Summary
Målet med protokollet är att på ett tillförlitligt sätt mäta membran mekaniska egenskaper hos gigantiska vesikler genom micropipett aspiration.
Abstract
Jätte blåsor som erhålls från fosfolipider och sampolymerer kan utnyttjas i olika tillämpningar: kontrollerad och målinriktad läkemedelsleverans, Biomolekylär erkännande inom biosensorer för diagnostik, funktionella membran för konstgjorda celler och utveckling av bioinspirerade mikro-/nanoreaktorer. I alla dessa tillämpningar är karaktäriseringen av deras membran egenskaper av fundamental betydelse. Bland befintliga karakterisering tekniker, micropipett aspiration, pionjärer genom E. Evans, gör det möjligt att mäta mekaniska egenskaper av membranet såsom område sammanpressbarhet Modulus, böjning Modulus och lysis stress och stam. Här presenterar vi alla metoder och detaljerade förfaranden för att få jätte blåsor från den tunna filmen av en lipid eller sampolymer (eller båda), tillverkning och ytbehandling av Mikropipetter, och aspiration förfarande som leder till mätning av alla parametrar som tidigare nämnts.
Introduction
Jätte blåsor som erhållits från fosfolipider (liposomer) har använts flitigt sedan 1970-talet som den grundläggande cellmembranet Model1. I slutet av 1990-talet, vesikulär morfologier som erhållits från själv-församlingen av sampolymerer, namngivna polymersomes i förhållande till deras lipidanaloger2,3, visade sig snabbt som ett intressant alternativ till liposomer som besitter svag mekanisk stabilitet och dålig modulär kemisk funktionalitet. Men, deras cell biomimetiska tecken är ganska begränsad jämfört med liposomer eftersom de senare består av fosfolipider, den viktigaste komponenten i cellmembranet. Dessutom kan deras låga membran permeabilitet vara ett problem i vissa tillämpningar som läkemedelsleverans där kontrollerad diffusion av arter genom membranet krävs. Nyligen har föreningen för fosfolipider med block sampolymerer för att designa hybrid polymer-lipid blåsor och membran varit föremål för ett ökande antal studier4,5. Huvudtanken är att designa enheter som synergistiskt kombinerar fördelarna med varje komponent (Bio-funktionalitet och permeabilitet av lipidbilayers med mekanisk stabilitet och kemisk mångsidighet av polymermembran), som kan utnyttjas i olika tillämpningar: kontrollerad och målinriktad läkemedelsleverans, Biomolekylär igenkänning inom biosensorer för diagnostik, funktionella membran för konstgjorda celler, utveckling av bio-inspirerade mikro-/nanoreaktors.
Nuförtiden har olika vetenskapliga samfund (biokemister, kemister, biofysiker, fysiologer, biologer) ökat intresset för utveckling av en mer avancerad cellmembran modell. Här, vårt mål är att presentera, så detaljerat som möjligt, befintliga metoder (elektroformation, micropipett aspiration) för att få och karakterisera de mekaniska egenskaperna hos jätte blåsor och den senaste "avancerade" cellmembran modeller som är hybrid polymer lipid jätte blåsor4,5.
Syftet med dessa metoder är att få tillförlitlig mätning av områdets kompressibilitet och böjning moduli av membranet samt deras Lys stress och påfrestningar. En av de vanligaste teknikerna som finns för att mäta böjstyvhet hos en gigantisk vesikel är fluktuationsanalys6,7, baserad på direkt video Mikroskop observation; men detta kräver stora synliga membran fluktuation, och inte systematiskt erhålls på tjocka membran (t. ex. polymersomer). Area kompressibility Modulus kan experimentellt bestämmas med hjälp av Langmuir Blodgett teknik men oftast på en enskiktslager8. Den micropipett aspiration teknik möjliggör mätning av både moduli på ett lipidens bildar Giant små vesikler (GUV) i ett experiment.
Följande metod är lämplig för alla amfifila molekyler eller makromolekyler som kan bilda lipidmonolager och därmed blåsor genom elektrobildning. Detta kräver en flytande karaktär av lipidens vid temperaturen på elektroformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricera Mikropipetter
Anmärkning: här behövs Mikropipetter med en innerdiameter på mellan 6 och 12 μm och en Kona längd runt 3-4 mm. En detaljerad metod för tillverkning av mikropipett beskrivs i följande.
