Summary
Målet med protokollen er å pålitelig måle membran mekaniske egenskaper gigantiske blemmer ved micropipette aspirasjon.
Abstract
Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider og kopolymerer kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnostisering, funksjonelle membraner for kunstige celler, og utvikling av bioinspired mikro/nano-reaktorer. I alle disse programmene, karakterisering av deres membran egenskaper er av fundamental betydning. Blant eksisterende karakterisering teknikker, micropipette aspirasjon, utviklet av E. Evans, tillater måling av mekaniske egenskaper av membranen som areal Komprimerbar modul, bøying modul og lyse stress og belastning. Her presenterer vi alle metoder og detaljerte prosedyrer for å få gigantiske blemmer fra tynn film av en lipid eller kopolymer (eller begge), produksjon og overflatebehandling av Mikropipetter, og aspirasjon prosedyre som fører til måling av alle parametrene tidligere nevnt.
Introduction
Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider (liposomer) har vært mye brukt siden 1970-tallet som den grunnleggende celle membran modell1. På slutten av 1990-tallet, flytande morfologier innhentet fra selv-montering av kopolymerer, oppkalt polymersomes i referanse til sine lipid analogs2,3, raskt dukket opp som et interessant alternativ til liposomer som har svak mekanisk stabilitet og dårlig modulær kjemisk funksjonalitet. Imidlertid er deres celle BioMimetic karakter ganske begrenset i forhold til liposomer siden sistnevnte er sammensatt av fosfolipider, den viktigste komponenten i cellemembranen. Videre kan deres lave membran permeabilitet være et problem i enkelte programmer som legemiddellevering der kontrollert diffusjon av arter gjennom membranen er nødvendig. Nylig har foreningen av fosfolipider med blokk kopolymerer til design hybrid polymer-lipid blemmer og membraner vært gjenstand for et økende antall studier4,5. Den viktigste ideen er å designe enheter som synergi kombinere fordelene med hver komponent (bio-funksjonalitet og permeabilitet av lipid bilayers med mekanisk stabilitet og kjemisk allsidighet av polymer membraner), som kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnose, funksjonelle membraner for kunstige celler, utvikling av bio-inspirerte mikro-/nano-Reactors.
I dag har ulike vitenskapelige miljøer (Biokjemikere, kjemikere, biophysicists, fysikalsk-kjemikere, biologer) økende interesse for utvikling av en mer avansert celle membran modell. Her er vårt mål å presentere, så detaljert som mulig, eksisterende metoder (electroformation, micropipette aspirasjon) for å få og karakterisere de mekaniske egenskapene til gigantiske blemmer og de siste "avanserte" celle membran modeller som er hybrid polymer lipid gigantiske blemmer4,5.
Hensikten med disse metodene er å oppnå pålitelig måling av området Komprimerbar og bøying moduli av membranen, samt deres lyse Rings stress og belastning. En av de vanligste teknikkene som eksisterer for å måle bøying stivhet av en gigantisk vesicle er svingninger analyse6,7, basert på direkte video mikroskop observasjon; men dette krever store synlige membran svingninger, og er ikke systematisk innhentet på tykke membraner (f. eks polymersomes). Areal Komprimerbar modul kan være eksperimentelt bestemmes ved hjelp av Langmuir Blodgett teknikk, men oftest på en monolag8. Den micropipette aspirasjon teknikken gjør at måling av både moduli på en bilayer forming gigantiske unilamellære vesicle (GUV) i ett eksperiment.
Følgende metode er hensiktsmessig for alle amfifile molekyler eller makromolekyler stand til å danne bilayers og følgelig blemmer av electroformation. Dette krever en væske karakter av bilayer ved temperaturen på electroformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikere Mikropipetter
Merk: her Mikropipetter med en indre diameter som spenner fra 6 til 12 μm og en taper lengde rundt 3-4 mm er nødvendig. En detaljert metode for produksjon micropipette er beskrevet i følgende.
- Plasser den Borosilikatglass glass-kapillær i draget av avtrekker og fest en av endene ved å stramme knotten.
- Skyv forsiktig glasset gjennom hullene på siden av ovnen kammeret.
- Stram spenn knotten i den andre enden.
