering trin; 2) opsætning af gelering kammer; 3) parametre for prøve homogenisering; og 4) håndtering af gelen.
Den mest kritiske parameter for denne protokol er timingen af gelering trin. Hvis gelerings opløsningen for tidligt polymeriserer, vil prøven ikke være tilstrækkeligt forankret til gel-matrixen. Utilstrækkelig forankring og for tidlig gelering kan forårsage forvridninger, begrænse ekspansion og resultere i tab af målmolekyler (figur 4F, G). Initiering af gelering er temperaturafhængig, derfor er det vigtigt at holde den blandede gelerings opløsning ved 4 °c, før den anbringes på målprøven. Initiatoren, ApS, skal være frisk tilberedt og tilsættes umiddelbart før påføring af gelerings-opløsningen. APS er ikke stabil ved RT og kan miste effekten efter at have under fryse-tø cyklusser. Utilstrækkelig forankring kan også være resultatet af reduceret reaktivitet af ankre forbindelsen, AcX, som kan tabe aktivitet efter langtidsopbevaring eller efter kontakt med vand. Det er blevet konstateret, at AcX bevarer aktiviteten efter 6 måneders opbevaring i et udtørret miljø ved-20 °C. Hvis for tidlig gelering ikke er den formodede årsag til forvrængning, kan der tilberedes en ny stamopløsning af ACx.
Under opsætningen af gelering kammer, kan luftbobler blive fanget under låget glas låg. Hvis disse bobler er oven på eller direkte rører ved prøven, kan de forårsage forvrængninger. De kan flyttes væk fra præparatet ved at tilføje mere gelerings opløsning gennem siden af kammeret. For at hjælpe med at forhindre luftbobler kan der deponeres en lille dråbe gelerings opløsning på låget, før det placeres over vævet.
Prøve fordøjelsen er afhængig af tid, temperatur, samt vævs egenskaber, såsom tykkelse og vævstype. Utilstrækkelig fordøjelse kan også forårsage forvridninger og resultere i en ekspansions faktor, der er mindre end forventet. Hvis der er mistanke om ufuldstændig fordøjelse, kan fordøjelses tiden og/eller ProK koncentrationen øges, især i tilfælde af tykkere væv. ProK kan også miste aktivitet over tid. For at bevare sin aktivitet skal ProK opbevares ved-20 °C og kan citeres i mindre volumener for at undgå frithave cyklusser.
Der skal udvises forsigtighed ved håndtering af homogeniserede prøver, især når de er fuldt udbygget. Hvis præparatet er svært at finde, når nedsænket i væske, belyse beholderen fra forskellige vinkler kan sprede hændelsen lys til at tillade visualisering af gelen. Fuldt ekspanderede gels er skrøbelige og kan knække under håndteringen. Brug af bløde børster og plastik spatler anbefales at overføre de ekspanderede geler.
ExPath-protokollen giver et omkostningseffektivt alternativ til aktuelle teknikker til billedbehandling med super opløsning og elektronmikroskopi for at afhøre nanoskala-strukturer i kliniske biopsi-prøver. Selv om ProK giver endnu udvidelse af prøven efter homogenisering, tabet af proteiner forhindrer forhør af andre mål af interesse efter ekspansion. Protokollen kan dog nemt udføres i ethvert almindeligt vådt laboratorium. Vigtigst er det, at billeddannelse af nanoskala funktioner kan udføres på konventionelle Wide-felt eller confokale mikroskoper, der er almindeligt forekommende i biologi laboratorier og Imaging Core faciliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ og OB er to af de opfindere, der har ansøgt om og opnået patentbeskyttelse på en delmængde af de teknologier, som er beskrevet her (US patents US20190064037A1, WO2018157074A1 og WO2018157048A1).
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af fakultetets opstartsfond fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director's nye innovator Award (DP2 OD025926-01 til YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
