Summary
Nanoschaal beeldvorming van klinische weefselmonsters kan het begrip van ziekte pathogenese verbeteren. Expansie pathologie (ExPath) is een versie van expansie microscopie (ExM), aangepast voor compatibiliteit met standaard klinische weefselmonsters, om de nanoschaal configuratie van biomoleules te verkennen met conventionele diffractie beperkte microscopen.
Abstract
In de moderne pathologie speelt optische microscopie een belangrijke rol bij de diagnose van de ziekte door microscopische structuren van klinische specimens te onthullen. De fundamentele fysieke diffractie-limiet voorkomt echter ondervraging van de anatomie van nanoschaal en subtiele pathologische veranderingen bij het gebruik van conventionele optische beeldvormings benaderingen. Hier beschrijven we een eenvoudig en goedkoop protocol, genaamd Expansion pathologie (ExPath), voor optische beeldvorming op nanoschaal van veelvoorkomende soorten van klinisch primaire weefsel specimens, waaronder zowel vaste-bevroren of formalin-vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel Secties. Deze methode omzeilt de optische diffractie grens door de weefselmonsters chemisch te transformeren in weefsel-hydrogel hybride en ze fysiek uit te breiden op meerdere schalen in zuiver water. Als gevolg van expansie worden voorheen niet-omgezette moleculen gescheiden en kunnen ze dus worden geobserveerd met een conventionele optische Microscoop.
Introduction
Onderzoek naar de moleculaire organisatie van weefsels in een driedimensionale (3D) context kan een nieuw begrip van biologische functies en ziekte ontwikkeling bieden. Echter, deze nanoschaal omgevingen zijn buiten de resolutie capaciteiten van conventionele diffractie beperkt microscopen (200 − 300 nm), waarbij de minimale omgezet afstand, d wordt gedefinieerd door d α λ/na. Hier λ is de golflengte van licht en na is het numerieke diafragma (na) van het beeldvormings systeem. Recentelijk is directe visualisatie van fluorescently gelabelde moleculen mogelijk gemaakt door nieuw ontwikkelde beeldvormingstechnieken met superresolutie1,2,3, inclusief gestimuleerde emissie depletie (STED), Foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM), stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), en gestructureerde verlichtings microscopie (SIM). Hoewel deze beeldvormingstechnieken een revolutie hebben teweeggebracht in de biologische functie op nanoschaal, zijn ze in de praktijk vaak afhankelijk van dure en/of gespecialiseerde apparatuur en beeldverwerkings stappen, kunnen ze een langzamere acquisitie tijd hebben in vergelijking met conventionele optische beeldvorming, vereisen fluoroforen met specifieke kenmerken (zoals fotoswitchingvermogen en/of hoge foto stabiliteit). Daarnaast blijft het een uitdaging om 3D Super-Resolution Imaging op weefsel specimens uit te voeren.
Expansie microscopie (EXM), voor het eerst geïntroduceerd in 20154, biedt een alternatieve manier van Imaging nanoschaal kenmerken (< 70 nm) door fysiek groeiende bewaard gebleven monsters ingebed in een opzwelbaar polyelektrolyt hydrogel. Hier worden belangrijke biomoleules en/of labels in situ verankerd aan een polymeer netwerk dat isotopen kan worden uitgebreid na chemische verwerking. Omdat de fysieke expansie de totale effectieve resolutie verhoogt, kunnen moleculen van belang dan worden opgelost met conventionele diffractie-beperkte beeldvormingssystemen. Sinds de publicatie van het oorspronkelijke protocol, waarbij aangepaste gesynthetiseerde fluorescerende labels werden verankerd aan het polymeer netwerk4, zijn nieuwe strategieën gebruikt om direct eiwitten (eiwit retentie EXM of proexm) te verankeren5, 6,7,8,9 en RNA9,10,11,12 aan de hydrogel, en verhoog de fysieke vergroting door iteratief uitbreiding13 of aanpassing gelchemie 8,14,15.
Hier presenteren we een aangepaste versie van proExM, genaamd Expansion pathologie (ExPath)16, die is geoptimaliseerd voor klinische pathologie-formaten. Het protocol converteert klinische monsters, waaronder formalin-Fixed paraffine-ingebed (FFPE), hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd, en vriesverse menselijke weefsel specimens die op glazen platen zijn gemonteerd, in een toestand die verenigbaar is met ExM. Eiwitten worden vervolgens verankerd aan de hydrogel en mechanische homogenisatie wordt uitgevoerd (Figuur 1)16. Met een 4-voudige lineaire expansie van de monsters, kunnen Multicolor superresolutie (~ 70 nm) beelden worden verkregen met behulp van een conventionele confocale Microscoop met slechts een ~ 300 nm resolutie en kan ook worden gecombineerd met andere Super-Resolution Imaging technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van voorraad reagentia en-oplossingen
-
De onderdelen van de geleer-oplossing voorbereiden.