- Placera borosilicatglaset kapillär i dragstången av avdragare och fäst en av ändarna genom att dra åt ratten.
- Skjut försiktigt glaset genom hålen vid sidan av värme kammaren.
- Dra åt spännreglaget i den andra änden.
- Kontrollera storleken på spetsen och taper längd för att uppnå de önskade specifikationerna. För att optimera tekniska parametrar såsom värme temperatur, pull, hastighet, fördröjning och tryck. Här är ett exempel på ett program som används:
Värme: 550 ° c
Pull: 10 (maskinens räckvidd: 0-255 i godtyckliga enheter)
Hastighet: 30 (intervall: 0-255 i godtyckliga enheter)
Fördröjning: 1 (intervall: 0-255 i godtyckliga enheter)
Tryck: 500 (intervall: 0-999 i godtyckliga enheter) - Klicka på PULL för att utföra de händelser som definierats av programmet. Kapillär separeras sedan i två Mikropipetter, vars dimensioner måste justeras med hjälp av en microforge.
- Sätt in mikropipetten i metallpipetthållaren på microforge (se figur 1). Med hjälp av 10X mål justerar du mikroskopet och pipettmanipulatorn (vertikal och horisontell rörelse) tills pipettspetsen ligger nära glas pärlytan.
- Tryck på fotreglaget för att smälta glas pärmen. Sänk spetsen och Lägg den i kontakt med smält glaspärla. Smält glas kommer att flöda in i pipetten genom kapillärverkan. Vänta några sekunder tills nivån på smält glaset når en viss höjd som visas i skäret på figur 1.
- Stoppa uppvärmningen genom att ta bort trycket på fotpedalen, och snabbt dra spetsen bort med hjälp av den vertikala pipettmanipulatorn att orsaka en skarp paus.
- Upprepa steg 1,7 och 1,8 tills önskad diameter erhålls (6 till 12 μm).
Anmärkning: för att förbättra noggrannheten i diametermätningen, under det sista steget, Använd en 32X objektiv utrustad med en hårkors.
2. beläggning pipettspetsar med BSA (bovint serumalbumin)
- För att bereda en 0,1 M glukoslösning som innehåller 1% WT. BSA i rent vatten.
- Väg 180 mg glukos pulver, placera i en 15 mL konisk tub av polypropen och fyll på med 10 mL rent vatten.
- Tillsätt 0,1 g BSA-pulver och skaka försiktigt med ett provrör med rotatorisk blandare tills fullständig upplösning (cirka 4 h).
- Ta lösningen med en 10 mL engångsluerspruta försedd med en nål. När den är fylld, ta bort nålen och installera ett 0,22 μm acetat cellulosa filter. Fyll flera polypropylenmikrocentrifugrör (1,5 mL) som ska användas för att doppa spetsen.
- Placera kapillärerna vertikalt i hållarna. Sänk ned hållaren och sänk ned spetsen i glukos/BSA-lösningen över natten. Lösningen bör stiga ca 1 cm hög genom kapillärverkan.
- Ta bort pipettspetsen från glukos/BSA-lösningen. Förbered 5 mL 0,1 M glukoslösning (späd 90 mg glukos pulver i 5 mL rent vatten) och filtrera genom ett 0,22 μm acetat cellulosa filter.
- Fyll pipetten med glukos lösningen med hjälp av en 500 μL glasspruta utrustad med en flexibel smält kiseldioxid kapillär. Ta sedan bort all glukoslösning genom att suga tillbaka den och kassera den (figur 2). Upprepa det här steget flera gånger för att ta bort den obegränsade BSA.
3. bildandet av GUVs och GHUVs genom elektroformation
Obs: Elektroformation är en vanligt förekommande Technic utvecklad av Angelova9. Förfarandena för att få en elektroformation kammare, deponera en lipid eller polymer film (eller både för GHUVs (Giant hybrid unilamellar blåsor)) och hydrat filmen under ett alternativt elektriskt fält beskrivs i följande. Förfarandet för att samla in den erhållna GUV beskrivs också.
- Beredning av amphiphile, sackaros och glukoslösningar
- Bered en amfifilt-lösning med en koncentration på 1 mg/ml. Väg 10 mg amfifilt och lös i 10 ml kloroform. Förvara lösningen i förseglade flaskor för att undvika avdunstning av lösningsmedel.
