Summary
والهدف من البروتوكول هو قياس الخواص الميكانيكية الغشائية للحويصلات العملاقة بشكل موثوق من خلال شفط الماصة المجهرية.
Abstract
ويمكن استغلال الحويصلات العملاقة التي يتم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية والبوليمرات في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والاعتراف بالجزيئات الحيوية في التشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير مفاعلات مجهريه/نانو. في جميع هذه التطبيقات ، وتوصيف خصائص غشاء لها اهميه أساسيه. ومن بين تقنيات التوصيف الحالية ، فان طموح الماصة المجهرية ، الذي كان رائدا من قبل e. ايفانز ، يسمح بقياس الخواص الميكانيكية لغشاء مثل معامل انضغاط المنطقة ، ومعامل الانحناء ، والإجهاد تحلل والسلالة. هنا ، نقدم جميع المنهجيات والإجراءات التفصيلية للحصول علي حويصلات عملاقه من الغشاء الرقيق للدهون أو البوليمرات (أو كليهما) ، والتصنيع والمعالجة السطحية من الماصات الدقيقة ، والاجراء الطموح الذي يؤدي إلى قياس جميع المعلمات المذكورة سابقا.
Introduction
الحويصلات العملاقة التي تم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية (الدهنية) وقد استخدمت علي نطاق واسع منذ 1970s كنموذج غشاء الخلية الاساسيه1. في أواخر 1990s ، التي تم الحصول عليها من التجميع الذاتي من البوليمرات النحاسية ، اسمه بوليميرسوميس في اشاره إلى نظيره الدهون2،3، ظهرت بسرعة كبديل مثيره للاهتمام للدهنيات التي تمتلك الاستقرار الميكانيكية ضعيفه والفقراء وظائف الكيميائية وحدات. ومع ذلك ، فان الطابع الحيوي للخلية الخاصة بهم محدوده بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية لان الاخيره تتكون من الدهون الفوسفاتية ، المكون الرئيسي لغشاء الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان نفاذيه غشاء منخفضه يمكن ان يكون مشكله في بعض التطبيقات مثل تسليم المخدرات حيث الانتشار الخاضع للرقابة من الأنواع من خلال الغشاء مطلوب. في الاونه الاخيره ، كانت جمعيه الفوسفورية مع كتله البوليمرات لتصميم الهجينة البوليمر الدهون الحويصلات والاغشيه موضوعا لعدد متزايد من الدراسات4،5. الفكرة الرئيسية هي لتصميم الكيانات التي تازر الجمع بين فوائد كل مكون (الوظائف الحيوية ونفاذيه الطبقات الدهنية مع الاستقرار الميكانيكي وبراعة الكيميائية من اغشيه البوليمر) ، والتي يمكن استغلالها في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والتعرف علي الجزيئات الحيوية داخل الخلايا البيولوجية للتشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير المجهرية مستوحاه من بيو-/نانوسوتوريس.
في الأيام الحالية ، المجتمعات العلمية المختلفة (الكيمياء الحيوية ، الكيميائيين ، الصيدلة البيولوجية ، الفيزيائية الكيميائية ، علماء الاحياء) لديها اهتمام متزايد في تطوير نموذج غشاء الخلية أكثر تقدما. هنا ، هدفنا هو تقديم ، علي النحو المفصل بقدر الإمكان ، المنهجيات الموجودة (الكهرباء ، شفط الماصات الدقيقة) للحصول علي وتوصيف الخواص الميكانيكية للحويصلات العملاقة ونماذج غشاء الخلية "المتقدمة" الاخيره التي هي الهجين البوليمر الدهون العملاقة حويصلات4
والغرض من هذه الأساليب هو الحصول علي قياس موثوق بها للضغط المنطقة والانحناء بلتيير من الغشاء ، فضلا عن الإجهاد تحلل وسلاله. واحده من التقنيات الأكثر شيوعا الموجودة لقياس صلابة الانحناء من حويصلة عملاقه هو تذبذب تحليل6،7، استنادا إلى مراقبه المجهر الفيديو المباشر ؛ ولكن هذا يتطلب تذبذبا كبيرا في الغشاء المرئي ، ولا يتم الحصول عليه بشكل منتظم علي الاغشيه السميكة (مثل بوليميرسوميس). يمكن تحديد معامل الانضغاط المنطقة بالتجربة باستخدام تقنيه لانموير بلودغيت ولكن في معظم الأحيان علي أحادي الطبقة8. تسمح تقنيه شفط الماصات المجهرية بقياس كل من التحوير علي طبقه ثنائيه تشكل الحويصلة الاحاديه العملاقة (GUV) في تجربه واحده.
