Summary
Наноразмерная визуализация образцов клинических тканей может улучшить понимание патогенеза болезни. Расширение патологии (ExPath) является версия расширения микроскопии (ExM), модифицированный для совместимости со стандартными клиническими образцами ткани, для изучения наномасштабной конфигурации биомолекул с помощью обычных дифракционных ограниченных микроскопов.
Abstract
В современной патологии оптическая микроскопия играет важную роль в диагностике заболеваний, выявляя микроскопические структуры клинических образцов. Однако фундаментальный предел физической дифракции предотвращает допрос наномасштабной анатомии и тонкие патологические изменения при использовании обычных оптических подходов к визуализации. Здесь мы описываем простой и недорогой протокол, называемый патологией расширения (ExPath), для наномасштабного оптического изображения общих типов клинических образцов первичной ткани, включая как фиксированные замороженные или формалин-фиксированный парафин встроенные (FFPE) ткани Разделы. Этот метод обходит предел оптической дифракции путем химического преобразования образцов тканей в гибрид ткани-гидрогеля и физически расширяя их изотрополено через несколько масштабов в чистой воде. Благодаря расширению, ранее неразрешимые молекулы отделяются и, таким образом, могут наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа.
Introduction
Исследование молекулярной организации тканей в трехмерном (3D) контексте может дать новое понимание биологических функций и развития болезней. Тем не менее, эти наноразмерные среды выходят за рамки возможностей разрешения обычных дифракционных ограниченных микроскопов (200–300 нм), где минимальное разрешимое расстояние, d определяется d q /NA. Здесь длина волны света и NA является численной диафрагмы (NA) системы визуализации. В последнее время прямая визуализация флуоресцентно маркированных молекул стала возможной благодаря недавно разработанным методам визуализации суперразрешения1,2,3,включая стимулирующее истощение выбросов (STED), фотоактивированная микроскопия локализации (PALM), стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и структурированная иллюминация микроскопии (SIM). Хотя эти методы визуализации произвели революцию в понимании биологической функции на наноуровне, на практике они часто полагаются на дорогостоящее и/или специализированное оборудование и этапы обработки изображений, могут иметь более медленное время приобретения по сравнению с обычные оптические изображения, требуют флюорофоров с конкретными характеристиками (например, возможность переключения фотографий и / или высокой фотостабильности). Кроме того, остается сложной задачей для выполнения 3D-супер-разрешение изображения на образцах тканей.
Микроскопия расширения (ExM), впервые введенная в 20154,обеспечивает альтернативное средство визуализации наноразмерных объектов (Злт;70 нм) путем физического расширения сохранившихся образцов, встроенных в набухаемый полиэлектролитовый гидрогель. Здесь ключевые биомолекулы и/или этикетки закреплены на месте в полимерной сети, которая может быть изотопно расширена после химической обработки. Поскольку физическое расширение увеличивает общее эффективное разрешение, молекулы, представляющие интерес, могут быть решены с помощью обычных систем визуализации с ограниченной дифракцией. С момента публикации оригинального протокола, где пользовательские синтезированные флуоресцентные этикетки были закреплены на полимерной сети4, новые стратегии были использованы для непосредственного якоря белков (задержка белка ExM, или proExM)5, 6,7,8,9 и РНК9,10,11,12 к гидрогелю, и увеличить физическое увеличение через итеративные расширение13 или адаптации гель химии8,14,15.