- Bered en stamlösning på 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rodamin B Sulfonyl) (Dope-Rhod) vid 1 mg/ml i kloroform.
- Tillsätt 10 μl fluorescerande lipidlösning till amfifilt-lösningen. Förvara lösningarna i förseglade flaskor för att undvika avdunstning av lösningsmedel.
- Bered sackaros och glukoslösningar vid en koncentration av 0,1 M. väg 342 mg och 180 mg sackaros och glukos, respektive, och lös upp dem i 10 mL rent vatten.
- Beredning av elektrobildande kammare
Obs: olika ledande material kan användas för att göra en elektroformation enhet (t. ex., platina trådar10, rostfria nålar11). Elektroformation kammaren består av två ITO diabilder åtskilda av en O-ring gummi spacer som har styckats på ena sidan för att skapa en bländare. Bilderna är anslutna till en spännings Generator via två elektriska ledningar (figur 3 och figur 4a).- Rengör ITO-glidningen med organiskt lösningsmedel (t. ex. kloroform). Identifiera den ledande ytan med en ohmmeter.
- Fäst de elektriska kablarna på den ledande sidan med tejp.
- Deposition för amphiphile-lösning
- Doppa en kapillär i lösningen tills nivån ökar genom kapillärverkan och samla in ca 5 μL av lösningen.
- Sätt kapillär i kontakt med centrum av ITO glasplattan och försiktigt sprida lösningen. Vänta i 10 sekunder för att säkerställa fullständig lösningsmedels avdunstning (figur 4A).
- Upprepa proceduren 3 gånger för varje sida.
- Lägg ett lager Silikonfritt fett på båda sidor av den öppnade O-ringen spacer. Lägg den runt deponerings området. Placera den ledande sidan av den andra ITO glasplattan på toppen av distansen.
- Placera elektrobildande kammaren under vakuum i 3 timmar för att avlägsna eventuella spår av organiskt lösningsmedel.
- Elektrobildande förfarande
- Anslut de elektriska kablarna till generatorn.
- Använd följande inställningar för generatorn:
Alternativ sinusformad spänning
Frekvens: 10 Hz
Amplitud: 2 Vtopp-till-topp
Obs: optimal spänningsfrekvens och varaktighet måste hittas för varje system. - Säkerställ att spänningen appliceras före injektion av lösningen i kammaren.
- Injicera 1 mL lösning med en spruta med 0,8 mm innerdiameter nål för att fylla kammaren. Ta bort eventuella bubblor.
- Låt kammaren under den tillämpade spänningen/frekvensen för 75 min (figur 4B).
- GUVs skörd
- Stäng av generatorn.
- Använd 1 mL spruta med 0,8 mm innerdiameter nål, suga en liten del av lösningen för att producera en luftbubbla inuti kammaren. Luta kammaren något för att göra denna bubbla röra sig inne i kammaren. Detta kan hjälpa GUVs att lossa från ITO-ytan (figur 4C).
- Suga alla lösningen och överföra den till en 1 mL plaströr.
- Ta bort kablarna och rengör ITO slides med organiska lösningsmedel (toluen sedan kloroform).
4. mikromanipulation inrättas
Obs: principen om micropipett aspiration är att suga en enda vesikel genom en glasmikropipett genom att tillämpa en depression. Längden på tungan inuti pipetten mäts som en funktion av sugtrycket. Pipettbeläggningen med BSA, som beskrivits ovan, är nödvändig för att förhindra eller minimera vidhäftning mellan vesikler membran och pipetten.
Protokollet illustreras nedan.
- Pipett och vattenfyllda reservoaranslutning
Obs: den vattenfyllda behållaren och Mikrometern är fastsatta på en glidplatta. En digital räknare med ett mikrometerhuvud möjliggör en vertikal förskjutning av enheten i en räckvidd på 0 till 2,5 cm och en noggrannhet på 1 μm. förskjutning längs en aluminium optisk skena är möjligt upp till 1 meter i längd. En kisel slang förbinder reservoaren och kapillärhållaren (figur 5A).- Fyll tanken med rent vatten. Anslut en engångsspruta på 5 mL till kapillärmetallhållaren via silikonslangar och aspirera för att skapa ett vattenflöde från tanken till hållaren.