الطريقة التالية مناسبه لجميع الجزيئات البرمائية أو الجزيئات قادره علي تشكيل الطبقات الثنائية ، التالي ، حويصلات بالكهرباء. وهذا يتطلب طابعا سائلا من الطبقة الثنائية عند درجه حرارة الكهرباء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. افتعال ميكروبييتس
ملاحظه: هنا ، الماصات الدقيقة ذات القطر الداخلي تتراوح بين 6 إلى 12 ميكرومتر وطول تفتق حول 3-4 مم ضرورية. ويرد وصف لطريقه مفصله لتصنيع الماصات المجهرية في ما يلي.
- ضع الشعرية الزجاجية البورسيليكات في قضيب الساحب وأصلح أحد الطرفين بشد مقبض الباب.
- الشريحة بعناية الزجاج من خلال الثقوب في الجانب من غرفه سخان.
- تشديد مقبض الباب لقط في الطرف الآخر.
- السيطرة علي حجم غيض وطول تفتق لتحقيق المواصفات المطلوبة. لذلك ، وتحسين المعايير التقنية مثل درجه حرارة التدفئة ، وسحب ، والسرعة ، والتاخير والضغط. وفيما يلي مثال علي البرنامج المستخدم:
الحرارة: 550 درجه مئوية
سحب: 10 (مجموعه من الجهاز: 0-255 في وحدات التعسفي)
السرعة: 30 (المدى: 0-255 في الوحدات العشوائية)
التاخير: 1 (النطاق: 0-255 في الوحدات العشوائية)
الضغط: 500 (النطاق: 0-999 في الوحدات العشوائية) - انقر علي بولL لتنفيذ الاحداث المحددة من قبل البرنامج. ثم يتم فصل الشعرية إلى اثنين من الماصات الدقيقة ، التي يجب تعديل ابعادها باستخدام ميكروفورج.
- تضاف الماصة المجهرية إلى حامل الماصة المعدنية في الميكروفورج (انظر الشكل 1). باستخدام الهدف 10x ، اضبط مرحله المجهر ومتلاعب الماصة (الحركة العمودية والافقيه) حتى يكون طرف الماصة قريبا من سطح الخرزة الزجاجية.
- اضغط علي مفتاح القدم لأذابه حبه الزجاج. خفض غيض ووضعها في اتصال مع حبه الزجاج المنصهر. وسوف تتدفق الزجاج المنصهر في ماصه من قبل العمل الشعرية. انتظر بضع ثوان حتى يصل مستوي الزجاج المنصهر إلى ارتفاع معين كما هو مبين في ادراج الشكل 1.
- وقف التدفئة عن طريق أزاله الضغط علي التبديل القدم ، وسحب بسرعة غيض بعيدا باستخدام المتلاعب الراسي ماصه للتسبب في كسر حاد.
- كرر الخطوات 1.7 و 1.8 حتى يتم الحصول علي القطر المطلوب (6 إلى 12 ميكرومتر).
ملاحظه: لتحسين دقه قياس القطر ، خلال الخطوة الاخيره ، استخدم هدف 32x مجهز بشبكاني.
2. نصائح ماصه الطلاء مع جيش صرب البوسني (الزلال المصل البقري)
- لاعداد محلول 0.1 M من الجلوكوز التي تحتوي علي 1 ٪ wt. جيش صرب البوسنيين في المياه النقية.
- تزن 180 ملغ من مسحوق الجلوكوز ، ومكان في أنبوب مخروطي 15 مل من البولي بروبيلين وكامله مع 10 مل من الماء النقي.
- أضافه 0.1 غرام من مسحوق الجيش الصربي البوسني ويهز بلطف باستخدام خلاط أنبوب اختبار دواره حتى حل كامل (حوالي 4 ساعة).
- خذ الحل مع حقنه Luer 10 مل القابل للتصرف مزوده بابره. شغل مره واحده ، وأزاله الابره وتثبيت فلتر خلات السليلوز 0.22 μm. ملء العديد من البولي بروبيلين الصغرى--أنابيب الطرد المركزي (1.5 mL) التي سيتم استخدامها لتزج الطرف.
- ضع الشعيرات الدموية راسيا في أصحابها. اخفض الحامل واغمر الطرف في محلول الجلوكوز/جيش صرب البوسنيين بين عشيه وضحيها. وينبغي ان يرتفع الحل حوالي 1 سم عاليه عن طريق العمل الشعرية.
- قم بازاله طرف الماصة من محلول الجلوكوز/الجيش الصربي. اعداد 5 مل من محلول الجلوكوز 0.1 M (تمييع 90 ملغ من مسحوق الجلوكوز في 5 مل من الماء النقي) وتصفيه من خلال مرشح خلات السليلوز 0.22 μm.
