Summary
Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.
Abstract
RNA-opbrengst en-integriteit zijn bepalend voor RNA-analyse. Echter, het is vaak technisch uitdagend om te handhaven RNA-integriteit gedurende de gehele Laser Capture microdissection (LCM) procedure. Aangezien LCM-studies werken met lage hoeveelheden materiaal, zijn bezorgdheid over beperkte RNA-opbrengsten ook belangrijk. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. Het effect van kleurings protocol, dikte van cryosecties, microdissected weefsel hoeveelheid, RNA-extractie Kit en LCM-systeem dat wordt gebruikt op RNA-opbrengst en integriteit verkregen uit microdissected-botcellen werd geëvalueerd. De diepgevroren botgedeelten van acht μm werden gemaakt met behulp van een zelfklevende folie en bevlekt met een snel protocol voor een commerciële LCM vlek. Het monster werd ingeklemd tussen een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en de zelfklevende folie. Een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname en een op kolom gebaseerde RNA-extractiemethode werden gebruikt om hoge kwaliteit Rna's van voldoende opbrengst te verkrijgen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Echter, de hier gerapporteerde LCM protocol kan worden gebruikt om te studeren in situ genexpressie in cellen van een hard weefsel in zowel fysiologische omstandigheden en ziekteprocessen.
Introduction
Weefsels bestaan uit heterogene en ruimtelijk gedistribueerde celtypen. Verschillende celtypen in een bepaald weefsel kunnen verschillend reageren op hetzelfde signaal. Daarom is het essentieel om specifieke celpopulaties te isoleren voor de beoordeling van de rol van verschillende celtypen in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Laser Capture microdissection (LCM) biedt een relatief snelle en precieze methode voor het isoleren en verwijderen van gespecificeerde cellen uit complexe weefsels1. LCM-systemen gebruiken de kracht van een laserstraal om de cellen van belang van histologische weefsel secties te scheiden zonder de noodzaak voor enzymatische verwerking of groei in cultuur. Dit betekent dat de cellen in hun natuurlijke weefsel habitat, en dat weefsel architectuur met inbegrip van de ruimtelijke relatie tussen de verschillende cellen behouden blijft. Morfologie van zowel de gevangen cellen als het rest weefsel is goed bewaard gebleven, en verschillende weefsel componenten kunnen opeenvolgend uit dezelfde dia worden bemonsterd. Geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de daaropvolgende analyse van hun RNA-, DNA-, eiwit-of metaboliet gehalte2,3.
Om genexpressie in verschillende celpopulaties of na verschillende behandelingen te analyseren, is het noodzakelijk om mrna's van voldoende kwaliteit en kwantiteit te verkrijgen voor de daaropvolgende analyse4,5. In tegenstelling tot DNA zijn Rna's gevoeliger voor fixatie en wordt het gebruik van bevroren weefsel aanbevolen wanneer het doel is om RNA te bestuderen. Aangezien Mrna's snel worden afgebroken door alomtegenwoordige ribonucleases (RNase), zijn strenge RNase-vrije condities tijdens het hanteren en voorbereiden van het preparaat en het vermijden van opslag van monsters bij kamertemperatuur vereist. Bovendien zijn snelle technieken zonder verlengde waterige fase stappen cruciaal om RNA afbraak6te voorkomen. Het RNA-rendement en de integriteit kunnen ook worden beïnvloed door het LCM-proces en het LCM-systeem dat7,8wordt gebruikt. Momenteel zijn er vier LCM-systemen met verschillende werkingsprincipes beschikbaar2. De methode van RNA-extractie kan ook belangrijk zijn, omdat verschillende RNA-isolatiekits zijn getest met aanzienlijke verschillen in RNA-hoeveelheid en kwaliteit7,8.