- Vidrör röret något för att eliminera luftbubblor. Samtidigt, Höj vattentanken för att skapa ett positivt tryck. 5 mL-sprutan är fortfarande ansluten till hållaren.
- Efter beläggning och rengöring steg som beskrivs tidigare (se steg 2), fylla en kapillär med glukoslösning tills en droppe former i slutet. Ta bort sprutslangen från metallhållaren för att skapa ett lätt vattenflöde vid dess.
- Vänd kapillär upp och ner och Anslut glukos droppe med vattenflödet från hållaren. Fixera kapillärområdet och hållaren genom att skruva ihop dem.
- Placera en pipett
Obs: under denna operation, vattentanken är fortfarande placerad på aluminiumskena för att bibehålla ett positivt tryck.- Ta den hemgjorda aluminium scenen utrustad med två glas diabilder (tidigare rengjorda med etanol) och limma dem med vakuum fett på varje sida. Installera det på mikroskopet scenen och bilda en menisken mellan de två bilderna med hjälp av en 1 mL spruta som innehåller 0,1 M glukos som visas i figur 5B, C.
- Placera pipetten och dess hållare på mikromanipulatorns motor enhet och dra åt ned spännreglaget.
- Använd kontrollpanelens joystick i grovläge för att sänka mikropipetten nära glukos menisken. Justera positionen för spetsen till mitten av menisken med hjälp av Fine-läget.
- Håll spetsen nedsänkt i glukos i några minuter för att rengöra dess yttre och inre yta (som ett positivt tryck bibehålls, vattenflödet kommer att skölja den inre ytan av pipetten för att avlägsna obestruket BSA).
- Förvara positionen för spetsen på micromanipulator tangentbordet och dra tillbaka den från menisken.
- Ta bort glukos menisken och ersätt den med en ny. Sug 2 μL av GUVs i 0,1 M sackaros med hjälp av en 20 μL mikropipett och Lägg den i den färska glukomenisken. Observera i DIC-läge (differential interferens kontrast) GUVs ligger på botten på grund av skillnaden mellan densitet mellan sackaros (främst inom GUVs) och glukos (främst utanför GUVs).
- När vesiklarna är något deflated, sätt in sugpipetten och fokusera på spetsen. Ställ in höjden H0 på vattenbehållaren för vilken trycket är nästan 0. För att dra nytta av små blåsor eller partiklar som är naturligt närvarande i lösningen och justera vattentanken höjd tills rörelsen av dessa partiklar stoppas.
- Vid denna punkt, omger menisken med mineralolja för att förhindra vatten avdunstning, se figur 5D.
Obs: rumstemperaturen bör styras mellan 20-22 ° c med hjälp av luftkonditionering.
- Experiment med micropipett aspiration
- Sänk pipettspetsen (6-12 μm i diameter) och skapa en liten sug (-1 cm) för att aspirera en vesikel (15-30 μm i diameter). Membranet i den valda vesikeln bör fluktuera något och får inte uppvisa några synliga defekter (ingen knopp eller glödtråden) (figur 6).
- Höj pipetten till en högre nivå för att isolera den aspirerande vesikeln från de andra vesiklarna, genom att använda mikromanipulatorn och Behåll denna position under hela experimentet.
- Pre-stress vesikeln genom att sänka den vattenfyllda tanken till cirka-10 cm, sedan minska trycket att återvända till sitt ursprungliga värde (-1 cm). Upprepa detta steg flera gånger för att ta bort membran överskott och små defekter från membranet.
- Från en höjd av-0,5 cm definieras av placeringen av vattentanken, sakta minska sugtrycket med mikrometer att nå en regim där membranet fluktuerar. Sedan öka trycket att tydligt visualisera en tunga i spetsen med en betydande projektion längd (några mikrometer).
Anmärkning: det lägsta tillämpade trycket (P0) som gör det möjligt att suga upp den minsta membranprojektionslängden (L0) definierar referenspunkten α0 (figur 7A). Alla punkter i kurvan kommer att mätas enligt denna referens (ΔL = L-L0 och Δp = P-P0). - Öka sugtrycket med Mikrometern på ett stegvis sätt tills den når 0,5-0,8 mN/m. Vid varje steg, vänta 5 s och ta en ögonblicksbild av tungan. Denna procedur vid låg spänning möjliggör bestämning av bocknings Modulus.