- أملا الماصة بمحلول الجلوكوز باستخدام حقنه زجاجيه 500 μL مجهزه بالشعيرات الشعرية المرنة المنصهرة. ثم قم بازاله كل محلول الجلوكوز عن طريق امتصاصه مره أخرى وتجاهله (الشكل 2). كرر هذه الخطوة عده مرات لأزاله الجيش الصربي البوسني غير المحدود.
3. تشكيل GUVs والغبرة عن طريق الكهرباء
ملاحظه: التشكيل الكهربي هو تكنيك شائعه الاستخدام التي وضعتها Angelova9. الإجراءات للحصول علي غرفه الكهرباء ، وإيداع فيلم الدهون أو البوليمر (أو علي حد سواء ل غفس (العملاقة أحاديه الهجين الحويصلات)) وهيدرات الفيلم تحت حقل كهربائي بديل ويرد وصفها في ما يلي. ويرد أيضا وصف لإجراءات جمع البيانات التي تم الحصول عليها.
- اعداد حلول البرمائيات والسكروز والجلوكوز
- اعداد محلول البرمائيات في تركيز 1 مغ/مل. تزن 10 ملغ من امفيفايل وتذوب في 10 مل من كلوروفورم. الحفاظ علي الحل في قارورة مختومه لتجنب التبخر المذيبات.
- اعداد حل الأوراق المالية من 1 ، 2-dioleoyl-sn-غليسرو-3-فوسفونوثانولامين-N-(lissamine رونامامين ب السلفونيل) (منشطات-رود) في 1 ملغ/مل في كلوروفورم.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول الدهن الفلوري إلى المحلول البرمائي. الحفاظ علي الحلول في قوارير مختومه لتجنب التبخر المذيبات.
- اعداد السكروز وحلول الجلوكوز في تركيز 0.1 م. تزن 342 ملغ و 180 ملغ من السكروز والجلوكوز ، علي التوالي ، وحلها في 10 مل من الماء النقي.
- اعداد غرفه الكهرباء
ملاحظه: يمكن استخدام المواد الموصلة المختلفة لجعل جهاز كهربائي (علي سبيل المثال ، أسلاك البلاتين10، الابر غير القابل للصدا11). تتكون الغرفة الكهربية من منزلقين ايتو يفصل بينهما فاصل مطاطي من النوع الدائري تم قطعه علي جانب واحد لإنشاء فتحه. يتم توصيل الشرائح إلى مولد الجهد عن طريق اثنين من الأسلاك الكهربائية (الشكل 3 والشكل 4ا).- تنظيف الشرائح ايتو مع المذيبات العضوية (علي سبيل المثال ، كلوروفورم). تحديد سطح موصل باستخدام ohmmeter.
- نعلق الأسلاك الكهربائية علي الجانب موصل باستخدام شريط لاصق.
- ترسيب المحلول البرمائي
- تراجع الشعرية في الحل حتى المستوي يزيد من العمل الشعرية وجمع حوالي 5 μL من الحل.
- وضع الشعرية في اتصال مع مركز لوحه الزجاج ايتو ونشر بلطف الحل. انتظر 10 ثوان لضمان التبخر المذيب الكامل (الشكل 4ا).
- كرر هذا الاجراء 3 مرات لكل جانب.
- أضافه طبقه من الشحوم الخالية من السيليكون علي كلا الجانبين من الفاصل المفتوح أو الدائري. ضعه حول منطقه الترسيب ضع الوجه الموصل للوحه الزجاج ايتو الثانية علي قمة الفاصل.
- وضع الغرفة الكهربائية تحت فراغ لمده 3 ساعات لأزاله اي اثار من المذيبات العضوية.
- عمليه التشكيل الكهربي
- توصيل الأسلاك الكهربائية إلى المولد.
- استخدم الإعدادات التالية للمولد:
التوتر الجيب البديل
التردد: 10 هرتز
السعه: 2 Vالذروة إلى الذروة
ملاحظه: يجب العثور علي تردد الجهد الأمثل ومده لكل نظام. - تاكد من ان يتم تطبيق الجهد قبل حقن المحلول في الغرفة.
- حقن 1 مل من محلول باستخدام حقنه مع 0.8 mm الداخلية ابره القطر لملء الغرفة. أزاله فقاعات في نهاية المطاف.
- السماح للغرفة تحت الجهد التطبيقي/تردد لمده 75 دقيقه (الشكل 4ب).