- Kontroll størrelsen på spissen og taper lengde for å oppnå de ønskede spesifikasjoner. For det, optimalisere tekniske parametre som oppvarming temperatur, pull, hastighet, forsinkelse og trykk. Her er et eksempel på et program som brukes:
Heat: 550 ° c
Pull: 10 (rekkevidde av maskinen: 0-255 i vilkårlig enheter)
Hastighet: 30 (område: 0-255 i vilkårlig enheter)
Forsinkelse: 1 (område: 0-255 i vilkårlige enheter)
Trykk: 500 (område: 0-999 i vilkårlig enheter) - Klikk på L for å utføre hendelsene som er definert av programmet. Kapillær blir deretter delt inn i to Mikropipetter, hvis dimensjoner må justeres ved hjelp av en microforge.
- Sett micropipette inn i metall pipette holde ren til microforge (se figur 1). Ved å bruke 10x objektiv, justere mikroskopet scenen og pipette manipulator (vertikal og horisontal bevegelse) til pipette spissen er nær glasset perle overflaten.
- Trykk på fotbryteren for å smelte glass perlen. Senk spissen og legg den i kontakt med smeltet glass perle. Flytende glass vil strømme inn i pipette ved kapillær handling. Vent noen sekunder til nivået på smeltet glass når en viss høyde som vist i innsatsen på figur 1.
- Stopp oppvarmingen ved å fjerne trykket på fotbryteren, og dra spissen raskt bort ved hjelp av den vertikale pipette-manipulator for å forårsake en skarp pause.
- Gjenta trinn 1,7 og 1,8 til ønsket diameter er oppnådd (6 til 12 μm).
Merk: for å forbedre nøyaktigheten til diameter målingen, bruk et 32x-objektiv som er utstyrt med en reticle i løpet av det siste trinnet.
2. coating pipette tips med BSA (storfe serum albumin)
- For å forberede en 0,1 M oppløsning av glukose inneholdende 1% WT. BSA i rent vann.
- Veie 180 mg glukose pulver, plasseres i et 15 mL polypropylen konisk rør og komplett med 10 mL rent vann.
- Tilsett 0,1 g av BSA-pulver og rist forsiktig ved hjelp av et reagens rotatory blandebatteri til fullstendig oppløsning (ca. 4 t).
- Ta løsningen med en 10 mL disponibel luer sprøyte utstyrt med en nål. Når fylt, fjerne nålen og installere en 0,22 μm acetate cellulose filter. Fyll flere polypropylen mikro-sentrifuger rør (1,5 mL) som skal brukes til å senke spissen.
- Plasser blodkar loddrett i holdere. Senk holderen og senk tuppen inn i glukose/BSA-løsningen over natten. Løsningen skal stige ca 1 cm høy ved kapillær handling.
- Fjern pipette spissen fra glukose/BSA oppløsning. Forbered 5 mL 0,1 M glukoseoppløsning (fortynne 90 mg glukose pulver i 5 mL rent vann) og filter gjennom en 0,22 μm acetate cellulose filter.
- Fyll pipette med glukoseoppløsning ved hjelp av en 500 μL glass sprøyte utstyrt med en fleksibel smeltet silica kapillær. Deretter fjerner du all glukoseoppløsning ved å suge den tilbake og forkaste den (figur 2). Gjenta dette trinnet flere ganger for å fjerne den ubegrensede BSA.
3. dannelse av GUVs og GHUVs ved electroformation
Merk: Electroformation er en vanlig brukt Technic utviklet av Angelova9. Prosedyrene for å få en electroformation kammer, sette inn en lipid eller polymer film (eller begge for GHUVs (Giant hybrid Unilamellære blemmer)) og hydrat filmen under et alternativ elektrisk felt er beskrevet i følgende. Prosedyren for å samle GUV innhentet er også beskrevet.
- Tilberedning av amfifil, sukrose og glukose løsninger
- Klargjør en amfifil løsning med en konsentrasjon på 1 mg/mL. Veie 10 mg amfifil og oppløses i 10 mL kloroform. Oppbevar oppløsningen i forseglede hetteglass for å unngå at væsken fordamper.
- Forbered en lagerløsning av 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Lissamine rhodamine B sulfonyl) (dope-Rhod) ved 1 mg/ml i kloroform.