Elke weefsel bereidingsmethode vereist het vinden van een evenwicht tussen het verkrijgen van een goed morfologisch contrast en het behoud van RNA-integriteit voor verdere analyses. Voor het klaarmaken van bevroren delen van bot, werd een zelfklevende film ontwikkeld en continu verbeterd9. De botten secties worden gesneden en direct op de zelfklevende folie gekleurd. Deze zelfklevende folie is toepasbaar op vele soorten vlekken, en kan worden gebruikt om de cellen van belang te isoleren van botcryosecties met behulp van LCM9,10,11,12,13, 14. Alle stappen, waaronder de chirurgische verwijdering, inbedding, invriezen, snijden en vlekken, kunnen binnen minder dan een uur worden voltooid. Belangrijk is dat cellen zoals osteoblasten, botvoercellen en osteoclasten duidelijk kunnen worden geïdentificeerd9,10,11,12,13,14. Deze methode heeft het voordeel dat het snel en eenvoudig is. Een alternatieve methode voor het genereren van botcryosecties is het gebruik van het tape transfersysteem15. De laatste techniek is echter meer tijdrovend en vereist extra instrumentatie, omdat de secties van de plakband moeten worden overgebracht naar voorgecoate membraan glaasjes door ultraviolette (UV) Cross-linking. Hoewel het tape transfersysteem met succes is gekoppeld aan LCM16,17,18,19, moet worden opgemerkt dat de kruislings gekoppelde coating een achtergrond patroon kan creëren dat kan interfereren met cel-type identificatie20.
Typisch, slechts kleine hoeveelheden van RNA worden geëxtraheerd uit micro-ontleed cellen, en RNA kwaliteit en kwantiteit worden vaak beoordeeld door micro-capillaire elektroforese21. Een computerprogramma wordt gebruikt om een index van kwaliteit toe te wijzen aan RNA-extracten die RNA-integriteits nummer (RIN) worden genoemd. Een RIN-waarde van 1,0 duidt volledig gedegradeerd RNA aan, terwijl een waarde van 10,0 suggereert dat het RNA volledig intact is22. Meestal worden indexen van meer dan 5 voldoende geacht voor RNA-studies. Genexpressie patronen in monsters met een RIN-waarde van 5,0 − 10,0 zijn gemeld om goed te correleren met elkaar23. Hoewel de gevoeligheid van deze methode hoog is, omdat er zo weinig als 50 pg/μL van totaal RNA kan worden gedetecteerd, kan het zeer moeilijk zijn om een kwaliteitsbeoordeling te verkrijgen als de RNA-concentratie in het monster zeer laag is. Daarom, om de kwaliteit van RNA te beoordelen, wordt de weefsel sectie die overblijft na de LCM vaak gebruikt om RNA te extraheren, door Pipetteer buffer op de dia24.
Hoewel LCM op grote schaal is gebruikt op verschillende bevroren weefsels, worden de RIN-waarden van geëxtraheerde Rna's zelden gerapporteerd. Bovendien zijn er geen vergelijkende studies om de meest geschikte methode voor het bestuderen van RNA in muis botten te verduidelijken. In de huidige studie werden bevroren delen van volwassen muis dijbeen gebruikt om de monstervoorbereiding, het LCM-protocol en de RNA-extractie te optimaliseren om hoge kwaliteit rna's te verkrijgen. Het huidige protocol is speciaal geoptimaliseerd voor het LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Botweefsel van muizen werd gebruikt in strikte overeenstemming met de heersende richtlijnen voor dierenverzorging en alle inspanningen werden gedaan om dierenleed te minimaliseren.
1. dieren en inbedding bevriezen
- Huisdieren in omstandigheden van constante kamertemperatuur (RT; 24 °C) en een 12 h licht/12 uur donkere cyclus met gratis toegang tot voedsel en water.
Opmerking: bot weefsels in deze studie werden verkregen uit 3 maanden oude mannelijke wild type C57BL/6 muizen. - Bij obductie, exsanguinate muizen uit de abdominale Vena Cava onder narcose (ketamine/xylazine, 100/6 mg/kg intraperitoneale).