- الحصاد GUVs
- أطفئ المولد
- باستخدام حقنه 1 مل مع 0.8 mm ابره القطر الداخلي ، تمتص جزء صغير من الحل من أجل إنتاج فقاعه الهواء داخل الغرفة. أماله قليلا الغرفة من أجل جعل هذه الخطوة فقاعه داخل الغرفة. هذا يستطيع ساعدت ال [غفس] ان يفصل من ال [ايتو] سطح (شكل 4[ك]).
- تمتص كل الحل ونقلها إلى أنبوب من البلاستيك 1 مل.
- أزاله الأسلاك وتنظيف الشرائح ايتو مع المذيبات العضوية (تولوين ثم كلوروفورم).
4-اعداد الجزئيات
ملاحظه: مبدا شفط الماصات المجهرية هو امتصاص حويصلة واحده من خلال الماصة الزجاجية بتطبيق الاكتئاب. يتم قياس طول اللسان داخل الماصة كداله لضغط الشفط. ان طلاء الماصة بالجيش الصربي البوسني ، الموصوف سابقا ، ضروري لمنع أو تقليل اي التصاق بين اغشيه الحويصلات والماصة.
ويرد أدناه توضيح للبروتوكول.
- توصيل الخزان بالماصة والمياه
ملاحظه: يتم إصلاح خزان مملوء بالماء والميكرومتر إلى لوحه منزلقه. يسمح العداد الرقمي براس ميكرومتر بازاحه عموديه للجهاز في نطاق من 0 إلى 2.5 سم ودقه 1 μm. الازاحه علي طول السكك الحديدية ألومنيوم البصرية من الممكن ما يصل إلى 1 متر في الطول. أنبوب السيليكون يربط الخزان وحامل الشعرية (الشكل 5ا).- أملا الخزان بالماء النقي. توصيل حقنه القابل للتصرف 5 مل إلى حامل المعدن الشعرية عن طريق أنابيب سيليكون ويستنشق لخلق تدفق المياه من الخزان إلى حامل.
- لمس أنبوب قليلا للقضاء علي فقاعات الهواء. في وقت واحد ، ورفع خزان المياه لخلق ضغط إيجابي. لا يزال يتم إرفاق حقنه 5 مل إلى حامل.
- بعد الطلاء والتنظيف الخطوات الموصوفة سابقا (انظر الخطوة 2) ، وملء الشعرية مع محلول الجلوكوز حتى اشكال قطره في نهاية المطاف. أزاله أنابيب حقنه من حامل المعدن لخلق تدفق المياه طفيف في نهايته.
- تحويل الشعرية راسا علي عقب وربط قطره الجلوكوز مع تدفق المياه من حامل. إصلاح الشعرية وحامل عن طريق الشد لهم معا.
- وضع ماصه
ملاحظه: خلال هذه العملية ، لا يزال يتم وضع خزان المياه علي السكك الحديدية ألومنيوم للحفاظ علي ضغط إيجابي.- تاخذ مرحله ألومنيوم محليه الصنع مجهزه اثنين من الشرائح الزجاجية (تنظيفها سابقا مع الايثانول) والغراء لهم الشحوم فراغ علي كل جانب. تثبيته علي مرحله المجهر وتشكيل الغضروف المفصلي بين الشريحتين باستخدام حقنه 1 مل تحتوي علي 0.1 M من الجلوكوز كما هو مبين في الشكل 5ب ، ج.
- وضع الماصة وحاملها علي وحده المحرك من الجزئي وتشديد مقبض الباب لقط.
- استخدم جويستيك لوحه التحكم في الوضع الخشن لخفض الماصة المجهرية بالقرب من الغضروف المفصلي للجلوكوز. ضبط موضع الطرف إلى مركز الغضروف المفصلي باستخدام الوضع الدقيق.
- عقد الطرف مغمورة في الجلوكوز لبضع دقائق لتنظيف سطحه الخارجي والداخلي (كما يتم الحفاظ علي الضغط الإيجابي ، فان تدفق المياه شطف السطح الداخلي للماصة لأزاله الجيش الصربي البوسني غير المصقول).
- تخزين موقف غيض علي لوحه المفاتيح الجزئي وسحبها من الغضروف المفصلي.
- أزاله الغضروف المفصلي الجلوكوز واستبداله بواحده جديده. تمتص 2 μL من GUVs في 0.1 M السكروز باستخدام ميكروماص 20 μL ووضعها في الغضروف المفصلي الجلوكوز الطازجة. مراقبه في وضع DIC (تباين التداخل التفاضلي) GUVs تقع في الجزء السفلي بسبب اختلاف الكثافة بين السكروز (أساسا داخل GUVs) والجلوكوز (أساسا خارج GUVs).