Здесь мы представляем адаптированную версию proExM, называемую патологией расширения (ExPath)16, которая была оптимизирована для форматов клинической патологии. Протокол преобразует клинические образцы, в том числе формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE), гематоксилин и эозин (H и E) окрашенных, и свежезамороженных человеческих тканей образцов, установленных на стеклянных слайдах, в состояние, совместимое с ExM. Белки затем прикрепляется к гидрогелю и выполняется механическая гомогенизация(рисунок 1)16. С 4-кратным линейным расширением образцов, многоцветные супер-разрешение (70 нм) изображения могут быть получены с помощью обычного конфокального микроскопа, имеющего только разрешение в 300 нм, а также могут быть объединены с другими методами визуализации супер-разрешения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка фондовых реагентов и решений
-
Приготовьте компоненты раствора гелеобразующего.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация раствора приведена в g/mL (w/v процент).- Сделать следующие фондовые решения: 38% (w/v) акрилат натрия (SA), 50% (w/v) акриламид (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), и 29.2% (w/v) хлорид натрия (NaCl). Растворите соединения в двойной деионизированной воде (ddH2O). Используйте суммы в таблице 1 в качестве эталона; подготовленные решения могут быть масштабированы вверх или вниз по объему по мере необходимости. Например, чтобы сделать 10 мл из 38% (w/v) SA раствор, добавьте 1,9 г SA к цилиндру 10 мл и добавьте ddH2O в объем 5 мл.
- Приготовьте 9,4 мл мономерного раствора при концентрации 1,06x, как показано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к концентрации 1x после добавления инициатора, ускорителя и ингибитора. Запас мономеров может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев или при -20 градусов для длительного хранения. - Подготовьте следующие стоковые растворы отдельно в ddH2O: 0,5% (w/v) ингибитора 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпипилипидин-1-оксил (4HT), который ингибирует гелеобразуцию, чтобы позволить диффузию раствора гелегеля в ткани, 10% (v/v) инициатор тетраметилэтиленедиамиамин (TEMED), который ускоряет радикальное выработку аммония persulfate (APS), и 10% (w/v) APS, который инициирует процесс гелегелинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы 4HT и TEMED могут быть подготовлены в 1 мл aliquots и храниться при -20 градусов по Цельсию в течение не менее 6 месяцев. Было установлено, что APS теряет эффективность после длительного хранения и лучше всего готовить в небольших количествах (0,1 мл) непосредственно перед гелеобразующей.
- Подготовка пищеварения буфера (50 мМ Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0,5% "W/v" неионический сурфактант, 0,8 М NaCl) путем объединения 25 мл 1 M Tris pH 8 (3,03 г базы Tris в 25 мл ddH2O), 25 мл EDTA (0,5 м. , 2,25 г неионического сурфактанта и 23,38 г NaCl. Добавьте ddH2O общим объемом 500 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение можно масштабировать вверх или вниз по мере необходимости и храниться при 4 градусах Цельсия. Протеиназа K (ProK) будет добавлена непосредственно перед шагом пищеварения. - Приготовьте 20 мМ натриевого цитрата раствора, объединив 2,941 г трибазового дигидрата натрия с 500 мл дДГ2О и регулировав рН до 8,0 при комнатной температуре (RT). Масштабируйте объем запасов по мере необходимости.
- Подготовка стокового раствора 6-((акрилоил)аминокислоты, синцимидилового эфира (акрилоил-Х, SE; AcX), якорь соединения. Растворите AcX в 500 л ангидроусового диметилсульксида (DMSO) для конечной концентрации 10 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться в высохшой среде при -20 градусов по Цельсию в 20 аликотах. - Если не использовать коммерчески доступные буферы для иммуно-пятна, подготовьте блокирующий буфер. Используйте блокирующий буфер в размере 5% (v/v) нормальной сыворотки животных и 0,1% (w/v) нонионического сурфактанта в 1x фосфатно-буферизированном сольнике (PBS) и выберите сыворотку на основе животного-хозяина вторичных антител. Например, чтобы подготовить 500 мл блокирующий буфер для антител, поднятых у козы, смешайте 25 мл козьей сыворотки, 0,45 г нонионического сурфактанта и 1x PBS на объем 500 мл.