Opmerking: oplossings concentraties worden gegeven in g/ml (w/v-percentage).- Maak de volgende stockoplossingen: 38% (w/v) natriumacrylaat (SA), 50% (w/v) acrylamide (AA), 2% (w/v) N, N′-methyleenebisacrylamide (bis) en 29,2% (w/v) natriumchloride (NaCl). Los de verbindingen op in dubbel gedeïoniseerd water (ddH2O). De bedragen in tabel 1 als referentie gebruiken; bereide oplossingen kunnen naar behoefte omhoog of omlaag worden geschaald. Als u bijvoorbeeld 10 mL van een 38% (w/v) SA-oplossing wilt maken, voegt u 1,9 g SA toe aan een gegradueerde cilinder van 10 mL en voegt u ddH2O toe aan een volume van 5 ml.
- Bereid 9,4 mL monomeer oplossing met een concentratie van 1,06 x, zoals weergegeven in tabel 1.
Opmerking: Dit zal resulteren in een 1x concentratie na toevoeging van de initiator, Accelerator, en inhibitor. De monomeer kolf kan gedurende maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard, of bij-20 °C voor langdurige opslag. - Bereid de volgende voorraadoplossingen afzonderlijk in DDH2O: 0,5% (w/v) van de remmer 4-hydroxy-2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), die de gelatie remt om diffusie van de geleer oplossing in weefsels mogelijk te maken, 10% (v/v) initiator tetramethylethylenediamine (TEMED), die versnelt radicale generatie door ammonium persulfate (APS), en 10% (w/v) APS die het geleer proces initieert.
Opmerking: Stock oplossingen van 4HT en TEMED kunnen in 1 mL aliquots worden bereid en gedurende ten minste 6 maanden bij-20 °C worden bewaard. APS is gebleken om de werkzaamheid na lange termijn opslag te verliezen en is het best voorbereid in kleine hoeveelheden (< 0.1 mL) onmiddellijk voor het Gelling.
- Spijsvertering buffer voorbereiden (50 mM tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] nonionische oppervlakteactieve stof, 0,8 M NaCl) door 25 mL 1 M Tris pH 8 (3,03 g van tris base in 25 mL ddH2O) te combineren, 25 ml EDTA (0,5 M pH 8) , 2,25 g nonionische oppervlakteactieve stof en 23,38 g NaCl. Voeg ddH2O toe voor een totaal volume van 500 ml.
Opmerking: De oplossing kan zo nodig omhoog of omlaag worden geschaald en bij 4 °C worden bewaard. Proteinase K (ProK) wordt onmiddellijk vóór de vergistings stap toegevoegd. - Bereid 20 mM Natriumcitraat oplossing door 2,941 g Natriumcitraat tribasidihydraat te combineren met 500 mL ddH2O en de pH aan 8,0 bij kamertemperatuur (RT) aan te passen. Schaal het volume van de voorraad indien nodig.
- Bereid een stamoplossing van 6-((acryloyl) amino) hexanoïnezuur, succinimidyl Ester (acryloyl-X, SE; AcX), de verankerings verbinding. Los acx op in 500 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) voor een uiteindelijke concentratie van 10 mg/ml.
Opmerking: De oplossing kan worden opgeslagen in een drooghoudende omgeving bij-20 °C bij 20 μL aliquots. - Als u geen commercieel verkrijgbare buffers voor immunokleuring gebruikt, bereidt u de blokkerende buffer voor. Gebruik een blokkerende buffer van 5% (v/v) normaal dierlijk serum en 0,1% (w/v) nonionische oppervlakteactieve stof in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en selecteer het serum op basis van het hostdier van de secundaire antilichamen. Om bijvoorbeeld de blokkerende buffer van 500 mL voor in geit gegroeide antilichamen te bereiden, combineert u 25 mL geit serum, 0,45 g nonionische oppervlakteactieve stof en 1x PBS tot een volume van 500 mL.