- Tilsett 10 μL av fluorescerende lipid løsning på den amfifil løsningen. Oppbevar løsningene i forseglede hetteglass for å unngå at væsken fordamper.
- Forbered sukrose og glukose løsninger ved en konsentrasjon av 0,1 M. veie 342 mg og 180 mg sukrose og glukose, henholdsvis, og oppløse dem i 10 mL rent vann.
- Utarbeidelse av electroformation kammeret
Merk: ulike ledende materialer kan brukes til å lage en electroformation enhet (f. eks, platina ledninger10, rustfritt nåler11). Electroformation kammeret består av to ITO-lysbilder adskilt av en O-ring gummi spacer som har blitt kuttet på den ene siden for å skape en blenderåpning. Lysbildene er koblet til en spennings generator via to elektriske ledninger (Figur 3 og Figur 4a).- Rengjør ITO-lysbildene med organisk løsemiddel (f.eks. kloroform). Identifiser den ledende overflaten ved hjelp av en ohmmeter.
- Fest de elektriske ledningene på den ledende siden ved hjelp av tape.
- Amfifil løsning deponering
- Dypp en kapillær i oppløsningen til nivået øker ved kapillær virkning og samle ca 5 μL av løsningen.
- Sett kapillær i kontakt med midten av ITO glassplate og forsiktig spre løsningen. Vent i 10 sekunder for å sikre fullstendig løsemiddel fordampning (Figur 4A).
- Gjenta denne prosedyren 3 ganger for hver side.
- Tilsett et lag av silisium fritt fett på begge sider av den åpnede O-ring spacer. Sett det rundt området deponering. Plasser den ledende fronten på den andre glassplaten ITO på toppen av avstandsstykket.
- Plasser electroformation kammer under vakuum i 3 timer for å fjerne eventuelle spor av organisk løsemiddel.
- Electroformation prosedyre
- Koble de elektriske ledningene til generatoren.
- Bruk følgende innstillinger for generatoren:
Alternativ sinusformet penning
Frekvens: 10 Hz
Amplitude: 2 Vtopp-til-topp
Merk: optimal spennings frekvens og varighet må finnes for hvert system. - Sørg for at spenningen påføres før injeksjon av oppløsningen i kammeret.
- Injiser 1 mL oppløsning ved hjelp av en sprøyte med 0,8 mm indre diameter nål for å fylle kammeret. Fjern eventuelle bobler.
- La kammeret under anvendt spenning/frekvens for 75 min (Figur 4B).
- GUVs innhøsting
- Slå av generatoren.
- Bruk 1 mL sprøyte med 0,8 mm indre diameter nål, sug en liten del av løsningen for å produsere en luftboble inne i kammeret. Litt vippe kammeret for å gjøre denne boblen flytte inne i kammeret. Dette kan hjelpe GUVs til å løsne fra ITO-overflaten (Figur 4C).
- Sug alle løsningen og overfør den til en 1 mL plastrør.
- Fjern ledningene og rengjør ITO-lysbildene med organiske løsemidler (toluen deretter kloroform).
4. mikromanipulering satt opp
Merk: prinsippet om micropipette aspirasjon er å suge en enkelt vesicle gjennom et glass micropipette ved å bruke en depresjon. Lengden på tungen inne i pipette måles som en funksjon av sugetrykket. Pipette belegget med BSA, beskrevet tidligere, er viktig for å forebygge eller minimere eventuell vedheft mellom blemmer membraner og pipette.
Protokollen er illustrert nedenfor.
- Pipette og vann fylt reservoar tilkobling
Merk: vann fylte tanken og mikrometer er festet til en glidende plate. En digital teller med et mikrometer hode gir en vertikal forskyvning av enheten i et område på 0 til 2,5 cm og en nøyaktighet på 1 μm. forskyvning langs en aluminiumsskinne er mulig opp til 1 meter i lengde. En silisium slange forbinder reservoaret og kapillær holde ren (figur 5A).- Fyll tanken med rent vann. Koble en engangssprøyten på 5 mL til kapillær metall holde ren via silikon slange og aspirer for å skape en vannstrømning fra tanken til holderen.
- Berør røret litt for å eliminere luftbobler. Samtidig heve vanntanken å skape et positivt trykk. Sprøyten på 5 mL er fortsatt festet til holderen.