Opmerking: Om RNA afbraak te voorkomen, gebruik RNase-vrije instrumenten en materialen, Draag handschoenen en werk snel het vermijden van opslag van monsters bij RT gedurende het hele experiment. - Verwijder hele dijbeen snel, reinig ze van omringende zachte weefsels met scalpel en papieren handdoeken. Giet de optimale snijtemperatuur (OCT) in de insluitings mal en zet het dijbeen in de bodem van de insluitings mal. Klik de monsters in vloeibare stikstof in de vriezer. OCT is transparant op RT en wit wanneer bevroren.
- Eenmaal volledig bevroren, wikkel de monsters in folie en breng ze over op droogijs tot-80 °C. Bewaar monsters bij-80 °C tot verdere verwerking.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
2. voorbereiding van de sectie
- Stel de temperatuur in de cryostaat in op-19 °C en van de blok houder tot-17 °C. Veeg het cryostaat-interieur schoon met 70% ethanol. Plaats het wegwerpblad voor harde weefsels, de glaasjes en een passend gereedschap in de cryostaat om af te koelen. Bewaar ze in het cryostaat voor de duur van het snijden.
- Breng het bevroren weefsel blok op droogijs over naar de cryostaat en laat het minstens 10 minuten equilibraten.
Opmerking: Vermijd repetitief ontdooien en frequent fietsen van een blok van-80 °C tot-19 °C voor cryosnijden. - Druk op de onderkant van de insluitings mal om het LGO-blok uit de mal te duwen. Breng voldoende OCT medium aan op de blok houder om het blok te hechten. Wacht tot het LGO-medium volledig is bevroren.
- Plaats de blok houder in de objecthouder en draai hem op zijn plaats. Pas de bladpositie aan en trim het blok met behulp van 15 μm snij stappen om de LGO te verwijderen die het monster bedekken. Als het monster eerder is geknipt en het oppervlak is blootgesteld aan lucht, gooi dan de eerste 2 − 3 weefsel gedeelten van het blok weg.
- Pas de cryostaat aan om 8 μm-secties te genereren en 2 − 3 cryosecties te knippen die zullen worden weggegooid (de eerste paar is meestal dikker dan 8 μm). Plaats de zelfklevende folie op het blok en gebruik een passend gereedschap om de film aan het blok te hechten. Maak de snede langzaam en met een constante snelheid die de sectie door de film vasthoudt.
- Plaats de film (het monster naar boven) onmiddellijk op een voorgekookte glazen schuif (op de cryobar binnen het cryostat) om het monster niet te ontdooien. Gebruik tape om de film op de glasplaat te bevestigen voor eenvoudigere kleuring. Ga onmiddellijk door met het kleurings protocol.
3. Rapid-kleurings Protocol
- Bereid 40 mL van de volgende oplossingen in 50 mL tubes en zet ze op ijs: 95% ethanol, RNase-vrij water, 100% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen. Voer alle stappen uit op ijs (behalve de kleuring). Bereid voor elke experimentele dag alle waterige reagentia vers met RNase-vrij water.
Let op: Werk in de motorkap om intoxicatie door xyleen te voorkomen. - Inbroed secties voor 30 s in 95% ethanol, DIP secties 30 s in RNase-vrij water te verwijderen OCT zorgvuldig en volledig die kunnen interfereren met LCM en downstream toepassingen.
- Breng 50 μL commerciële LCM bevroren sectie vlek (tafel van de materialen) op de sectie, inbroed voor 10 sec. bij RT en giet het af door de rand van de glijbaan op absorberend tissuepapier te plaatsen. Verwijder overtollig vlek door 30 s in 100% ethanol te spoelen.
- Dompel de botten onder in een tweede buis met 100% ethanol voor 30 sec. en breng ze over naar 100% xyleen voor 30 sec.
- Zet zelfklevende folie (monster naar boven gericht) op een droge glazen glijbaan als ondersteuning. Zorg dat de film niet wordt beïnvloed en zo plat mogelijk wordt geplaatst. Laat het monster niet volledig drogen.