- Fortsätt att öka sugtrycket från 0,5 mN/m till bristningen spänningen genom att justera höjden på den vattenfyllda glidande på skenan (mellan-2 till-50 cm) (figur 7B-D). Från detta experiment på högspännings regim, området sammanpressbarhet Modulus, Lys spänning och lysis stam kommer att mätas.
- Sträck omkring 15-20 blåsor för att få betydande statistik. Varje micropipett aspiration experiment tar mellan 7 och 10 minuter. Utför bildanalys med hjälp av LASAF programvara för att mäta projektionen längd av tungan, diametern på vesikler och radien av kapillär.
- Mätning av bocknings Modulus, Area kompressibilitetsmodulus, Lys spänning och Lys stam
- För att komma åt dessa parametrar, Använd den formalism som upprättats av E. Evans12. Beräkna det sug tryck som appliceras över membranet från ekvation 1:
Δ P = vv (h − H0) (1)
där g är gravitations accelerationen (9,8 m ∙ s− 2), är dv densiteten av vattnet (v = 1 g ∙ cm− 3), h är positionen för vattenbehållaren och h0 är utgångspositionen där trycket är lika med noll. - Beräkna membran spänningen från Laplace ekvation:
2
där ΔP är sugtrycket på mikropipetten är Rp och rv mikropipett och vesikelradier (utanför mikropipetten). Ytstammen (α) i membranet definieras som:
3
är membran området av vesikeln på det lägre sugtrycket. - Beräkna α från ökningen av projektionslängden ΔL av vesikeln inuti kapillärspetsen enligt ekvation 412:
4 - Under en mycket låg spänning regim, utjämning av termisk böjning vågor dominerar den skenbara expansionen. Täppa ln (σ) vs α. Vid låg-σ-värden (typiskt 0,001 – 0,5 mN. m− 113) ger detta en rät linje vars lutning är kopplad till bocknings Modulus, Kb (första termen i ekvationen 5)14:
5
Obs: under höga spänningar (> 0,5 mN. m− 1), membran vågor är helt undertryckta och membran området ökar som ett resultat av ökat avstånd mellan molekyler. I denna regim, den andra termen i ekvation 5 dominerar och ge tillgång till området sammanpressbarhet Modulus Ka (figur 8 och figur 9).
- För att komma åt dessa parametrar, Använd den formalism som upprättats av E. Evans12. Beräkna det sug tryck som appliceras över membranet från ekvation 1:
2
3
är membran området av vesikeln på det lägre sugtrycket.
4
5Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med protokollet ovan har vi studerat olika syntetiska jätte små vesikel (GUV), som erhållits från en fosfolipid: 2-oleoyl-1-palmitoyl-SN-glycero-3-fosfokolin (POPC), en triblocksampolymer: poly (etylenoxid)-b-poly (dimetylsiloxan)-b-poly (etyleneoxid) (PEO12-b-PDMS43-b-Peo12) syntetiseras i en tidigare studie13, och en diblock sampolymer poly (dimetylsiloxan)-b-poly ( etylenoxid) (PDMS27-b-Peo17). Det har tidigare visats av vår grupp att föreningen för triblock sampolymer PEO8-b-PDMS22-b-Peo8 med fosfolipid POPC leder till en enorm minskning av membran seghet av den resulterande ghuvs (Giant hybrid unilamellar blåsor)15. Mätningen har upprepats för denna studie och utvidgas till GUVs erhålls från diblock sampolymer och GHUV erhålls från föreningen av denna diblock sampolymer och POPC.
Resultaten illustreras i figur 10 och tabell 1. Området sammanpressbarhet Modulus och lysen anstränger för POPC är i perfekt överenskommelse med litteratur16. Mätningen av hybrid vesikelets bockningmoduli har ännu inte utförts i laboratoriet. Typiska värden ges för de polymersomer som erhålls. Det är värt att nämna att segheten av membran (Ec) som erhålls från diblocksampolymerer är långt utöver de som erhålls med triblocksampolymer. Mer intressant, med diblock sampolymer är det möjligt att få gigantiska hybrid små lipid/polymer blåsor som uppvisar högre seghet än liposomer, vilket är det huvudsakliga intresset för en sådan Association.