2. Подготовка архивных и свежеподготовленных клинических тканей слайды для ExPath
- Преобразуйте ткань в совместимый формат ExPath. Выберите один из четырех следующих шагов (2.1.1-2.1.4) на основе того, как был подготовлен образец: слайды FFPE, окрашенные слайды FFPE, или нефиксированные или фиксированные замороженные слайды ткани в оптимальном решении температуры резки (OCT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Они основаны на стандартных шагах восстановления образцов патологии и не являются специфическими для протокола ExPath.- Клинические образцы FFPE
- Приготовьте 30 мл 95% этанола, 70% этанола и 50% этанола. Измерьте 30 мл ксилена, 100% этанола и ddH2O.
- Поместите слайд с образцом в 50 мл конического с помощью щипки и добавить 15 мл ксилена. Крышка трубки и поместите его горизонтально на орбитальный шейкер примерно на 60 об / мин и инкубировать на RT в течение 3 минут для каждого решения. Повторите с остальными 15 мл ксилена.
- Повторите шаг 2.1.1.2 со 100% этанолом, 95% этанолом, 70% этанолом, 50% этанолом и ddH2O вместо ксилена.
- Запятнанные и установленные постоянные горки
- Поместите горку в 100 мм чашку Петри и накройте ксиленом. Аккуратно удалите крышку с помощью лезвия бритвы. Если крышка не легко удалить, верните слайд к силену до тех пор, пока крышка не ослабит.
- Процесс с использованием шагов для образцов FFPE (шаги 2.1.1.1-2.1.1.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае H и E окрашенных слайдов, пятна устраняются в процессе расширения.
- Нефиксированные замороженные ткани в растворе OCT
- Зафиксировать ткань в ацетоне при -20 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Вымойте образцы с 1x PBS решение 3 раза в течение 10 минут каждый на RT.
- Ранее фиксированные, замороженные клинические слайды ткани
- Инкубировать слайды в течение 2 мин на RT, чтобы расплавить раствор OCT.
- Вымойте образец с 1x PBS решение 3 раза в течение 5 минут каждый на RT.
- Клинические образцы FFPE
- Выполните тепловую обработку для поиска антигена на всех образцах после преобразования формата.
- Добавьте 20 мМ цитрат раствор (pH 8 на RT) в термостойком контейнере, например, в банку для окрашивания слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там должно быть достаточно раствора для покрытия ткани, установленной на слайде (50 мл для стандартной слайд окрашивания банку). - Нагрейте раствор цитрата до 100 градусов по Цельсию в микроволновой печи и поместите слайд в раствор. Немедленно перенесите контейнер в инкубационную камеру и инкубацию при 60 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайды могут быть помещены в чашках Петри и покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия.
- Добавьте 20 мМ цитрат раствор (pH 8 на RT) в термостойком контейнере, например, в банку для окрашивания слайдов.
- Пятно образца с использованием стандартных иммунофлуоресценции (IF)/иммуногистохимии (IHC) окрашивания протоколов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специфические концентрации первичных и вторичных антител и длительность окрашивания зависят от концентраций, предложенных производителем, или от оптимизации для конкретного эксперимента.- Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг ткани раздела (ы) на слайде, чтобы свести к минимуму объем раствора, необходимого для покрытия ткани. Поместите слайд в блюдо достаточно большой, чтобы соответствовать слайд. Для стандартной 3-дюймовой горки используйте 100-мм чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофобная ручка не мешает полимеризации образца и процессу пищеварения. - Инкубировать ткань с блокирующим буфером на 1 ч при 37 градусах По кв.м., 2 ч на РТ или на 4 градуса Цельсия на ночь, чтобы уменьшить неспецифические связывания.
- Разбавить первичные антитела к желаемой концентрации в соответствующем количестве подготовленного блокирующего буфера (или другого предпочтительного буфера окрашивания). Инкубировать ткани с основным раствором антитела, по крайней мере 3 ч на RT или 37 градусов по Цельсию, или на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть помещены в увлажненный контейнер (например, чашка Петри с влажной салфеткой), чтобы предотвратить высыхание тканей. Как правило, антитела были разбавлены до 1:100-1:500 в 200-500 л буфера, в зависимости от размера ткани и используемых антител. - Вымойте ткань с подготовленным блокирующим буфером (или другим предпочтительным буфером для мытья) 3 раза в течение 10 минут на RT.