- Plaats een PET membraan frame dia erop. Druk kort op een gehandschoende vinger op het membraan om het aan de film te bevestigen. Het monster wordt vervolgens ingeklemd tussen het membraan en de Kleef film. De zelfklevende folie mag niet worden gevouwen of gerimpeld en er mogen geen luchtbellen tussen de folie en het membraan zijn. Ga onmiddellijk door met de LCM.
4. laser Capture Microdissectie
- Reinig de stage-en cap-houder van RNase met behulp van oppervlakte ontsmettings (tabel met materialen). Laad de glijbaan en de doppen respectievelijk in de houder en de dop.
- Pas de focus aan en verkrijg een dia-overzicht met een doelstelling van 1,25 x. Verander de 40x-doelstelling en pas de focus aan. Kies het interessegebied met behulp van het diaoverzicht. Pas de laser parameters als volgt aan: diafragma, 7; Laser vermogen, 60; snelheid, 5; Pulsfrequentie, 201; specimen balans, 20. Optimaliseer deze parameters voor elke doelstelling.
- Als de laser het monster niet snijdt, verhoog dan de laser stroom. Als alternatief kan de laser meerdere keren worden aangebracht. Inspecteer het doel ook op vlekken van onvolledige sneden en de lijn op deze plekken opnieuw getekend met de optie verplaatsen en knippen . Sla de laser instellingen op voor de dissectie van volgende dia's.
- Selecteer osteoblasten, osteocyten en botafvoercellen in distale femorale of corticale botten op basis van morfologische criteria. Teken een lijn voor laserpad verder weg van de doelcellen om de beschadiging door de UV-laser te minimaliseren. Voer alle micro dissecties binnen minder dan 1 uur na de kleuring uit.
- Verzamel elk celtype in een aparte dop van een tube van 0,5 mL.
Opmerking: Droge opname in plaats van vloeibaar herstel kan RNA afbraak voorkomen. Bovendien kunnen zeer kleine hoeveelheden buffer die zich in de dop van de micro centrifugebuis bevinden, tijdens de LCM verdampen of kristalliseren (afhankelijk van de samenstelling). - Bevestig succes met vastleggen door observatie van de dop van de collectie buis na de LCM, indien van toepassing. Ga onmiddellijk door met de RNA-extractie.
5. RNA-extractie
- Verdeel 50 μL van de lysisbuffer die β-mercaptoethanol bevat in de dop van de opvang buis en lyseer het monster door pipetteren op en neer in de dop gedurende 1 minuut. Draai het lysaat af en voeg 300 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol toe aan de buis. Als meerdere caps worden samengevoegd, zorg er dan voor dat het totale volume van de buffer is zoals aanbevolen voor de RNA extraction Kit (tabel van de materialen).
Let op: β-mercaptoethanol moet worden toegevoegd om RNA te beschermen tegen afbraak, maar het wordt als giftig beschouwd. Draag beschermende kleding en handschoenen en werk in de motorkap. - Bovendien bereiden voor elke dia een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis met 350 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol. Gebruik de overgebleven delen na de LCM om RNA uit te pakken. Scheid de folie voorzichtig van het membraan en lyseer het monster door de lysisbuffer langzaam op de sectie te pipetteren.
Opmerking: De totale hoeveelheid lysisbuffer moet 350 μL zijn. Gebruik niet alles in één keer voor de spijsvertering als het zal vloeien uit de glijbaan. -
Leg de lysaat monsters op droogijs en bewaar ze bij-80 °c.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Ontdooi de lysaten bij RT. Transfer lysaten uit LCM-geoogste cellen van opvang buizen in de 1,5 mL micro centrifugebuizen. Als meer dan één dop werd gebruikt om het monster te oogsten, pool meerdere lysaten.
- Extract RNA volgens de instructies van de fabrikant. Behandel kolommen met DNase I om genomisch DNA te verwijderen. Elute RNA met 14 μL RNase-vrij water, resulterend in een eluaat van 12 μL. Bewaar RNA bij-80 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.