2. bereiding van gearchiveerde en vers bereide klinische weefsel glaasjes voor ExPath
- Zet het weefsel om in een ExPath compatibel formaat. Kies een van de vier volgende stappen (2.1.1 − 2.1.4) op basis van de voorbereiding van het preparaat: FFPE-dia's, gekleurd FFPE-dia's of niet-vaste of vaste bevroren weefsel dia's in de optimale snijtemperatuur (OCT)-oplossing.
Opmerking: deze zijn gebaseerd op standaard herstel stappen voor pathologie-samples en zijn niet specifiek voor het ExPath-protocol.- FFPE klinische monsters
- Bereid 30 mL 95% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol voor. Meet 30 mL xyleen, 100% ethanol en ddH2O.
- Plaats de glijbaan met het monster in een conische 50 mL met een tang en voeg 15 mL xyleen toe. Dop de buis en plaats deze horizontaal op een rondschudapparaat bij ongeveer 60 rpm en inincuberen op RT gedurende 3 minuten voor elke oplossing. Herhaal dit met de resterende 15 mL xyleen.
- Herhaal stap 2.1.1.2 met 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol en ddH2O in plaats van xyleen.
- Bevlekt en gemonteerde permanente dia's
- Plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje en dek af met xyleen. Verwijder voorzichtig de dekslip met een scheermesje. Als de Afdeklijst niet gemakkelijk wordt verwijderd, keert u de dia terug naar de xyleen totdat de Afdeklijst loskomt.
- Proces met behulp van de stappen voor FFPE-voorbeelden (stappen 2.1.1.1 − 2.1.1.3).
Opmerking: In het geval van H & E gekleurd glijbanen worden de vlekken geëlimineerd tijdens het uitbreidingsproces.
- Niet-vaste bevroren weefsel dia's in de LGO-oplossing
- Fixeer het weefsel in aceton bij-20 °C gedurende 10 minuten.
- Was de samples met 1x PBS-oplossing 3 keer gedurende 10 minuten per RT.
- Eerder vaste, bevroren klinische weefsel glaasjes
- Inbroed de glaasjes gedurende 2 minuten bij RT om de LGO-oplossing te smelten.
- Was het monster met 1x PBS-oplossing 3 keer gedurende 5 minuten per RT.
- FFPE klinische monsters
- Voer warmtebehandeling voor antigeen opvraging op alle monsters na formaatconversie.
- Voeg 20 mM citraat oplossing (pH 8 op RT) toe in een hittebestendige container, zoals een dia-kleurenpot.
Opmerking: Er moet voldoende oplossing voor het weefsel gemonteerd op de dia (50 mL voor een standaard dia kleuring jar). - Verwarm de citraat oplossing tot 100 °C in de magnetron en plaats de glijbaan in de oplossing. Breng de container onmiddellijk over naar een incubatie kamer en inbroed gedurende 30 minuten bij 60 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Dia's kunnen worden geplaatst in Petri schalen en bedekt met 1x PBS en bewaard bij 4 °C.
- Voeg 20 mM citraat oplossing (pH 8 op RT) toe in een hittebestendige container, zoals een dia-kleurenpot.
- Beits het monster met behulp van standaard immunofluorescentie (IF)/Immunohistochemistry (IHC) kleurings protocollen.
Opmerking: specifieke primaire en secundaire antilichaamconcentraties en kleurings duur zijn afhankelijk van de door de fabrikant voorgestelde concentraties of door optimalisatie voor het specifieke experiment.- Gebruik een hydrofobe pen om een grens rond de weefsel sectie (en) op de dia te tekenen om het volume van de oplossing die nodig is om het weefsel te bedekken te minimaliseren. Plaats de dia in een schaaltje dat groot genoeg is om in de glijbaan te passen. Voor een standaard 3-inch glijbaan, gebruik een 100 mm Petri schaal.
Opmerking: De hydrofobe pen interfereert niet met de polymerisatie van het monster of het verteringsproces. - Inbroed het weefsel met blokkerende buffer voor 1 uur bij 37 °C, 2 uur bij RT, of 4 °C 's nachts om niet-specifieke binding te verminderen.
- Verdun primaire antilichamen tegen de gewenste concentratie in de juiste hoeveelheid voorbereide blokkerende buffer (of een andere voorkeurs kleurings buffer). Inbroed de weefsels met de primaire antilichaam oplossing gedurende ten minste 3 uur bij RT of 37 °C, of 's nachts bij 4 °C.