- Разбавить вторичные антитела (и 300 nM 4 ",6-диамидино-2-фенилинола »DAPI» при желании), в подготовленном блокирующем буфере (или другом предпочтительном буфере окрашивания) до концентрации приблизительно 10 мкг/мл. Инкубировать ткани во вторичном растворе антитела, по крайней мере 1 ч на RT или 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки могут быть скорректированы в зависимости от используемых антител и толщины ткани. Вторичные антитела, содержащие красители цианина (Cy3, Cy5, Alexa 647), не совместимы с протоколом ExM при применении предварительной полимеризации. Предлагаемые красители включают Alexa 488 (зеленый), Alexa 546 (оранжевый/красный), и Atto 647N или CF633 (далеко-красный). DAPI должен быть повторно применен после расширения, так как он смывается в процессе расширения. - Вымойте ткань с подготовленным блокирующим буфером (или другим предпочтительным буфером для мытья) 3 раза в течение 10 минут каждый на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайды могут быть помещены в чашках Петри и покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия. - Выполняйте флуоресцентную визуализацию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по выбору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для определения биологической длины с использованием фактора расширения путем сравнения изображений до и после расширения. Для облегчения изображения после расширения следует отбирать легко идентифицируемые области, представляющие интерес, и собирать изображения как при низком, так и при высоком увеличении.
- Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг ткани раздела (ы) на слайде, чтобы свести к минимуму объем раствора, необходимого для покрытия ткани. Поместите слайд в блюдо достаточно большой, чтобы соответствовать слайд. Для стандартной 3-дюймовой горки используйте 100-мм чашку Петри.
3. На ситу полимеризация образцов
-
Инкубировать образец в якорном растворе.
- Подготовьте якорный раствор (обычно 250 л достаточно, чтобы покрыть секцию тканей) путем разбавления раствора acX в 1x PBS до концентрации 0,03 мг/мл для образцов, зафиксированных неальдегидными фиксаторами или 0,1 мг/мл для образцов, зафиксированных альдегидными фиксаторами , которые имеют меньше свободных аминов доступны реагировать с AcX.
- Поместите слайд в 100 мм Чашка Петри и пипетка якорь решение над тканью. Инкубировать не менее 3 ч на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия.
-
Инкубировать образцы в растворе гелеобразующего.
- Приготовьте не менее 100-кратного избыточного объема раствора гелеобразующего. На 200 кЛ, объедините следующее, в порядке: 188 л мономерного раствора, 4 л 0,5% 4HT биржевого раствора (1:50 разбавления, конечная концентрация: 0,01%), 4 л 10% стокового раствора TEMED (1:50 разбавления, конечная концентрация 0,2%) и 4 л 10% apS- разбавления, конечная концентрация 0,2%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор gelling следует сделать непосредственно перед использованием. Раствор должен быть на уровне 4 градусов по Цельсию и APS раствор должен быть добавлен последним, чтобы предотвратить преждевременное gelling. - Удалите лишний раствор из ткани и поместите слайд в 100 мм чашку Петри. Добавьте свежий, холодный раствор гелеобразующего к образцу и инкубировать смесь на ткани в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы позволить диффузии раствора в ткани.
- Приготовьте не менее 100-кратного избыточного объема раствора гелеобразующего. На 200 кЛ, объедините следующее, в порядке: 188 л мономерного раствора, 4 л 0,5% 4HT биржевого раствора (1:50 разбавления, конечная концентрация: 0,01%), 4 л 10% стокового раствора TEMED (1:50 разбавления, конечная концентрация 0,2%) и 4 л 10% apS- разбавления, конечная концентрация 0,2%).