- عندما تنكمش الحويصلات قليلا ، أعد تركيب ماصه الشفط وركز علي الطرف. تعيين ارتفاع H0 من خزان المياه التي الضغط هو تقريبا 0. لذلك ، والاستفادة من الحويصلات الصغيرة أو الجزيئات التي هي موجودة بشكل طبيعي في الحل وضبط ارتفاع خزان المياه حتى يتم إيقاف حركه هذه الجزيئات.
- عند هذه النقطة ، تحيط الغضروف المفصلي مع الزيوت المعدنية لمنع تبخر المياه ، انظر الشكل 5د.
ملاحظه: يجب التحكم في درجه حرارة الغرفة بين 20-22 درجه مئوية باستخدام تكييف الهواء.
- تجربه شفط الماصة المجهرية
- اخفض طرف الماصة (6-12 ميكرومتر في القطر) واصنع شفط صغير (-1 سم) ليستنشق الحويصلة (15-30 ميكرومتر في القطر). غشاء الحويصلة المختارة يجب ان تتقلب قليلا ، ويجب ان لا يقدم اي عيوب مرئية (لا برعم أو خيوط) (الشكل 6).
- رفع الماصة إلى مستوي اعلي لعزل الحويصلة الغضروفية من الحويصلات الأخرى ، باستخدام الجزئية والحفاظ علي هذا الموقف خلال التجربة بأكملها.
- قبل الضغط علي الحويصلة عن طريق خفض خزان مملوء بالماء إلى ما يقرب من-10 سم ، ثم تقليل الضغط للعودة إلى قيمته الاوليه (-1 سم). كرر هذه الخطوة عده مرات لأزاله الاغشيه الزائدة والعيوب الصغيرة من الغشاء.
- من ارتفاع-0.5 سم المحددة من قبل موقف خزان المياه ، وخفض ببطء ضغط الشفط مع ميكرومتر للوصول إلى النظام الذي يتقلب الغشاء. ثم زيادة الضغط لتصور بوضوح اللسان في الطرف مع طول الإسقاط كبيره (بضعة ميكرون).
ملاحظه: الضغط الأدنى المطبق (P0) الذي يسمح بامتصاص أصغر طول لإسقاط الغشاء (L0) سيحدد النقطة المرجعية α0 (الشكل 7ا). سيتم قياس جميع نقاط المنحني وفقا لهذا المرجع (ΔL = L-L0 و ΔP = P-p0). - زيادة ضغط الشفط مع ميكرومتر بطريقه متدرجة حتى تصل إلى 0.5-0.8 mN/م. في كل خطوه ، والانتظار 5 ليالي وتاخذ لقطه من اللسان. هذا الاجراء في التوتر المنخفض يتيح تحديد معامل الانحناء.
- الحفاظ علي زيادة ضغط الشفط من 0.5 mN/م إلى التوتر تمزق عن طريق ضبط ارتفاع المياه تملا انزلاق علي السكك الحديدية (تتراوح بين-2--50 سم) (الشكل 7B-D). من هذه التجربة في نظام التوتر العالي ، سيتم قياس معامل الانضغاط المنطقة ، وتحلل التوتر وسلاله تحلل.
- تمتد حوالي 15-20 حويصلات للحصول علي إحصاءات هامه. تستغرق كل تجربه شفط الماصات الدقيقة ما بين 7 و 10 دقائق. اجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج LASAF لقياس طول الإسقاط من اللسان ، وقطر الحويصلات ونصف قطر الشعرية.
- قياس معامل الانحناء ، ومعامل الانضغاط المنطقة ، والتوتر تحلل وسلاله تحلل
- للوصول إلى هذه المعلمات, استخدام الشكلية التي انشاتها e. ايفانز12. احسب ضغط الشفط المطبق علي الغشاء من المعادلة 1:
Δ P = ρwg (h − h0) (1)
حيث g هو تسارع الجاذبية (9.8 م− 2) ، ρw هو كثافة المياه (ρ = 1 غرام-3) ، h هو موقف خزان المياه و h0 هو الموقف الاولي حيث الضغط يساوي الصفر.... - حساب التوتر غشاء من معادله لابلاس:
2
حيث ΔP هو ضغط الشفط علي الماصات الدقيقة ، Rp و rv هي الماصة المجهرية والحويصلة الشعاعية (خارج الماصة المجهرية) علي التوالي. يتم تعريف سلاله المساحة السطحية (α) من الغشاء علي النحو التالي:
3
يجري المنطقة غشاء من حويصلة في ضغط الشفط اقل. - احسب α من الزيادة في طول الإسقاط ΔL من حويصلة داخل الطرف الشعرية وفقا للمعادلة 412:
4 - وفي ظل نظام التوتر المنخفض جدا ، فان تجانس التموجات الحرارية يهيمن علي التوسع الظاهر. مؤامرة ln (σ) vs α. في القيم منخفضه الσ (عاده 0.001-0.5 mN. m− 113) ، وهذا يعطي خط مستقيم الذي يرتبط الميل إلى معامل الانحناء ، Kb (الفترة الاولي من المعادلة 5)14:
5
ملاحظه: تحت التوترات العالية (> 0.5 mN. m− 1) ، يتم قمع التموجات غشاء تماما وزيادة مساحة الغشاء نتيجة لزيادة التباعد بين الجزيئات. وفي هذا النظام ، تهيمن العبارة الثانية من المعادلة 5 وتتيح امكانيه الوصول إلى معامل الضغط المحلي Ka (الشكل 8 والشكل 9).