Opmerking: Monsters moeten in een bevochtigde container worden geplaatst (zoals een Petri schaaltje met een vochtig doekje) om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Meestal zijn antilichamen verdund tot 1:100 − 1:500 in 200 − 500 μL buffer, afhankelijk van de weefsel grootte en het gebruikte antilichaam. - Was het weefsel met de voorbereide blokkeerbuffer (of een andere voorkeurs wasbuffer) 3 keer gedurende 10 minuten bij RT.
- Verdunde secundaire antilichamen (en 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI] indien gewenst), in bereide blokkerende buffer (of andere voorkeurs kleurings buffer) tot een concentratie van ongeveer 10 μg/mL. Inbroed het weefsel in de secundaire antilichaam oplossing gedurende ten minste 1 uur bij RT of 37 °C.
Opmerking: De timing kan worden aangepast afhankelijk van de gebruikte antilichamen en de dikte van het weefsel. Secundaire antilichamen met cyanine kleurstoffen (Cy3, Cy5, Alexa 647) zijn niet compatibel met het ExM-protocol bij toepassing van pre-polymerisatie. Voorgestelde kleurstoffen zijn Alexa 488 (groen), Alexa 546 (oranje/rood) en ATTO 647N of CF633 (far-Red). DAPI moet na uitbreiding opnieuw worden toegepast, omdat deze tijdens het uitbreidingsproces wordt weggewassen. - Was het weefsel met de bereide blokkeerbuffer (of een andere voorkeurs wasbuffer) 3 maal gedurende 10 minuten per RT.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Dia's kunnen worden geplaatst in Petri schalen en bedekt met 1x PBS en bewaard bij 4 °C. - Voer fluorescerende beeldvorming uit met behulp van een conventionele breedveld Microscoop, confocale Microscoop of ander beeldvormings systeem naar keuze.
Opmerking: Deze stap is nodig om de biologische lengte te bepalen aan de hand van de uitbreidings factor door afbeeldingen vóór en na de uitbreiding te vergelijken. Om de beeldvorming na de uitbreiding te vergemakkelijken, moeten gemakkelijk identificeerbare gebieden worden geselecteerd en moeten afbeeldingen bij zowel lage als hoge vergrotingsfactor worden verzameld.
- Gebruik een hydrofobe pen om een grens rond de weefsel sectie (en) op de dia te tekenen om het volume van de oplossing die nodig is om het weefsel te bedekken te minimaliseren. Plaats de dia in een schaaltje dat groot genoeg is om in de glijbaan te passen. Voor een standaard 3-inch glijbaan, gebruik een 100 mm Petri schaal.
3. polymerisatie van specimens in situ
-
Inincuberen van het preparaat in verankerings oplossing.
- Bereid de verankerings oplossing (meestal is 250 μL voldoende om de weefsel sectie te bedekken) door de AcX-stamoplossing in 1x PBS te verdunten tot een concentratie van 0,03 mg/mL voor monsters die zijn bevestigd met niet-aldehyde fixeermiddelen of 0,1 mg/mL voor monsters met aldehyde fixativa , die minder gratis amines beschikbaar hebben om met AcX te reageren.
- Plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje en Pipetteer de verankerings oplossing over het weefsel. Inincuberen gedurende ten minste 3 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
-
Inincuberen van de monsters in geleer oplossing.
- Bereid ten minste 100-voudige overtollige hoeveelheid geleer oplossing. Per 200 μL, het volgende combineren, in volgorde: 188 μL monomeer oplossing, 4 μL van 0,5% 4HT stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie: 0,01%), 4 μL van 10% TEMED stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%), en 4 μL 10% APS stockoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%).
Opmerking: Gelling-oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden gemaakt. De oplossing moet op 4 °C worden gehouden en de APS-oplossing moet als laatste worden toegevoegd om te voorkomen dat er voortijdige Gelling wordt. - Verwijder de overtollige oplossing uit de weefsel sectie en plaats de glijbaan in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg verse, koude geleer oplossing toe aan het monster en inbroed het mengsel op het weefsel gedurende 30 minuten bij 4 °c, om de diffusie van de oplossing in het weefsel mogelijk te maken.
- Bereid ten minste 100-voudige overtollige hoeveelheid geleer oplossing. Per 200 μL, het volgende combineren, in volgorde: 188 μL monomeer oplossing, 4 μL van 0,5% 4HT stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie: 0,01%), 4 μL van 10% TEMED stamoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%), en 4 μL 10% APS stockoplossing (1:50 verdunning, eindconcentratie 0,2%).
-
Bouw een kamer op de glijbaan rond het monster (Figuur 2a) zonder de geleer-oplossing te verstoren.