Figur 1: Microforge för polering av pipettspetsar. Bilden visar de olika delarna av anordningen:metallpipettinnehavaren (a), glaset kapillär (b), den micromanipulator värmare zon (c), ljuskällan (d), den 10X, 32X, 40x mål (e), och mikroskopet patienten (f). I insatsen, pipettspetsen, nedsänkt i en glaspärla, observeras genom en 32X mål med riktmedel. Nivån på det smälta glaset i spetsen har fixats på en mellanliggande höjd (H) efter kylning. Att dra spetsen bort orsakar en skarp paus. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: experimentell uppsättning för beläggning och fyllning av pipettspetsar. (A) en 500 μl glasspruta utrustad med en flexibel kiseldioxid kapillär monteras för att fylla micropipett med en glukoslösning. (B) förstoring av den kapillära nedre delen. Vid nedsänkning över natten stiger BSA-lösningsnivån genom kapillärverkan upp till 1 cm i längd. Pipetten fylls sedan med glukos genom att sätta in ett flexibelt kapillär för att avlägsna oadsorberad BSA. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: material för att bygga en Ito-baserad elektroformation enhet. Enheten består av två glas diabilder belagda på ena sidan med indium tennoxid (a). En gummi O-ring har skurits på ena sidan för att möjliggöra lastning av lösning inne i kammaren och skörd av GUVs suspensionen (b). Gummit O-ringen används som en spacer för att separera de två bilderna. Bilderna ansluts till spännings generatorn via elektriska ledningar (c) och fästs på ytan med tejp (d). Silikonfritt fett används för att täta distansen med diabilderna (e). Ohmmeter används för att identifiera ITO belagda sidor och kontrollera konduktivitet (f). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: ställa in Elektroformation. Aden amfifilt lösningen deponeras med hjälp av ett glas kapillär på Ito belagda sidor av glasplattorna. (B) efter monteringen och tork steget ansluts kammaren till spännings generatorn (10 Hz, 2 V) och fylls sedan med sackaroslösning. (C) efter elektrobildningen skapas en luftbubbla inuti kammaren för att hjälpa guvs att lossna från ytan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: aspiration av mikropipett. A) komponenter Beskrivning: fluorescens-Mikroskop (1), vattenfylld tank och mikrometer glidande på en aluminium optisk skena (2), Silikonrör dirigering av vattenflödet från reservoaren till mikropipett (3), micromanipulator kontrollpanel (4), motor enhet av micromanipulator som tillåter X, Y och Z förskjutning (5), vibrations isolerings tabell (6). (B) förstoring som visar den hemmagjorda aluminium scenen utrustad med två glas rutschbanor (7), pipetten (8) och pipetthållaren (9) monterad på mikromanipulatorns motor enhet och fixeras med spännknopp (10). Observera att pipettspetsen är nedsänkt i mitten av glukos menisken. Cglasfiber som limmas med vakuum fett på varje sida, vilket möjliggör bildandet av glukos menisken (sidovy). D) glukos menisken omgiven av mineralolja för att förhindra vatten avdunstning (uppifrån). vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: bild av en GUV under spänning med hjälp av micropipett aspiration. Den röda kanalen som samlar in fluorescensen från rodamin Tagged lipid och transmissions kanalen (DIC) har slagits samman. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: bilder av en GUV vid olika sug tryck. (A) den lägsta tillämpade spänningen som inducerar en tung bildning används som referens för att bestämma den initiala tungan längden (L0) och Vesikelradien (Rv). B) intermediärt tillämpat spänningsvärde med tillhörande tunglängd (L). (C) mycket hög tillämpad spänning. (D) bild strax efter membranrupturen där pipettradien mäts (Rp). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: representativ stress-stam-Plot av GUVs erhålls genom micropipett aspiration. Samma datauppsättning har använts för att rita ln (σ) = f (α) och σ = f (α). I systemet med låg spänning varierar ln (σ) linjärt med α (grön linjär passform) och ger tillgång till bocknings modulus (Kc). i högspänningssystemet varierar σ linjärt med α (röd linjär passform) och ger tillgång till områdets Kompressibilitetsmodulus (Ka). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: representativ stress-Strain Plot av GUV erhålls genom micropipett aspiration i stretching regimen. Från experimentellt buktar flera mekaniska parametrar av GUVs kan bestämmas. Arean Kompressibilitetsmodulus (Ka) motsvarar den initiala lutningen och mäts genom montering linjärt kurvan. Den senast uppmätta punkten ger Lyststammen (αl) och lystreden (σl). Slutligen kan den sammanhållande densiteten energi (Ec) uppskattas genom att integrera området under kurvan (orange Area). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: representativa spännings-och stamområden som erhållits för Liposom, Polymersome och hybrid polymer/lipidvesikel. GUVs består av POPC (röda trianglar), triblock sampolymer (gröna cirklar), diblock sampolymer (Blå rutor), triblock-baserade hybrid (ljusgröna cirklar) och diblock-baserade hybrid (ljusblå kvadrater). Kurvorna erhölls genom att medelvärdet av mätningarna på minst 15 GUVs för varje system. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ka | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN. m-1) | (%) | (mN. m-1) | (mN. m-1) | KT | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0,17 ± 0,09 | 21,1 ± 0,4 |
| PDMS27-b-Peo17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1,37 ± 0,67 | 10,6 ± 3,5 |
| PDMS27-b-Peo17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0,50 ± 0,38 | - |
| + 5 WT .% POPC | |||||
| PEO12-b-PDMS43-b-Peo12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0,50 ± 0,38 | - |
| PEO12-b-PDMS43-b-Peo12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0,03 ± 0,01 | - |
| + 5 WT .% POPC |
Tabell 1: Mekaniska parametrar som bestäms med användning av mikropipett aspiration tekniker på GUVs består av fosfolipid, sampolymerer eller båda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beläggningen på mikropipetten är en av de viktigaste punkterna för att få pålitliga mätningar. Vesikelens vidhäftning till mikropipetten måste förhindras och en beläggning används vanligen i litteraturen17,18,19,20,21, med BSA, β-Casein eller surfasil. Specificerar av beläggning tillvägagångssättet nämns sällan.
Upplösning av BSA ska utföras under minst 4 timmar under omrörning för att uppnå god solubilisering. Ändå är filtrerings steget fortfarande krävs för att ta bort alla aggregat som kan hindra micropipett spetsen. Om BSA inte är väl upplöst, kommer de flesta av det tas bort genom filtrering, och beläggning kommer att vara ineffektiva. Den idealiska koncentrations-och Upplösningstiden är 0,8-1 WT .% och 4 h.
En annan kritisk punkt är att försäkra ett konstant osmotiskt tryck inuti och utanför vesikeln under mätningen. En ökning av glukos koncentrationen på grund av vatten avdunstning under experimentet kan leda till deflation av vesikeln och stör mätningen (underskattning av Ka, etc.). Avsättning av ett olje skikt är obligatoriskt för att förhindra detta fenomen (figur 3D). För att kontrollera effektiviteten i olje lagret, en konstant aspiration tryck av några mN ∙ m-1 kan appliceras på en vesikel för 5 min, och längden L av tungan inuti kapillär bör vara konstant.
Den sista kritiska punkten är före stress steg (avsnitt 3,3), sällan nämns i litteratur20. Detta steg är nödvändigt att ta bort knoppar, rören och överskottet ytan av vesikeln och få reproducerbara resultat från en vesikel till en annan.
Den micropipett aspiration metod kan appliceras på alla GUVs, så länge de uppvisar ett vätske membran (t. ex. Telektroformation > tm av lipider) och besitter en bockning Modulus under 100 kT. I händelse av ett tjockt och trögflytande membran, även i vätske läget, kan två pipetter användas för att mäta moduli22. Den micropipett aspiration teknik ger en stor fördel att ge tillgång till flera parametrar (böjning och område sammanpressbarhet moduli) och detta är den enda tekniken som är tillgänglig för direkttillgång till området sammanpressbarhet Modulus av en GUV membran.
Även om denna teknik har varit välkänd under lång tid är det fortfarande ofta används av många vetenskapliga samfund (biofysiker, physico-kemister, kemister, etc.). Den micropipett aspiration metoden kommer att fortsätta att vara en viktig teknik i framtiden, särskilt för att undersöka ytterligare membran egenskaper av avancerad syntetisk cell (t. ex. Hybrid polymer/lipidblåsor och protoceller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt ANR för finansiellt stöd (ANR sysA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