- للوصول إلى هذه المعلمات, استخدام الشكلية التي انشاتها e. ايفانز12. احسب ضغط الشفط المطبق علي الغشاء من المعادلة 1:
2
3
يجري المنطقة غشاء من حويصلة في ضغط الشفط اقل.
4
5Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع البروتوكول المذكور أعلاه ، وقد درسنا مختلفه الاصطناعية العملاقة اونياميلار الحويصلة (GUV) ، التي تم الحصول عليها من فوسفورية: 2-oleoyl-1-بالميتويل--سغليرو-3-فوسفونوكولين (popc) ، بوليمر ثلاثي الكتل: بولي (ايثيلالأكسيد)-ب-بولي (ديميثيلسيلاوكسان)-بي-بولي (ايثيليناكسيد) (بيو 12-ب-بي-بي-بي12)توليفها في الدراسة السابقة 13،وديبلوك كوبوليمر بولي (ديميثيلسيلاوكسان)-بيبولي (43 ايثيل أكسيد) (PDMS27-b-17). وقد سبق ان عرضت من قبل مجموعتنا ان رابطه triblock كوبوليمر البيو8-ب-pdms22-ب-الشركات8 مع فسفوليبيد popc يؤدي إلى انخفاض كبير في صلابة الغشاء من الناتجة الغفس (العملاقة الهجينة الحويصلات اونيلاميلار)15. وقد تم تكرار القياس لهذه الدراسة وامتدت إلى GUVs الحصول عليها من البوليمرات diblock و GHUV التي تم الحصول عليها من جمعيه هذا البوليمر diblock و POPC.
ويبين الشكل 10 والجدول 1النتائج. المنطقة انضغاطيه معامل و تحلل سلاله ل [بوب] في اتفاق كامله مع أدب16. لم يتم حتى الآن قياس الانحناء لتحوير الحويصلة الهجينة في المختبر. يتم إعطاء القيم النموذجية لبوليميرسوميس التي تم الحصول عليها. ومن الجدير بالذكر ان صلابة الغشاء (Ec) التي تم الحصول عليها من البوليمرات diblock هو ابعد من تلك التي تم الحصول عليها مع البوليمرات triblock. أكثر من المثير للاهتمام ، مع كوبوليمر diblock فمن الممكن الحصول علي العملاق الهجين الدهنية اونيلاميلار/البوليمر الحويصلات التي تقدم صلابة اعلي من الجسيمات الشحمية ، والتي هي المصلحة الرئيسية لهذه الجمعيات.
الشكل 1: ميكروفورج لتلميع نصائح الماصة. تظهر الصورة أجزاء مختلفه من الجهاز: حامل الماصة المعدنية (a) ، والزجاج الشعرية (b) ، ومنطقه سخان الجزئي (c) ، ومصدر الضوء (d) ، و 10x ، 32x ، 40x الأهداف (e) ، والمجهر أوكولارس (f). في الادراج ، لوحظ طرف ماصه ، مغمورة في حبه زجاجيه ، من خلال هدف 32x مع شبكاني. وقد تم إصلاح مستوي الزجاج المنصهر في الطرف علي ارتفاع متوسط (H) بعد التبريد. سحب الطرف بعيدا يسبب كسر حاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الاعداد التجريبي لطلاء وتعبئة الأطراف الماصة. (ا) يتم تركيب حقنه زجاجيه 500 μl مزوده بشعيرات السيليكا الشعرية المرنة لملء الماصات المجهرية بمحلول الجلوكوز. (ب) تكبير الجزء السفلي من الشعيرات الشعرية. خلال الغمر بين عشيه وضحيها ، وارتفاع مستوي الحل جيش الصرب البوسني من خلال العمل الشعرية تصل إلى 1 سم في الطول. ثم تمتلئ الماصة بالجلوكوز عن طريق إدخال الشعيرات الشعرية المرنة لأزاله البوسنية غير الممتصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مواد لبناء الجهاز الكهربائي القائم علي ايتو. ويتكون الجهاز من اثنين من الشرائح الزجاجية المغلفة علي جانب واحد مع أكسيد القصدير الانديوم (a). وقد قطع المطاط يا الدائري علي جانب واحد للسماح التحميل من الحل داخل الغرفة وحصاد التعليق GUVs (ب). يتم استخدام المطاط O-الدائري كفاصل لفصل الشرائح اثنين. يتم توصيل الشرائح إلى مولد الجهد عن طريق الأسلاك الكهربائية (c) وتعلق علي السطح عن طريق شريط لاصق (d). يستخدم الشحوم الخالية من السليكون لختم الفاصل مع الشرائح (e). يستخدم ohmmeter للتعرف علي الجانبين ايتو المغلفة والتحقق من الموصليه (f). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنشاء الكهرباء. (A) يتم إيداع المحلول البرمائي باستخدام الشعرية الزجاجية علي الجانبين ايتو المغلفة من لوحات الزجاج. (ب) بعد الجمعية وخطوه التجفيف ، يتم توصيل الغرفة إلى مولد الجهد (10 هرتز ، 2 فولت) ثم تمتلئ بمحلول السكروز. (ج) بعد التشكيل الكهربي ، يتم إنشاء فقاعه الهواء داخل الغرفة لمساعده guvs لفصل من السطح. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اعداد شفط الماصة المجهرية. (ا) وصف المكونات: المجهر الفلوري (1) ، خزان المياه المملوءة والميكرومتر الانزلاق علي السكك الحديدية البصرية ألومنيوم (2) ، أنابيب السيليكون اجراء تدفق المياه من الخزان إلى ميكروماص (3) ، لوحه التحكم الجزئي (4) ، وحده المحرك من المعالجة الدقيقة التي تسمح X ، Y و Z النزوح (ب) التكبير تظهر مرحله ألومنيوم محليه الصنع مجهزه اثنين من الشرائح الزجاجية (7) ، ماصه (8) وحامل ماصه (9) التي شنت علي وحده المحرك من الجزئي والثابتة من قبل مقبض الباب لقط (10). لاحظ ان طرف الماصة مغمور في مركز الغضروف المفصلي للجلوكوز. (ج) شرائح زجاجيه ملتصقة بشحوم الفراغ علي كل جانب مما يسمح بتشكيل الغضروف المفصلي للجلوكوز (منظر جانبي). (د) الجلوكوز الغضروف المفصلي محاطه بالزيوت المعدنية لمنع تبخر المياه (المنظر العلوي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صوره لل GUV تحت التوتر باستخدام شفط الماصة المجهرية. تم دمج القناة الحمراء التي تجمع الفلورية من الروراامين الموسومة بالدهن وقناه الإرسال (DIC). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صور GUV في ضغط شفط مختلف. (ا) يستخدم ادني التوتر المطبق الذي يحفز تشكيل اللسان كمرجع لتحديد طول اللسان الاولي (L0) ونصف قطر الحويصلة (Rv). (ب) متوسط قيمه التوتر المطبق مع طول اللسان المرتبط به (L). (ج) التوتر الشديد التطبيق. (د) الصورة مباشره بعد تمزق الغشاء حيث يقاس نصف قطر الماصة (Rp). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مؤامرة تمثيليه لإجهاد الضغط الذي يحصل عليه الشفط بالماصة المجهرية. تم استخدام نفس مجموعه البيانات لرسم ln (σ) = f (α) و σ = f (α). في نظام التوتر المنخفض, ln (σ) يختلف خطيا مع α (الأخضر تناسب الخطي) ويعطي الوصول إلى معامل الانحناء (Kc); في حين انه في نظام التوتر العالي ، σ يختلف خطيا مع α (الأحمر تناسب الخطي) ويعطي الوصول إلى معامل الانضغاط المنطقة (Ka). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مؤامرة الإجهاد التمثيلي لل GUV التي تم الحصول عليها بواسطة شفط الماصات الدقيقة في نظام التمدد. من المنحني تجريبية عده معلمات ميكانيكيه من ال [غفس] يستطيع كنت حددت. معامل الانضغاط المنطقة (Ka) يتوافق مع المنحدر الاولي ويقاس بتركيب خطي المنحني. النقطة الاخيره المقاسه تعطي سلاله تحلل (αl) والإجهاد تحلل (σl) القيم. وأخيرا ، يمكن تقدير طاقة الكثافة المتماسكة (Ec) من خلال دمج المنطقة تحت المنحني (منطقه البرتقال). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: المؤامرات ممثل الإجهاد الضغط التي تم الحصول عليها ليبوسوم ، بوليميرسومي والهجين البوليمر/الدهون الحويصلة. GUVs تتالف من POPC (المثلثات الحمراء) ، والبوليمرات الثلاثية (الدوائر الخضراء) ، ديبلوك كوبوليمر (المربعات الزرقاء) ، والهجين القائم علي triblock (الدوائر الخضراء الخفيفة) والهجين القائم علي diblock (المربعات الأزرق الفاتح). وتم الحصول علي المنحنيات بمتوسط القياسات علي ما لا يقل عن 15 GUVs لكل نظام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| كا | αL | σL | هاءجيم | كيلو بايت | |