- Maak spacers voor de geleer kamer door dun gesneden stukjes afdekglas met behulp van een diamant mes.
Opmerking: Om de uitbreiding van de Imaging post te vergemakkelijken, moeten de spacers dicht in de dikte van het weefsel specimen zijn om de hoeveelheid lege gel boven het weefsel te verminderen. Nummer 1,5 glas kan worden gebruikt voor standaard klinische monsters (5 − 10 μm). Afdekglas stukken kunnen worden gestapeld voor dikkere samples. - Bevestig de spacers aan beide zijden van het weefsel met behulp van druppeltjes water (~ 10 μL).
- Plaats een afdekglas voorzichtig over de glijbaan en voorkom dat er luchtbelletjes over het weefsel worden overgevuld (Figuur 2B).
- Maak spacers voor de geleer kamer door dun gesneden stukjes afdekglas met behulp van een diamant mes.
- Inincuberen van het monster bij 37 °C in een bevochtigde omgeving (zoals een gesloten Petri schaaltje met een vochtig doekje) gedurende 2 uur.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. De schuif kamer kan worden opgeborgen in een verzegelde Petri schaal bij 4 °C.
4. monster spijsvertering
-
Verwijder de deksel van de geleer kamer door voorzichtig een scheermesje onder de afdekplaat te schuiven en langzaam de afdekplaat van het geloppervlak te tillen. Trim de lege gel rond het weefsel om het volume te minimaliseren. Snijd de gel asymmetrisch om de oriëntatie van de gel na homogenisatie te volgen, omdat het monster transparant zal worden.
- Verdun ProK door 1:200 in de verterings buffer (eindconcentratie 4 U/mL) voor gebruik. Bereid genoeg oplossing om de gel volledig te onderdompelen; een enkele put van een vier-goed kunststof celkweek plaat vereist ten minste 3 mL per put.
- Inbroed het monster in een gesloten recipiënt met de digestie buffer voor 3 uur bij 60 °C. Als het monster tijdens de spijsvertering niet van de glijbaan loskoppelt, gebruik dan een scheermesje om het monster voorzichtig te verwijderen.
Opmerking: Het preparaat moet volledig worden ondergedompeld in de verterings buffer om te voorkomen dat het monster uitdroogt en in een overdekte container wordt geplaatst (kleine Slide box, plastic put, Petri schaaltje, enz.) die met film kan worden verzegeld.
5. voorbeeld uitbreiding en beeldvorming
- Gebruik een zachte verfborstel om het preparaat over te brengen naar 1x PBS in een container die compatibel is met het gewenste beeld systeem en groot genoeg voor de volledig uitgebreide gel. Zorg ervoor dat het weefsel wordt geplaatst met de monster zijde naar beneden als Imaging op een omgekeerde systeem of omhoog als Imaging op een Upright-systeem om de afstand van de Imaging doelstelling naar het monster te minimaliseren. Draai de gel indien nodig met een zachte verfkwast.
Opmerking: Zijverlichting van een LED kan worden gebruikt om ze zichtbaar te maken in vloeistof. Een standaard 6-well plaat kan geschikt zijn voor monsters met een voorgeëxpandeerde diameter van minder dan 0,6 cm. Een glazen bodemplaat moet worden gebruikt voorbeeld vorming op een omgekeerd systeem. - Was de monsters in 1x PBS bij RT gedurende 10 minuten. Indien gewenst, herbeits het monster met 300 nM DAPI als het verteringsproces de DAPI vlek wegspokt. Verwijder PBS en vlek met 300 nM DAPI verdund in 1x PBS gedurende 20 minuten bij RT, gevolgd door een Wash van 10 min met 1x PBS bij RT.
Opmerking: De monsters kunnen worden bedekt met 1x PBS en worden opgeslagen bij 4 °C voordat u verdergaat met de volgende stap. - Om de samples uit te breiden, vervang je de PBS en was je met een teveel aan ddH2O (ten minste 10x het uiteindelijke gelvolume) 3 − 5 keer gedurende 10 minuten, bij RT.
Opmerking: Na de 3RD of 4th Wash, de uitbreiding van het preparaat moet beginnen te plateau. Voor opslag, om bacteriële groei te voorkomen, kan de ddH2O worden aangevuld met 0.002% − 0,01% natrium natriumazide (Nan3). In dit geval wordt de uiteindelijke expansie factor omkeerbaar verlaagd met 10%. - Fluorescentie Imaging uitvoeren met behulp van een conventionele breedveld Microscoop, confocale Microscoop of ander beeldvormings systeem naar keuze.