-
Постройте камеру на слайде вокруг образца(Рисунок 2А), не нарушая раствор гелеобразующего.
- Сделать прокладки для гелеобразующей камеры тонко резки куски крышки стекла с помощью алмазного ножа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения расширения изображения после, прокладки должны быть близко по толщине к образцу ткани, чтобы уменьшить количество чистого геля над тканью. Стекло номер 1,5 может быть использовано для стандартных клинических образцов (5–10 мкм). Обложка стекла части могут быть уложены для более толстых образцов. - Защищайте прокладки по обе стороны ткани, используя капли воды (10 евро).
- Тщательно поместите крышку крышки крышки крышки над слайдом, убедившись, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха над тканью(Рисунок 2B).
- Сделать прокладки для гелеобразующей камеры тонко резки куски крышки стекла с помощью алмазного ножа.
- Инкубировать образец при 37 градусах Цельсия в увлажненной среде (например, закрытое блюдо Петри с влажной салфеткой) в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Слайд-камера может храниться внутри запечатанной чашки Петри при 4 градусах Цельсия.
4. Образец пищеварения
-
Снимите крышку гелеобразующей камеры, аккуратно раздвижной лезвием бритвы под крышкой и медленно поднимая крышку с поверхности геля. Обрезать пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем. Вырезать гель асимметрично отслеживать ориентацию геля после гомогенизации, так как образец станет прозрачным.
- Разбавить ProK на 1:200 в буфере пищеварения (окончательная концентрация 4 U/mL) перед использованием. Подготовьте достаточное решение, чтобы полностью погрузить гель; один колодец из четырех колодцев пластиковой пластины культуры клеток требует по крайней мере 3 мл на скважину.
- Инкубировать образец в закрытом контейнере, содержащем буфер пищеварения в течение 3 ч при 60 градусах Цельсия. Если образец не отсоединяет от слайда во время пищеварения, используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно удалить образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть полностью погружен в буфер пищеварения, чтобы предотвратить высыхание образца и помещен в крытый контейнер (маленькая слайд-бокс, пластиковая скважина, чашка Петри и т.д.), которая может быть запечатана пленкой.
5. Расширение образцов и визуализация
- Используйте мягкую кисть для переноса образца в 1x PBS в контейнере, совместимом с желаемой системой визуализации и достаточно большой, чтобы вместить полностью расширенный гель. Убедитесь, что ткань помещается с образца стороне вниз, если изображение на перевернутой системы или вверх, если изображение на вертикальной системе, чтобы свести к минимуму расстояние от цели изображения к образцу. При необходимости переверните гель с помощью мягкой кисти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Боковое освещение от светодиода может быть использовано, чтобы сделать их видимыми в жидкости. Стандартная 6-хорошая пластина может вместить образцы, которые имеют предварительно расширенный диаметр менее 0,6 см. Стеклянная нижняя пластина должна использоваться для визуализации на перевернутой системе. - Вымойте образцы в 1x PBS на RT в течение 10 мин. При желании повторно пятно образца с 300 нм DAPI, как процесс пищеварения смейт DAPI пятно. Удалите PBS и пятно с 300 нм DAPI разбавленной в 1x PBS в течение 20 минут на RT, а затем 10 мин мыть с 1x PBS на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть покрыты 1x PBS и храниться при 4 градусах Цельсия, прежде чем перейти к следующему шагу. - Чтобы расширить