6. meting van RNA-opbrengst en-integriteit
- RNA op nat ijs ontdooien. Meet de opbrengst en de integriteit van geïsoleerd RNA met behulp van micro-capillaire elektroforese. Laad totaal RNA (1 μL per monster) in een chip (tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een LCM-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in Botcellen van muis femurs. In het geoptimaliseerde protocol werden 8 μm dikke diepgevroren botgedeelten op een zelfklevende film gesneden en gekleurd met behulp van een snel protocol voor een commerciële LCM bevroren sectie vlek. Het monster werd ingeklemd tussen het PET-membraan en de zelfklevende folie. Muis botcellen werden microdissected met behulp van een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterverzameling. Een op kolom gebaseerde RNA-extractiemethode werd gebruikt om een kwalitatief hoogwaardig RNA van voldoende opbrengst te verkrijgen. De opbrengst en integriteit van geïsoleerd RNA werd gemeten met behulp van micro-capillaire elektroforese (Figuur 1).
Het verschil in RNA-kwaliteit en kwantiteit verkregen met behulp van verschillende lysis-protocollen is te zien in de representatieve gel en elektroftalgrammen. Toen het monster gedurende 1 minuut werd gelyseerd door pipetteren op en neer in de dop, was het mogelijk om ongeveer 8,5 ng RNA te isoleren van 1 mm2 microdissected botweefsel (8 μm-dik gedeelte). De RIN-waarde was 8,60 (Figuur 2).
Als alternatief werd LCM uitgevoerd met behulp van een LCM systeem dat gebruik maakt van de gerichte laserpuls, die het materiaal katapulten in de overhangende zelfklevende dop. De kwaliteit en kwantiteit van RNA kunnen worden geschat in de representatieve gel en elektroftalgrammen. Voor verse bevroren botten was het mogelijk om ongeveer 1,6 ng RNA te isoleren van 1 mm2 microdissected botweefsel (8 μm dikke snede). De RIN-waarde was 1 (Figuur 3).
Figuur 1: stroomschema van het Laser Capture microdissection protocol voor vers-bevroren botten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve gel (boven) en electropherogrammen (onder) van RNA-monsters. LCM werd uitgevoerd met behulp van een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterafname. RNA-monsters werden opgehaald uit het LCM-geoogste weefsel (monsters 1, 3, 5, 7 en 9) en bijbehorende controle secties (respectievelijk monsters 2, 4, 6, 8 en 10). Een RNA-monster werd opgehaald uit de controlesectie die was gekleurd, maar werd niet gebruikt voor LCM (voorbeeld 11). Een totale oppervlakte van 1 mm2 werd microdissected, en verschillende lysis protocollen werden gebruikt. Er werd een monster van 1:350 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol in de buis toegevoegd. De dop werd zorgvuldig gesloten en de buis omgekeerd. LCM-geoogste cellen werden gelyseerd door grondig 1 min, incuberen bij RT gedurende 10 min en grondig 1 min. monster 3:350 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol werd toegevoegd aan de verzamelbuis, de dop werd zorgvuldig gesloten en de buis omgekeerd. LCM-geoogste cellen werden gelyseerd door het innemen van Verzamel buisjes ondersteboven gedurende 30 min bij RT. monster 5:50 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol werd toegevoegd aan de dop van de opvang buis en het monster werd gedurende 1 minuut op en neer in het dopje gelasseerd. Het lysaat werd gecentrifugeerd en 300 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol werd toegevoegd aan de buis. In de buis is een monster van 7:350 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol toegevoegd. De dop werd zorgvuldig gesloten en de buis omgekeerd. LCM-geoogste cellen werden door grondig en omkeren meerdere malen geletseerd. Monster 9:50 μL van de lysisbuffer die β-mercaptoethanol bevat, werd toegevoegd aan de dop van de opvang buis en het monster werd gelyseerd door gedurende 5 minuten bij RT in de dop te incuberen. Het lysaat werd gecentrifugeerd en 300 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol werd aan de buis toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve gel (boven) en electropherogrammen (onder) van RNA-monsters. LCM werd uitgevoerd met behulp van een LCM systeem dat gebruik maakt van de gerichte laserpuls, die het materiaal katapulten in de zelfklevende dop gepositioneerd boven de sectie. RNA-monsters werden opgehaald uit het LCM-geoogste weefsel (monsters 5 en 6) en bijbehorende controlesectie (voorbeeld 7). Een RNA-monster werd opgehaald uit de controlesectie die was gekleurd, maar werd niet gebruikt voor LCM (voorbeeld 8). Een totale oppervlakte van 0,5 mm2 of 1 mm2 werd microdissected (respectievelijk voorbeelden 5 en 6). 350 μL van de lysisbuffer met β-mercaptoethanol werd toegevoegd aan de verzamelbuis, de dop werd zorgvuldig gesloten en de buis omgekeerd. LCM-geoogste cellen werden gelyseerd door verzamel buisjes ondersteboven voor 30 min op RT. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zowel RNA-kwaliteit als kwantiteit kunnen negatief worden beïnvloed in alle stadia van de monstervoorbereiding, zoals weefsel manipulatie, LCM-proces en RNA-extractie. Daarom werd een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor latere genexpressie analyse.
