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Chemistry

माइक्रोपिपेट आकांक्षा द्वारा विद्युतरूपऔर उनके यांत्रिक गुणों के मापन द्वारा विशालकाय अनीमेलार हाइब्रिड वेसिकल्स का अनुमान

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60199
Automatic Translation
1, 1, 1
1Université de Bordeaux, CNRS, Bordeaux INP, LCPO, UMR 5629

Summary

प्रोटोकॉल का लक्ष्य माइक्रोपाइप्ट आकांक्षा द्वारा विशाल वेसिकल्स के झिल्ली यांत्रिक गुणों को मज़बूती से मापना है।

Abstract

फॉस्फोलिपिड और कोपॉलिमर से प्राप्त विशालकाय वेसिकल्स का विभिन्न अनुप्रयोगों में दोहन किया जा सकता है: नियंत्रित और लक्षित दवा वितरण, निदान के लिए बायोसेंसर के भीतर जैव आणविक मान्यता, कृत्रिम कोशिकाओं के लिए कार्यात्मक झिल्ली, और जैव प्रेरित सूक्ष्म/नैनो रिएक्टरों का विकास । इन सभी अनुप्रयोगों में, उनके झिल्ली गुणों का लक्षण वर्णन मौलिक महत्व का है। मौजूदा लक्षण वर्णन तकनीकों में, ई इवांस द्वारा बीड़ा उठाया माइक्रोपाइपेट आकांक्षा, झिल्ली के यांत्रिक गुणों जैसे क्षेत्र संपीड़न मोडलस, झुकने मोडलस और लिसिस तनाव और तनाव की माप की अनुमति देता है। यहां, हम लिपिड या कोपॉलिमर (या दोनों), माइक्रोपाइपेट के विनिर्माण और सतह उपचार, और आकांक्षा प्रक्रिया की पतली फिल्म से विशाल वेसिकल प्राप्त करने के लिए सभी तरीकों और विस्तृत प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करते हैं जो पहले उल्लिखित सभी मापदंडों की माप के लिए अग्रणी है।

Introduction

फॉस्फोलिपिड्स (लिपोसोम्स) से प्राप्त विशाल वेसिकल्स का 1 9 70 के दशक से बुनियादी कोशिका झिल्ली मॉडल1के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। 1 99 0 के दशक के उत्तरार्ध में, कोपॉलिमर की स्व-असेंबली से प्राप्त वेसिकुलर मॉर्फोलोज, उनके लिपिड एनालॉग2,3के संदर्भ में पॉलीमेसोम ्स नाम दिया गया, तेजी से लिपोसोम के लिए एक दिलचस्प विकल्प के रूप में दिखाई दिया जो कमजोर यांत्रिक स्थिरता और खराब मॉड्यूलर रासायनिक कार्यक्षमता के अधिकारी हैं। हालांकि, उनका सेल बायोमिमेटिक चरित्र लिपोसोम की तुलना में सीमित है क्योंकि बाद में फॉस्फोलिपिड से बना है, जो कोशिका झिल्ली का मुख्य घटक है। इसके अलावा, उनकी कम झिल्ली परगम्यता दवा वितरण जैसे कुछ अनुप्रयोगों में एक मुद्दा हो सकता है जहां झिल्ली के माध्यम से प्रजातियों के नियंत्रित प्रसार की आवश्यकता होती है। हाल ही में, हाइब्रिड पॉलिमर-लिपिड वेसिकल्स और झिल्ली डिजाइन करने के लिए ब्लॉक कोपॉलिमर के साथ फॉस्फोलिपिड का संघअध्ययन कीबढ़ती संख्या का विषय रहा है4,5। मुख्य विचार उन संस्थाओं को डिजाइन करना है जो सहक्रियात्मक रूप से प्रत्येक घटक (पॉलीमर झिल्ली की यांत्रिक स्थिरता और रासायनिक बहुमुखी प्रतिभा के साथ लिपिड बाइलेयर की जैव-कार्यक्षमता और पारगम्यता) के लाभों को जोड़ते हैं, जिनका विभिन्न अनुप्रयोगों में दोहन किया जा सकता है: नियंत्रित और लक्षित दवा वितरण, निदान के लिए बायोसेंसर के भीतर जैव आणविक मान्यता, कृत्रिम कोशिकाओं के लिए कार्यात्मक झिल्ली, जैव-प्रेरित माइक्रो/नैनो रिएक्टरों का विकास।