Opmerking: Om te voorkomen dat gels drijven, kan overtollige vloeistof uit de put worden verwijderd. Gels kunnen ook worden geïmmobiliseerd met 1.5 − 2% laag smelt agarose. Bereid 1,5 − 2% (w/v) laag smelt agarose in water in een container 2 − 4 maal het volume van de oplossing. Verwarm de oplossing in een waterbad van 40 °C of in een magnetron voor 10 − 20 s om de oplossing te smelten. Pipetteer de gesmolten agarose rond de randen van de gel. Na het toelaten van de agarose te harden op RT of 4 ° c, voeg water aan het monster om uitdroging te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als het protocol met succes is uitgevoerd (Figuur 1), worden de monsters na de mechanische homogenisatie (Figuur 3a) als een platte en doorzichtige gel weergegeven en kunnen deze met een factor 3 − 4,5 x in water worden uitgebreid (Figuur 3B). het bieden van een effectieve resolutie van ~ 70 nm afhankelijk van de uiteindelijke expansie factor en imaging systeem gebruikt5,16. Figuur 4 toont voorbeeldafbeeldingen van een 5 ΜM dik ffpe-niermonster dat wordt verwerkt met het expath-protocol. Volledige uitbreiding van de opgestijfde-samples resulteerde in een 4,5 x expansie factor in water, wat een effectieve resolutie van ~ 63 nm gaf bij een afbeelding met een doelstelling van 0,95 na. Het weefsel werd voor het eerst verwerkt met xyleen om paraffine en gerehydrateerd te verwijderen (sectie 2.1.1), gevolgd door antigeen-opvraging met de citraat buffer (punt 2,2). Het herstelde weefsel werd vervolgens bevlekt met antilichamen voor alpha-actinine 4 (ACTN4) en vimentin, samen met DAPI om nucleair DNA en tarwekiemen agglutinine (WGA) te visualiseren, om koolhydraten te labelen. Het specimen werd vervolgens afgebeeld met behulp van een draaiende schijf confocale Microscoop (Figuur 4a, B, D). Weefsels werden behandeld volgens het bovengenoemde protocol en volledig uitgebreid in water (Figuur 4C, E). Evenzo toont Figuur 5 voorbeeldafbeeldingen van H & E gekleurd normaal borstweefsel (Figuur 5A) dat werd behandeld metxyleen(sectie 2.1.2) om het afdekglas te verwijderen en vervolgens als een ffpe-monster te worden behandeld (punt 2.1.1). Tijdens de homogenisatie wordt de H & E vlek geëlimineerd uit het weefsel. Na de uitbreiding beelden van de DAPI gekleurd monster verkregen op een draaiende schijf confocale Microscoop (Figuur 5B) in vergelijking met pre-expansie beelden duiden op een expansie factor van 5,1, het geven van een effectieve resolutie van ~ 43 nm wanneer afgebeeld met een NA 1,15 objectief.
Voorbeeldgegevens voor niet-vaste bevroren niersegmenten die met het ExPath-protocol zijn verwerkt, zijn te zien in Figuur 6. Het weefsel werd voor het eerst vastgesteld in koud aceton (punt 2.1.3) en gekleurd met ACTN4, vimentin, DAPI en WGA. Vergelijking van pre-expansie (niet getoond) en post-uitbreidings beelden duiden op een uitbreidings factor van 4,5. Vergelijkingsgegevens van de aceton-vaste diepgevroren niermonsters naar die van de FFPE-monsters (Figuur 4C, E) laten zien dat de kwaliteit van de ACTN4 kleuring in het geëxpandeerde ffpe-monster afneemt, wat kan worden veroorzaakt door een afbraak van de antigeniciteit door de fixatie methode16.