Voor LCM gebruiken de meeste laboratoria secties 7 − 8 μm dik2. Dikkere secties zou toelaten om meer materiaal te oogsten. Echter, als ze te dik, dit kan de microscopische resolutie verminderen en de laser kan niet in staat zijn om door te snijden. Het is waarschijnlijk dat de optimale weefsel dikte afhangt van het LCM-systeem (en het laser-en schuif type), alsmede van het weefsel in vraag8,25. In de huidige studie werden cryosecties van verschillende diktes (4, 8 of 12 μm) getest; 8 μm-dikke secties bleken ideaal te zijn voor LCM, terwijl 12 μm-botsecties moeilijker te snijden waren met de laser en 4 μm-secties lagere hoeveelheden RNA gaven.
De endogene RNase-activiteit varieert tussen verschillende weefsels. Daarom kunnen kleurings protocollen die zijn ontwikkeld voor weefsels met een zeer lage RNase-activiteit ongeschikt zijn voor andere weefsel typen. Nucleaire Fast Red26 en Cresylacetaat Violet24 werden voorgesteld om de beste te zijn in termen van het behoud van RNA-integriteit. Bovendien waren op alcohol gebaseerde methoden superieur aan waterige vlekken voor het behoud van RNA-integriteit. Ze leed echter aan irreproduceer bare kleurings intensiteit27. Tijd is een belangrijke parameter om te overwegen. Aan de ene kant, de tijd die nodig is om te zoeken en identificeren van de cellen van belang in de sectie, en voor het uitvoeren van LCM is vaak relatief lang. Aan de andere kant is de beschikbare tijd voor LCM beperkt, aangezien in sommige gevallen 20% RNA-degradatie werd bereikt na 30 min28. Daarom werden verschillende methoden toegepast om RNA te stabiliseren, zoals blootstelling van secties aan de argon flux tijdens de micro dissectie28, of het gebruik van gebufferde op alcohol gebaseerde Cresylacetaat Violet kleuring en het houden van de vochtigheidsgraad in het laboratorium laag 27. Bovendien werd een maximum van 15 min voor de microdissection stap voorgesteld2. In deze studie, bevroren bot secties werden bevlekt met behulp van een snel protocol voor een commerciële LCM vlek, en zelfs na 1 h op RT, RIN waarden daalde van 8,3 naar 9,1. Daarom werden alle micro dissecties uitgevoerd binnen minder dan 1 uur na kleuring. Daarnaast werden verschillende protocollen voor vlekken getest (met kortere incubaties in waterige reagentia of zonder de xyleen-stap). Er is geen significante verbetering van de RIN-waarden bereikt.