| (مليون م-1) | (%) | (مليون م-1) | (مليون م-1) | KT | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0.17 ± 0.09 | 21.1 ± 0.4 |
| PDMS27-بي-بيو17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1.37 ± 0.67 | 10.6 ± 3.5 |
| PDMS27-بي-بيو17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0.50 ± 0.38 | - |
| + 5 wt .% POPC | |||||
| 43-b-pdms12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0.50 ± 0.38 | - |
| 43-b-pdms12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0.03 ± 0.01 | - |
| + 5 wt .% POPC |
الجدول 1: تحدد المعلمات الميكانيكية باستخدام تقنيات شفط الماصات الدقيقة علي GUVs المكونة من فسفوليبيد أو البوليمرات المجهرية أو كليهما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ان طلاء الماصات المجهرية هو أحد النقاط الرئيسية للحصول علي قياسات موثوقه. يجب منع التصاق الحويصلة بالماصة ، ويشيع استخدام الطلاء في الأدب17،18،19،20،21، مع جيش صرب الجمهورية ، β-الكازين أو surfasil. ونادرا ما تذكر تفاصيل اجراء الطلاء.
وينبغي القيام بحل الجيش الصربي البوسني لمده 4 ساعات علي الأقل تحت الهياج من أجل تحقيق الاذابه الجيدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجه إلى خطوه الترشيح لأزاله اي المجاميع التي قد تعيق طرف الماصة المجهرية. إذا لم يتم حل الجيش الصربي البوسني بشكل جيد ، سيتم أزاله معظمها عن طريق الترشيح ، وسوف طلاء تكون غير فعاله. التركيز المثالي ووقت الانحلال علي التوالي 0.8-1 wt .% و 4 h.
نقطه حرجه أخرى هي لضمان الضغط الاسموزي المستمر داخل وخارج حويصلة اثناء القياس. زيادة تركيز الجلوكوز بسبب تبخر المياه خلال التجربة يمكن ان يؤدي إلى انكماش في الحويصلة والانزعاج القياس (التقليل من التقدير Ka، الخ). ان ترسب طبقه زيتية إلزامي لمنع هذه الظاهرة (الشكل 3د). للتحقق من كفاءه طبقه النفط ، والضغط المستمر الطموح لعدد قليل من mN-m-1 يمكن تطبيقها علي حويصلة لمده 5 دقائق ، وطول L من اللسان داخل الشعرية يجب ان تكون ثابته.
النقطة الحرجة الاخيره هي خطوه ما قبل الإجهاد (القسم 3.3) ، ونادرا ما يذكر في الأدب20. هذه الخطوة ضرورية لأزاله البراعم والأنابيب ومساحة السطح الزائدة من الحويصلة والحصول علي نتائج قابله للتكرار من حويصلة إلى أخرى.
يمكن تطبيق طريقه شفط الماصات الدقيقة علي جميع السوائل ، طالما انها تقدم غشاء سائل (علي سبيل المثال ، Tالكهربائية > tm من الدهون) وتمتلك معامل الانحناء أدناه 100 kT. في حاله وجود غشاء سميك ولزج ، حتى في حاله السائل ، يمكن استخدام اثنين من الماصات لقياس22بلتيير. تقنيه شفط الماصات الدقيقة تقدم ميزه كبيره لإعطاء الوصول إلى العديد من المعلمات (الانحناء ومنطقه الضغط moduli) وهذه هي التقنية الوحيدة المتاحة للوصول مباشره إلى معامل الانضغاط المنطقة من غشاء GUV.
وعلي الرغم من ان هذه التقنية معروفه جيدا لفتره طويلة فانها لا تزال شائعه الاستخدام من قبل العديد من المجتمعات العلمية (الصيدلة الحيوية ، الكيمياء الفيزيائية ، الكيميائيين ، الخ). ستظل طريقه شفط الماصات المجهرية تقنيه هامه في المستقبل ، ولا سيما للتحري عن الخواص الغشائية الاضافيه للخلايا التركيبية المتقدمة (مثل حويصلات البوليمر/الدهون الهجينة والبروتوسيلس).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للمخابرات الخاصة بالدعم المالي (ANR Sysa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