- Etter belegg og rengjørings trinn som er beskrevet tidligere (se trinn 2), Fyll en kapillær med glukose løsning til en dråpe former på slutten. Fjern sprøyte slangen fra metall holde ren for å skape en liten vannføring i enden.
- Snu kapillær opp ned og koble glukose dråpe med vannstrømmen fra holderen. Fest kapillær og holderen ved å skru dem sammen.
- Plassere en pipette
Merk: under denne operasjonen er vannbeholderen fortsatt plassert på aluminiums skinnen for å opprettholde et positivt trykk.- Ta den hjemmelagde aluminiums scenen utstyrt med to glass lysbilder (tidligere rengjort med etanol) og lim dem med vakuum fett på hver side. Monter det på mikroskopet og danner en menisk mellom de to lysbildene ved å bruke en 1 mL sprøyte inneholdende 0,1 M av glukose som vist i figur 5B, C.
- Plasser pipette og holderen på micromanipulator motor enhet, og stram til spenn knotten.
- Bruk styrespaken for kontrollpanelet i grov modus for å senke micropipette nær glukose menisk. Juster posisjonen til spissen til midten av menisk ved hjelp av fin modus.
- Hold spissen nedsenket i glukose i noen minutter for å rengjøre den ytre og indre overflate (som et positivt trykk opprettholdes, vil vannstrømmen skylle den indre overflaten av pipette for å fjerne ubehandlede BSA).
- Lagre posisjonen til spissen på det micromanipulator tastaturet, og trekk den ut av menisk.
- Fjern glukose menisk og erstatte den med en ny en. Sug 2 μL av GUVs i 0,1 M sukrose ved å bruke en 20 μL micropipette og legg den i fersk glukose menisk. Observere i DIC modus (differensial forstyrrelser kontrast) GUVs plassert på bunnen på grunn av forskjellen i tetthet mellom sukrose (hovedsakelig inne i GUVs) og glukose (hovedsakelig utenfor GUVs).
- Når blemmer er litt deflatert, sette inn suge pipette og fokus på spissen. Still inn høyden H0 av vanntanken som trykket er nesten 0. For det, dra nytte av små blemmer eller partikler som er naturlig tilstede i løsningen og justere vanntanken høyden til bevegelsen av disse partiklene er stoppet.
- På dette punktet, omgi menisk med mineralolje for å hindre vann fordampning, se figur 5D.
Merk: romtemperaturen skal styres mellom 20-22 ° c ved bruk av klimaanlegg.
- Micropipette aspirasjon eksperiment
- Senk pipette spissen (6-12 μm i diameter) og lag en liten suging (-1 cm) for å aspirer en vesicle (15-30 μm i diameter). Membranen til den valgte vesicle skal svinge litt, og må ikke presentere noen synlige defekter (ingen knopp eller filament) (figur 6).
- Hev pipette til et høyere nivå for å isolere pustende vesicle fra de andre blemmer, ved hjelp av micromanipulator og holde denne posisjonen under hele eksperimentet.
- Pre-stress vesicle ved å senke vann fylte tanken til ca-10 cm, og deretter redusere trykket for å gå tilbake til sin opprinnelige verdi (-1 cm). Gjenta dette trinnet flere ganger for å fjerne membran overflødig og små defekter fra membranen.
- Fra en høyde på-0,5 cm definert av plasseringen av vanntanken, sakte redusere sugetrykket med mikrometer å nå et regime der membranen svinger. Deretter øker trykket for å tydelig visualisere en tunge i spissen med en betydelig projeksjon lengde (noen få mikron).
Merk: det laveste brukte trykket (P0) som gjør det mulig å suge opp den minste membran projeksjons lengden (L0) vil definere referansepunktet α0 (figur 7A). Alle punkter av kurven vil bli målt i henhold til denne referansen (ΔL = L-L0 og ΔP = P-p0). - Øk sugetrykket med mikrometer på en trinnvis måte til du når 0,5-0,8 mN/m. På hvert trinn, vent 5 s og ta et øyeblikksbilde av tungen. Denne prosedyren ved lav spenning gjør det mulig å bestemme bøye modulen.