образцы, заменить PBS и мыть с избыточным объемом ddH2O (по крайней мере 10x окончательный объем геля) 3-5 раз в течение 10 минут каждый, на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: После3-й или4-й стирки расширение образца должно начать наплато. Для хранения, чтобы предотвратить рост бактерий, ddH2O может быть дополнен 0,002% -0,01% азида натрия (NaN3). В этом случае конечный коэффициент расширения реверсивно снижается на 10%. - Выполняйте флуоресценцию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по выбору.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения дрейфа гелей излишнюю жидкость можно удалить из скважины. Гели также могут быть обездвижены с агарозой с низким плавным газом на 1,5–2%. Приготовьте в воде низкорасплавленную агарозу в 2,4 раза больше объема раствора. Разогрейте раствор на водяной бане 40 градусов или в микроволновой печи в течение 10–20 с, чтобы растопить раствор. Пипетка расплавленная агароза по краям геля. После того, как агарозза затвердеть на RT или 4 кС, добавить воду в образец, чтобы предотвратить обезвоживание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если протокол был успешно выполнен(рисунок 1), образцы будут отображаться как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации(рисунок 3A) и может расшириться в 3-4,5x в воде(рисунок 3B), обеспечение эффективного разрешения 70 нм в зависимости от конечного фактора расширения и системы визуализации используется5,16. На рисунке 4 показаны примеры изображений образца почек FFPE толщиной 5 мкм, обработанных с помощью протокола ExPath. Полное расширение гелеобразных образцов привело к 4,5x коэффициент расширения в воде, давая эффективное разрешение 63 нм при изображении с использованием 0,95 NA цели. Ткань была сначала предварительно обработана ксиленом для удаления парафина и регидратации (раздел 2.1.1), а затем антиген-поиск с цитратом буфера (раздел 2.2). Восстановленная ткань была затем окрашена антителами для альфа-актинина 4 (ACTN4) и vimentin, вместе с DAPI для визуализации ядерной ДНК и зародыша пшеницы агглютинин (WGA), для обозначения углеводов. Образец был затем изображен с помощью вращающегося диска конфокальный микроскоп(Рисунок 4A,B,D). Ткани лечились в соответствии с вышеуказанным протоколом и полностью расширялись в воде(рисунок 4C,E). Аналогичным образом, на рисунке 5 показаны примеры изображений Н И Е окрашенных нормальной ткани молочной железы(рисунок 5А), который лечился ксиленом (раздел 2.1.2), чтобы удалить крышку стекла, а затем рассматривать в качестве образца FFPE (раздел 2.1.1). Во время гомогенизации, Н И E пятно выводиться из ткани. После расширения изображения DAPI окрашенных образца, полученных на спиннинг диска конфокальный микроскоп(Рисунок 5B) по сравнению с предварительнорасширения изображения указывают на расширение фактор 5,1, давая эффективное разрешение 43 нм при изображении с объектив NA 1.15.
Примеры данных о нефиксированных замороженных срезах почек, обработанных с помощью протокола ExPath, можно увидеть на рисунке 6. Ткань была впервые зафиксирована в холодном ацетоне (раздел 2.1.3) и окрашена ACTN4, vimentin, DAPI и WGA. Сравнение изображений, предшествущих расширению (не показанных) и изображений после расширения, указывает на коэффициент расширения 4,5. Сравнительные данные из ацетона фиксированной замороженных образцов почек, что из образцов FFPE(Рисунок 4C,E) показывает, что наблюдается снижение качества actN4 окрашивания в расширенном образце FFPE, что может быть связано с ухудшением антигенности из-за метода фиксации16.