Figuur 1: schematische voorstelling van de workflow voor expansie pathologie (ExPath). Pre-verwerking van klinisch gearchiveerde weefsel dia's wordt eerst uitgevoerd op basis van het opslagformaat. Vervolgens worden monsters gekleurd met conventionele immunokleurings protocollen en worden pre-expansie beelden verkregen. Monsters worden vervolgens behandeld met acryloyl-X SE (AcX) om eiwitten aan de hydrogel te verankeren. In situ polymerisatie is voorbereid voorafgaand aan mechanische homogenisatie met behulp van proteïnase K (prok). Samples kunnen vervolgens worden uitgebreid in ddH2O voorafgaand aan Imaging. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Gelatie kamer voor pathologie monsters. A) twee spacers, zoals twee stukken #1 5 afdekglas met een diamantmes, worden aan beide zijden van het weefsel geplaatst na incuberen van het monster in geleer oplossing bij 4 °c. De spacers moeten dikker zijn dan de weefsel segmenten, om compressie van het monster te voorkomen. B) een deksel, zoals een stuk #1.5 afdekglas, wordt gebruikt om het monster te bedekken vóór incubatie bij 37 °c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: voorbeeld van de expansie van het monster. Een 5 μm dikke niermonster homogenisatie, (a) pre-en (B) post-expansie in DDH2O wordt getoond. Raster pleinen zijn 5 mm x 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve resultaten van 5 μm dikke FFPE-niermonsters. (A) vooraf uitgevouwen beeld. B) vergroot pre-expansie beeld van het gebied van belang in panel A enC) het overeenkomstige na-uitbreidings beeld van hetzelfde gebied van belang nadat het monster volledig in water is uitgebreid. D) vergroot beeld van het gebied van belang in panel B enE) het corresponderende na-uitbreidings beeld van hetzelfde gebied van belang nadat het monster volledig in water is uitgebreid. Scheuren, vervormingen en verlies van gelabelde doelen kunnen het gevolg zijn van ontoereikende verankering en/of homogenisatie (F, G). Alle beelden werden verkregen met behulp van een draaiende schijf confocale Microscoop met een 20x (NA 0,95; water onderdompeling) objectief (a-E, G) of 10X (na 0,5) objectief (F). Blauw, DAPI; groen, vimentin; rood, alpha-actinine 4 (ACTN4); magenta, WGA. Schaal staven = 100 μm (a, F, G, gele schaal staven geven afbeeldingen na uitbreiding aan); 50 μm (B), 50 μm (C, fysieke grootte na uitbreiding 225 μm; expansie factor 4,5); 25 μm (D); 25 μm (E, fysieke grootte na uitbreiding 112,5 μm; expansie factor 4,5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve resultaten van H &Amp; E gekleurd normaal borstweefsel. A)brightfield-beeld van voorgeëxpandeerde H & E gekleurd weefsel genomen met een doelstelling van 40x (0,95 na). B) de DAPI-afbeelding na uitbreiding van hetzelfde interessegebied nadat het monster volledig in water is uitgebreid. Het beeld werd verkregen op een draaiende schijf confocale Microscoop met behulp van een 40x (NA 1,15; water onderdompeling) doel. Schaal staven = 10 μm (a, de gele schaalbalk geeft post-uitbreidings beelden aan) en 2 μm (B, fysieke grootte na uitbreiding 50,1 μm; uitbreidings factor 5,1). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve resultaten van verse bevroren niermonsters na expansie, verkregen op een draaiende schijf confocale Microscoop met een 40x (NA 1,15; water onderdompeling) doelstelling. Blauw = vimentin; groen = alpha-actinine 4 (ACTN4); rood = collageen IV; grijs = DAPI. Schaalbalk = 10 μm (fysieke grootte na uitbreiding 45 μm; uitbreidings factor 4,5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Component | Voorraad concentratie | Voorraad volume (mL) | Eindconcentratie | Eindbedrag per 10 mL |
| Natriumacrylaat | 0,380 g/mL | 2,25 | 0,086 g/mL | 0,86 g |
| Acrylamide | 0,500 g/mL | 0,50 | 0,025 g/mL | 0,25 g |
| N, N′-Methylenebisacrylamide | 0,020 g/mL | 0,50 | 0,001 g/mL | 0,10 g |
| Natriumchloride | 0,292 g/mL | 4,00 | 0,117 g/mL | 1,17 g |
| Pbs | 10x | 1,00 | 1x | 1x |
| Water | 1,15 | |||
| Totaal volume | 9,40 |
Tabel 1: componenten van monomeer oplossing. Alle concentraties worden gegeven in termen van g/mL (w/v) behalve PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we de ExPath protocol16, een variant van proExM5 die kan worden toegepast op de meest voorkomende soorten klinische biopsie monsters gebruikt in pathologie, met inbegrip van ffpe, H & E gekleurd, en vers-bevroren specimens op glazen glijbanen. Format conversie, antigeen retrieval en immunokleuring van de specimens volgen veelgebruikte protocollen die niet specifiek zijn voor ExPath. In tegenstelling tot het oorspronkelijke proExM protocol9, vertrouwt expath op een hogere concentratie EDTA in de verterings buffer, wat de uitbreiding van formalin-vaste weefsels verbetert, zoals aangetoond in de oorspronkelijke expath-studie16. Het protocol is gevalideerd in 5 − 10 μm dikke klinische specimens16, maar kan ook worden toegepast op dikkere weefselmonsters met enige modificatie. De meest kritieke stappen in dit protocol zijn: 1) de timing van de gelering stappen; 2) opstelling van de gelatie kamer; 3) parameters voor monster homogenisatie; en 4) behandeling van de gel.