In LCM-onderzoeken zijn twee verschillende soorten RNA-extractiemethoden vergeleken: een fase scheidingsmethode versus een kolom gebaseerde methode. Er werd vastgesteld dat de RNA-extractiemethode op basis van kolommen leidde tot een betere RNA-kwaliteit en een hogere opbrengst in vergelijking met de fase scheidingsmethode8. In een andere studie, een commerciële Kit die gebruik maakt van minimale spijsvertering tijd en temperatuur (5 min bij RT) resulteerde in superieure RNA-kwaliteit in vergelijking met een RNA Isolation Kit die langere spijsvertering tijd op hogere temperatuur (30 min bij 42 °C)7nodig. In de huidige studie was het mogelijk om RNA van hoge kwaliteit (RIN > 8) van voldoende concentratie uit LCM-monsters te halen met behulp van vers bevroren muis beenderen en een op kolom gebaseerde RNA-extractiemethode. Grondige Lysis (1 min Pipetteer in de dop) is essentieel voor een goede RNA-opbrengst. Het effect van de RNA-extractiemethode op het RNA-rendement en de integriteit verkregen na LCM werd onderzocht met behulp van verschillende RNA-isolatiekits volgens de instructies van de fabrikant. Echter, betere kwaliteit Rna's en verhoogde hoeveelheid werden verkregen met de Kit gebruikt in het geoptimaliseerde protocol. In het pilot-onderzoek werden microdissected weefsel gebieden van 1 mm2 Final Area gesneden, en het was mogelijk om ongeveer 8,5 ng van rna's te isoleren met behulp van 8-μm dikke botsecties (ongeveer 800 PG/μL). Meestal werden osteoblasten, osteocyten en botvoercellen in 2 − 3 secties per monster vastgelegd.
Directe vergelijkingen tussen verschillende LCM-instrumenten zijn schaars. In een studie, twee gemeenschappelijke LCM instrumenten werden getest, die verschillen in het type laser gebruikt (UV en infrarood [IR], respectievelijk) en de methode van het vangen van weefsel (zelfklevende isolatie Cap vs. caps bekleed met transparante thermoplastische film, respectievelijk). Er werd vastgesteld dat het IR-systeem, voor dun-verdeelde muizen met vriescel-hersengedeelten, resulteerde in een bescheiden hogere RNA-kwaliteit7. In de huidige studie werden twee LCM-systemen die contactvrije monsterverzameling toelaten, vergeleken. In één systeem wordt het micro-gedissected monster door de zwaartekracht in de dop geplaatst die net onder29ligt. Een ander systeem maakt gebruik van een de-gerichte laserpuls, die het materiaal katapulten in de overhangende dop30. Voor verse bevroren botten werden hogere RNA-bedragen en RIN-waarden verkregen toen de zwaartekracht werd gebruikt voor het vastleggen van weefsel. Bovendien is de katapulteren-technologie niet compatibel met de "sandwich" die bestaat uit zelfklevende folie, Cryo-sectie en Pet-membraan, vanwege het extra gewicht van het Pet-membraan.
LCM vereist fysieke toegang tot het weefseloppervlak. Daarom is montage en glas bekleding van het preparaat niet toepasbaar, met als gevolg een verminderde visualisatie van de morfologie. Om deze beperking te overwinnen, werd een vloeistof afdekmedium ontwikkeld31. Als alternatief kan 10 − 15 μL ethanol direct op de weefsel sectie worden toegevoegd, waardoor een betere morfologische analyse mogelijk is vóór de verdamping2. In de huidige studie, bevroren bot secties werden gesneden op een zelfklevende film en, voordat het monster mocht volledig drogen, het was ingeklemd tussen het huisdier membraan en de film. Deze "sandwich" methode gaf een goed morfologisch contrast en specifieke botcellen werden duidelijk geïdentificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Ute Zeitz en Nikole Ginner voor hun uitstekende technische hulp, evenals de Vetcore en dierenverzorging voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Glass microscope slides, cut color frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 μm | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
- Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185 (2017).
- Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
- Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460 (2017).
- Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
- Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
- Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427 (2016).
- Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311 (2018).
- Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854 (2013).
- Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
- Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
- Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
- Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
- Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56 (2005).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95 (2010).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
- Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
- Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).