Рисунок 1: Схема патологии расширения (ExPath) рабочего процесса. Предварительная обработка клинически архивных тканевых слайдов сначала выполняется на основе формата хранения. Образцы затем окрашены с помощью обычных иммуностоинных протоколов и предварительнорасширения изображения получены. Образцы затем обрабатываются акрилоил-X SE (AcX) для якоря белков гидрогеля. На месте полимеризация предварительно формируется до механической гомогенизации с использованием протеиназа K (ProK). Образцы могут быть расширены в ddH2O до изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гелационная камера для образцов патологии. (A) Два прокладки, такие как два куска #1,5 крышка стекла огранки с алмазным ножом, помещаются по обе стороны от ткани после инкубации образца в растворе гелеобразного при 4 градусах Цельсия. Прокладчики должны быть толще, чем кусочки ткани, чтобы предотвратить сжатие образца. (B) Крышка, например, кусок #1,5 крышки стекла, используется для покрытия образца до инкубации при 37 градусов по Цельсию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Пример расширения выборки. 5 мкм толщиной образца почек после гомогенизации, (A) до и (B) после расширения в ddH2O показано. Сетка квадратов 5 мм х 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель результаты от 5 мкм толщиной FFPE образцов почек. (A)Предварительно расширенное изображение. (B) Увеличенное изображение предварительного расширения обозначенного региона интереса в панели A и (C) соответственно изображение столб-расширения такого же региона интереса после образца полно было расширено в воде. (D) Увеличенное изображение изложенного региона, интересуемого в панели B и (E) соответствующее изображение после расширения того же региона интереса после того, как образец был полностью расширен в воде. Трещины, искажения и потеря помеченных целей могут быть результатом неадекватного крепления и/или гомогенизации(F,G). Все изображения были получены с помощью вращающегося диска конфокальный микроскоп с 20x (NA 0.95; погружение воды) цель(A-E, G) или 10x (NA 0.5) цель (F). Синий, DAPI; зеленый, vimentin; красный, альфа-актинин 4 (ACTN4); пурпурный, WGA. Шкала баров - 100 мкм(A,F,G, желтые бары масштаба указывают на пост-расширения изображения); 50 мкм(B), 50 мкм (C, физический размер после расширения 225 мкм; увеличение фактор 4,5); 25 мкм(D); 25 мкм(E, физический размер после расширения 112,5 мкм; коэффициент расширения 4,5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель результаты от Н И Е окрашенных нормальной ткани молочной железы. (A) Брайтфилд изображение предварительно расширенной Н И E окрашенных тканей, принятых с 40x (0,95 NA) цели. (B) После расширения DAPI изображение того же региона интереса после образца был полностью расширен в воде. Изображение было получено на вращающемся диске конфокального микроскопа с помощью 40x (NA 1.15; погружение в воду) цель. Шкала баров No 10 мкм(A, желтая шкала бар указывает после расширения изображения) и 2 мкм (B, физический размер после расширения 50,1 мкм; увеличение фактор 5,1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Репрезентативные результаты свежих замороженных образцов почек после расширения, полученных на вращающемся диске конфокального микроскопа с целью 40x (NA 1.15; погружение в воду). Синий й виментин; зеленый и альфа-актинин 4 (ACTN4); красный коллаген IV; серый и DAPI. Шкала бар No 10 мкм (физический размер после расширения 45 мкм; увеличение фактор 4,5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компонент | Концентрация запасов | Объем запасов (мЛ) | Окончательная концентрация | Окончательная сумма за 10 мл |
| Акрилат натрия | 0,380 г/мл | 2.25 | 0,086 г/мл | 0,86 г |
| Акриламида | 0,500 г/мл | 0.50 | 0,025 г/мл | 0,25 г |
| Н.Н.-Метиленебисацриламид | 0,020 г/мл | 0.50 | 0,001 г/мл | 0,10 г |
| Хлорид натрия | 0,292 г/мл | 4.00 | 0,117 г/мл | 1,17 г |
| Pbs | 10x | 1.00 | 1x | 1x |
| Воды | 1.15 | |||
| Общий объем | 9.40 |
Таблица 1: Компоненты мономерного решения. Все концентрации даются с точки зрения г/мл (w/v), за исключением PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем протокол ExPath16, вариант proExM5, который может быть применен к наиболее распространенным типам клинических образцов биопсии, используемых в патологии, в том числе FFPE, H и E окрашенных, и свежезамороженных образцов на стеклянных слайдах. Преобразование формата, извлечение антигена и иммуностоирование образцов следуют общепринятым протоколам, которые не являются специфическими для ExPath. В отличие от оригинального протокола proExM9, ExPath опирается на более высокую концентрацию EDTA в буфере пищеварения, что улучшает расширение формалино-фиксированных тканей, как показано в первоначальном исследовании ExPath16. Протокол был проверен в 5 х 10 мкм толщиной клинических образцов16, но также может быть применен к более толстым образцам ткани с некоторыми изменениями. Наиболее важными шагами в этом протоколе являются: 1) время шагов гелирования; 2) установка гелеобразуальной камеры; 3) параметры гомогенизации образцов; и 4) обработка геля.