- Fortsett å øke sugetrykket fra 0,5 mN/m til brudd spenningen ved å justere høyden på vann fylte skli på skinnen (som spenner fra-2 til-50 cm) (figur 7B-D). Fra dette eksperimentet i høyspennings regime, vil området Komprimerbar modul, lyse spenninger og lyse stamme måles.
- Strekk rundt 15-20 blemmer å tilegne seg betydelig statistikk. Hvert micropipette aspirasjon eksperiment tar mellom 7 og 10 minutter. Utfør bildeanalyse ved hjelp av LASAF programvare for å måle projeksjons lengden av tungen, diameteren av blemmer og radius av kapillær.
- Måle bøying modul, areal Komprimerbar modul, lyse spenninger og lyse stamme
- For å få tilgang til disse parametrene, bruk formalisme som er fastsatt av E. Evans12. Beregn sugetrykket som påføres over membranen fra ligningen 1:
Δ P = ρwg (h − H0) (1)
der g er tyngdekraften akselerasjon (9,8 m ∙ s− 2), ρw er tettheten av vannet (ρ = 1 g ∙ cm− 3), h er posisjonen til vanntanken og h0 er utgangsposisjonen der trykket er lik null. - Beregn membran spenningen fra Laplace ligning:
2
der ΔP er sugetrykket på micropipette, Rp og rv er micropipette og vesicle radier (utenfor micropipette) hhv. Belastningen på overflatearealet (α) på membranen er definert som:
3
som membran området på vesicle ved det nedre sugetrykket. - Beregn α fra økningen i projeksjons lengde ΔL av vesicle inne i kapillær spissen i henhold til ligning 412:
4 - Under en svært lav spenning regime, utjevning av termisk bøying undulations dominerer den åpenbare ekspansjon. Plot ln (σ) vs α. Ved lave σ verdier (typisk 0.001 – 0,5 mN. m− 113), gir dette en rett linje der skråningen er knyttet til bøye modulen, Kb (første termin av ligningen 5)14:
5
Merk: under høye spenninger (> 0,5 mN. m− 1), membran undulations er helt undertrykt og membran området øker som følge av økt avstand mellom molekyler. I dette regimet, den andre perioden av ligningen 5 dominerer og gi tilgang til området Komprimerbar modul Ka (Figur 8 og figur 9).
- For å få tilgang til disse parametrene, bruk formalisme som er fastsatt av E. Evans12. Beregn sugetrykket som påføres over membranen fra ligningen 1:
2
3
som membran området på vesicle ved det nedre sugetrykket.
4
5Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med protokollen nevnt, har vi studert ulike syntetiske gigantiske unilamellære vesicle (GUV), Hentet fra en fosfolipid: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-PHOSPHOCHOLINE (POPC), en triblock kopolymer: Poly (ethyleneoxide)-b-Poly (dimethylsiloxane)-b-Poly (ethyleneoxide) (folk12-b-PDMS43-b-folk12) syntetisert i en tidligere studie13, og en diblokk kopolymer Poly (dimethylsiloxane)-b-Poly ( ethyleneoxide) (PDMS27-b-folk17). Det har tidligere blitt vist av vår gruppe at foreningen av triblock kopolymer folk8-b-PDMS22-b-folk8 med fosfolipid POPC fører til en stor nedgang på membran seighet av den resulterende GHUVs (Giant hybrid unilamellære blemmer)15. Målingen har blitt gjentatt for denne studien og utvidet til GUVs innhentet fra diblokk kopolymer og GHUV innhentet fra foreningen av denne diblokk kopolymer og POPC.
Resultatene er illustrert i Figur 10 og tabell 1. Området Komprimerbar modul og lyse stamme for POPC er i perfekt enighet med litteratur16. Målingen av bøying moduli av hybrid vesicle er ennå ikke utført i laboratoriet. Typiske verdier er gitt for polymersomes innhentet. Det er verdt å nevne at seighet av membran (Ec) innhentet fra diblokk kopolymerer er langt utover de som er innhentet med triblock kopolymer. Mer interessant, med diblokk kopolymer er det mulig å få gigantiske hybrid unilamellære lipid/polymer blemmer som presenterer høyere seighet enn liposomer, som er den viktigste interessen for en slik forening.