De meest kritieke parameter voor dit protocol is de timing van de gelering stappen. Als de geleer-oplossing voortijdig polymeriseert, zal het monster niet voldoende aan de gel-matrix worden verankerd. Ontoereikende verankering en voortijdige gelatie kunnen verstoringen veroorzaken, de expansie beperken en resulteren in het verlies van doel moleculen (Figuur 4F, G). Het begin van de gelatie is afhankelijk van de temperatuur, daarom is het belangrijk om de gemengde geleer-oplossing bij 4 °c te houden alvorens deze op het doel monster te plaatsen. De initiator, APS, moet vers worden bereid en toegevoegd onmiddellijk voor het aanbrengen van de geleer oplossing. APS is niet stabiel bij RT en kan werkzaamheid verliezen na het ondergaan van vries-dooi cycli. Onvoldoende verankering kan ook het gevolg zijn van een verminderde reactiviteit van de verankerings verbinding, AcX, die activiteit kan verliezen na langdurige opslag of na contact met water. AcX heeft de activiteit gevonden na 6 maanden opslag in een drooghoudende omgeving bij-20 °C. Als voortijdige gelatie niet de vermoedelijke oorzaak van vervorming is, kan een nieuwe stamoplossing van AcX worden voorbereid.
Tijdens het instellen van de gelatie kamer kunnen luchtbellen onder het deksel van het afdekglas worden gevangen. Als deze bubbels boven of direct aan het monster raken, kunnen ze vervormingen veroorzaken. Ze kunnen worden verplaatst van het preparaat door het toevoegen van meer geleer oplossing door de zijkant van de kamer. Om luchtbellen te helpen voorkomen, kan een kleine druppel geleer oplossing op het deksel worden afgezet voordat deze over het weefsel wordt geplaatst.
Monster spijsvertering is afhankelijk van tijd, temperatuur, evenals weefsel eigenschappen, zoals dikte en weefseltype. Ontoereikende spijsvertering kan ook leiden tot vervormingen en resulteren in een expansie factor die kleiner is dan verwacht. Als onvolledige spijsvertering wordt vermoed, kan de digestie tijd en/of ProK concentratie worden verhoogd, met name in het geval van dikkere weefsels. ProK kan ook na verloop van tijd activiteit verliezen. Om zijn activiteit te behouden, moet ProK worden bewaard bij-20 °C en kan het worden gealicteerd in kleinere volumes om vrije dooi cycli te voorkomen.
Bij het hanteren van gehomogeniseerde monsters moet voorzichtig worden gelet, met name wanneer deze volledig is uitgebreid. Als het preparaat moeilijk te lokaliseren is bij onderdompeling in vloeistof, kan het verlichten van de container vanuit verschillende hoeken incident licht verstrooien om visualisatie van de gel mogelijk te maken. Volledig uitgebreide gels zijn kwetsbaar en kunnen breken tijdens het hanteren. Het gebruik van zachte borstels en plastic spatels wordt aanbevolen om de uitgebreide gels over te brengen.
Het ExPath protocol biedt een kosteneffectief alternatief voor de huidige superresolutie Imaging en elektronenmicroscopie technieken om nanoschaal structuren te ondervragen in klinische biopsie monsters. Hoewel ProK een gelijkmatige expansie van het monster na homogenisatie biedt, verhindert het verlies van eiwitten de ondervraging van andere streefdoelen na expansie. Het protocol kan echter eenvoudig worden uitgevoerd in een regulier NAT Lab. Het belangrijkste is dat Imaging van nanoschaal-functies kan worden uitgevoerd op conventionele breedveld-of confocale microscopen die vaak worden aangetroffen in biologie laboratoria en Imaging Core-faciliteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YZ en OB zijn twee van de uitvinders die octrooibescherming hebben aangevraagd en verkregen op een subset van de hier beschreven technologieën (Amerikaanse octrooien US20190064037A1, WO2018157074A1 en WO2018157048A1).
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het faculteits startfonds van de Carnegie Mellon University (YZ) en de nieuwe Innovator Award van NIH Director (DP2 OD025926-01 tot YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