Наиболее важным параметром для этого протокола является время шага гелирования. Если раствор гелеобразующего раствора преждевременно полимеризируется, образец не будет достаточно закреплен на гелевой матрице. Недостаточное закрепление и преждевременное гелевание может вызвать искажения, ограничить расширение, и привести к потере молекул мишени(Рисунок 4F,G). Начало гелирования зависит от температуры, поэтому важно сохранить раствор смешанного гелеобразующего при температуре 4 градусов по Цельсию, прежде чем поместить его на целевой образец. Инициатор, APS, должен быть свежеприготовлен и добавлен непосредственно перед нанесением раствора гелеобразующего. APS не является стабильным на RT и может потерять эффективность после прохождения циклов замораживания оттепели. Недостаточное закрепление также может быть результатом снижения реактивности якорного соединения AcX, которое может потерять активность после длительного хранения или после контакта с водой. Было установлено, что AcX сохраняет активность после 6 месяцев хранения в высохшенной среде при -20 градусов по Цельсию. Если преждевременное гелирование не является предполагаемой причиной искажения, может быть подготовлено новое акционерное решение AcX.
Во время установки гелеобразуальной камеры воздушные пузырьки могут оказаться в ловушке под крышкой крышки крышки крышки. Если эти пузырьки находятся на вершине или непосредственно касаясь образца, они могут вызвать искажения. Они могут быть отодвинуты от образца, добавив больше раствора гелеобразующего через сторону камеры. Чтобы предотвратить пузырьки воздуха, небольшая капля раствора гелеобразующего может быть отложена на крышку, прежде чем поместить его на ткани.
Пищеварение образцов зависит от времени, температуры, а также свойств тканей, таких как толщина и тип ткани. Недостаточное пищеварение может также вызвать искажения и привести к фактору расширения, который меньше, чем ожидалось. При подозрении на неполное пищеварение может быть увеличено время пищеварения и/или концентрация ProK, особенно в случае более толстых тканей. ProK также может потерять активность с течением времени. Чтобы сохранить свою активность, ProK должен храниться при -20 градусов по Цельсию и может быть аликационом в меньших объемах, чтобы избежать циклов свободной оттепели.
Следует принимать меры при обращении с гомогенизированными образцами, особенно при полном расширении. Если образец трудно найти при погружении в жидкость, освещая контейнер с разных углов может рассеять свет инцидента, чтобы визуализация геля. Полностью расширенные гели хрупкие и могут ломаться во время обработки. Использование мягких щеток и пластиковых шпателей рекомендуется для переноса расширенных гелей.
Протокол ExPath предоставляет экономически эффективную альтернативу современным методам визуализации суперразрешения и электронной микроскопии для изучения наноразмерных структур в клинических образцах биопсии. Хотя ProK обеспечивает даже расширение образца после гомогенизации, потеря белков предотвращает допрос других целей, представляющих интерес после расширения. Тем не менее, протокол может быть легко выполнен в любой обычной влажной лаборатории. Самое главное, визуализация наноразмерных объектов может быть проведена на обычных широкоугольных или конфокальных микроскопах, которые обычно встречаются в биологических лабораториях и основных объектах визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y z и OB являются двумя из изобретателей, которые подали и получили патентную защиту на подмножестве технологий, описанных здесь (патенты США US20190064037A1, WO2018157074A1, и WO2018157048A1).
Acknowledgments
Эта работа была поддержана юридическим фондом университета Карнеги-Меллона (Y) и премией директора NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 в Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