Figur 1: Microforge for polering av propper. Bildet viser de ulike delene av enheten: metall pipette holderen (a), glasset kapillær (b), micromanipulator varmeren sone (c), lyskilden (d), den 10x, 32x, 40x mål (e), og mikroskopet okulars (f). I innsatsen, er pipette spissen, nedsenket i en glass perle, observert gjennom en 32x mål med reticle. Nivået av smeltet glass inn i spissen er festet til en mellomliggende høyde (H) etter avkjøling. Trekke spissen bort fører til en skarp pause. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksperimentell satt opp for belegg og fylling pipette tips. (A) en 500 μL glass sprøyte utstyrt med en fleksibel silica kapillær er montert for å fylle micropipette med en glukoseoppløsning. (B) forstørrelse av kapillær nedre delen. I løpet av natten nedsenking stiger BSA løsnings nivået med kapillær virkning opp til 1 cm i lengde. Pipetter fylles deretter med glukose ved å sette inn en fleksibel kapillær for å fjerne unadsorbed BSA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: materialer for å bygge en Ito-basert electroformation enhet. Enheten består av to glass lysbilder belagt på den ene siden med Indium tinn oksid (a). En gummi O-ring har blitt kuttet på den ene siden for å tillate lasting av løsningen inne i kammeret og høste av GUVs suspensjon (b). O-ringen i gummi brukes som et mellomrom for å skille de to lysbildene. Lysbildene er koblet til spennings generatoren via elektriske ledninger (c) og festet til overflaten ved selvklebende tape (d). Silisium fri fett brukes til å forsegle avstandsstykket med lysbildene (e). Ohmmeter brukes til å identifisere ITO belagte sider og kontrollere ledningsevne (f). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Electroformation satt opp. (A) amfifil-løsningen avsettes ved hjelp av en glass KAPILLÆR på Ito-belagte sider av glass platene. (B) etter montering og tørking trinn, er kammeret koblet til spennings generatoren (10 Hz, 2 V) og deretter fylt med sukrose løsning. (C) etter electroformation, en luftboble er opprettet inne i kammeret for å hjelpe GUVs å løsne fra overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Micropipette aspirasjon satt opp. (A) komponenter beskrivelse: fluorescens mikroskop (1), vann fylte tank og mikrometer skyve på en aluminium optisk rail (2), silikon slange gjennomføre vann strøm fra reservoaret til micropipette (3), micromanipulator kontrollpanelet (4), motor enhet av micromanipulator som tillater X, Y og Z forskyvning (5), vibrasjons isolasjon tabellen (6). (B) forstørrelse som viser hjemmelaget aluminiums fase utstyrt med to glass sklier (7), pipette (8) og pipette holder (9) montert på motorenheten til micromanipulator og fast ved å stramme knotten (10). Legg merke til at pipette spissen er nedsenket i sentrum av glukose menisk. (C) glass lysbilder limt med vakuum fett på hver side slik at dannelsen av glukose menisk (sidevisning). (D) glukose menisk omgitt av mineralolje for å hindre vann fordampning (Top View). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: bilde av en guv under spenning ved hjelp av micropipette aspirasjon. Den røde kanalen samle fluorescens fra rhodamine merket lipid og overføring kanal (DIC) har blitt fusjonert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: bilder av en guv ved forskjellige sugetrykk. (A) lavest anvendt spenning som induserer en tunge formasjon brukes som referanse for å bestemme den opprinnelige tungen lengde (L0) og vesicle radius (Rv). (B) mellomliggende anvendt spenningsverdi med tilhørende tungen lengde (L). (C) svært høy anvendt spenning. (D) bildet like etter at membranen sprekker der pipette radius måles (Rp). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: representative stress-stamme tomten av GUVs innhentet av micropipette aspirasjon. Det samme datasettet har blitt brukt til å plotte ln (σ) = f (α) og σ = f (α). I lavspennings regime, ln (σ) varierer lineært med α (grønn lineær passform) og gir tilgang til bøye modul (Kc); mens i det høye spennings regimet, σ varierer lineært med α (rød lineær passform) og gir tilgang til området Komprimerbar modul (Ka). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: representative stress-stamme tomten av guv innhentet av micropipette aspirasjon i stretching regime. Fra den eksperimentelle kurven flere mekaniske parametre av GUVs kan bestemmes. Området Komprimerbar modul (Ka) tilsvarer den innledende skråningen og måles ved montering lineært kurven. Det siste målte punktet viser lyse Rings belastningen (αl) og lyse Rings verdiene (σL). Endelig kan den sammenhengende tetthets energien (Ec) anslås ved å integrere området under kurven (oransje område). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: representative stress-stamme tomter innhentet for liposome, Polymersome og hybrid polymer/lipid vesicle. GUVs sammensatt av POPC (røde trekanter), triblock kopolymer (grønne sirkler), diblokk kopolymer (blå firkanter), triblock-baserte hybrid (lys grønne sirkler) og diblokk-baserte hybrid (lyseblå firkanter). Kurvene ble oppnådd ved snitt målingene på minst 15 GUVs for hvert system. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ka | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN. m-1) | (%) | (mN. m-1) | (mN. m-1) | KT | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0,17 ± 0,09 | 21.1 ± 0.4 |
| PDMS27-b-folk17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1,37 ± 0,67 | 10,6 ± 3,5 |
| PDMS27-b-folk17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0,50 ± 0,38 | - |
| + 5 WT .% POPC | |||||
| FOLK12-b-PDMS43-b-folk12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0,50 ± 0,38 | - |
| FOLK12-b-PDMS43-b-folk12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0,03 ± 0,01 | - |
| + 5 WT .% POPC |
Tabell 1: Mekaniske parametre bestemmes ved hjelp av micropipette aspirasjon teknikker på GUVs sammensatt av fosfolipid, kopolymerer eller begge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belegget på micropipette er en av hovedpunktene for å oppnå pålitelige målinger. Vedheft av vesicle til micropipette må forebygges, og et belegg er vanligvis brukt i litteraturen17,18,19,20,21, med BSA, β-kasein eller surfasil. Detaljer om belegget prosedyren er sjelden nevnt.
Oppløsningen av BSA skal utføres i minst 4 timer under omrøring for å oppnå god oppløseliggjøringen. Likevel er Filtreringstrinnet fortsatt nødvendig for å fjerne eventuelle aggregater som kan hindre micropipette spissen. Hvis BSA ikke er godt oppløst, vil det meste bli fjernet ved filtrering, og belegget vil være ineffektiv. Den ideelle konsentrasjon og oppløsning tid er henholdsvis 0,8-1 WT .% og 4 t.
Et annet kritisk punkt er å sikre et konstant osmotisk trykk i og utenfor vesicle under målingen. En økning av glukose konsentrasjonen på grunn av vann fordampning under eksperimentet kan føre til deflasjon av vesicle og forurolige målingen (undervurdering av Ka, osv.). Deponering av et olje lag er obligatorisk for å hindre dette fenomenet (Figur 3D). For å sjekke effektiviteten av olje laget, en konstant aspirasjon press av få mN ∙ m-1 kan påføres på en vesicle i 5 min, og lengden L av tungen inne i kapillær bør være konstant.
Det siste kritiske punktet er det pre-stress trinn (§ 3,3), sjelden nevnt i litteraturen20. Dette trinnet er nødvendig for å fjerne knopper, rørene og overflødig overflateareal av vesicle og få reproduserbar resultater fra en vesicle til en annen.
Den micropipette aspirasjon metoden kan påføres på alle GUVs, så lenge de presenterer en væske membran (f. eks Telectroformation > Tm av lipider) og har en bøying modul under 100 kT. I tilfelle av en tykk og viskøs membran, selv i væske tilstand, kan to Pipetter brukes til å måle moduli22. Den micropipette aspirasjon teknikken presenterer en stor fordel å gi tilgang til flere parametre (bøying og areal Komprimerbar moduli) og dette er den eneste teknikken tilgjengelig for direkte tilgang til området Komprimerbar modul av en GUV membran.
Selv om denne teknikken har vært kjent i lang tid er det fortsatt ofte brukt av mange vitenskapelige miljøer (biophysicists, fysikalsk-kjemikere, kjemikere, etc.). Den micropipette aspirasjon metoden vil fortsette å være en betydelig teknikk i fremtiden, spesielt for å undersøke ytterligere membran egenskaper av avansert syntetisk celle (f. eks hybrid polymer/lipid blemmer og protocells).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takknemlig erkjenner ANR for økonomisk støtte (ANR sysa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