आजकल, विभिन्न वैज्ञानिक समुदायों (बायोकेमिस्ट, केमिस्ट, बायोभौतिकविदों, भौतिकविज्ञानियों, भौतिकरसायनज्ञों, जीव विज्ञानियों) ने अधिक उन्नत कोशिका झिल्ली मॉडल के विकास में रुचि बढ़ाई है। यहां, हमारा लक्ष्य विशाल वेसिकल्स के यांत्रिक गुणों को प्राप्त करने और चित्रित करने के लिए मौजूदा पद्धतियों (इलेक्ट्रोफॉर्मेशन, माइक्रोपाइपेट आकांक्षा) को प्रस्तुत करना है और हाल ही में "उन्नत" सेल झिल्ली मॉडल हैं जो हाइब्रिड बहुलक लिपिड विशाल वेसिकल्स4,5हैं।

इन तरीकों का उद्देश्य क्षेत्र संपीड़न और झिल्ली के झुकने मोडुली के साथ-साथ उनके लिसिस तनाव और तनाव का विश्वसनीय माप प्राप्त करना है। एक विशाल वेसिकल की झुकने कठोरता को मापने के लिए मौजूदा सबसे आम तकनीकों में से एक प्रत्यक्ष वीडियो माइक्रोस्कोप अवलोकन के आधार पर उतार-चढ़ाव विश्लेषण6,7है; लेकिन इसके लिए बड़े दिखाई देने वाले झिल्ली उतार-चढ़ाव की आवश्यकता होती है, और व्यवस्थित रूप से मोटी झिल्ली (जैसे बहुलक) पर प्राप्त नहीं किया जाता है। क्षेत्र संपीड़न मोडलस प्रायोगिक रूप से लैंगम्यूर ब्लॉकेट तकनीक का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन अक्सर मोनोलेयर8पर। माइक्रोपिपेट आकांक्षा तकनीक एक प्रयोग में विशाल unilamellar vesicle (GUV) बनाने वाले एक बाइलेयर पर दोनों मोडुली के माप की अनुमति देती है।

निम्नलिखित विधि सभी एम्फीफिलिक अणुओं या मैक्रोअणुओं के लिए उपयुक्त है जो बाइलेयर बनाने में सक्षम हैं और नतीजतन, विद्युतीकरण द्वारा वेसिकल्स। इसके लिए इलेक्ट्रोफॉर्मेशन के तापमान पर बाइलेयर के तरल चरित्र की आवश्यकता होती है।

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Protocol

1. माइक्रोपाइपेट गढ़ना

नोट: यहां, 6 से 12 माइक्रोन तक के आंतरिक व्यास वाले माइक्रोपाइपेट और 3-4 मिमी के आसपास एक टेपर लंबाई आवश्यक है। निम्नलिखित में माइक्रोपाइपेट के निर्माण की एक विस्तृत विधि वर्णित है।

  1. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका को खींचने वाले के ड्राबार में रखें और घुंडी को कसकर एक सिरों को ठीक करें।
  2. ध्यान से हीटर कक्ष के किनारे पर छेद के माध्यम से गिलास स्लाइड।
  3. दूसरे छोर पर क्लैंपिंग घुंडी को कस लें।
  4. वांछित विनिर्देशों को प्राप्त करने के लिए टिप और टेपर लंबाई के आकार को नियंत्रित करें। इसके लिए, हीटिंग तापमान, पुल, वेग, देरी और दबाव जैसे तकनीकी मापदंडों का अनुकूलन करें। यहां एक कार्यक्रम का उपयोग किया जाने का एक उदाहरण दिया गया है:
    गर्मी: 550 डिग्री सेल्सियस
    पुल: 10 (मशीन की सीमा: 0-255 मनमाने ढंग से इकाइयों में)
    वेग: 30 (रेंज: मनमाने ढंग से इकाइयों में 0-255)
    देरी: 1 (रेंज: 0-255 मनमाने ढंग से इकाइयों में)
    दबाव: 500 (रेंज: मनमाने ढंग से इकाइयों में 0-999)
  5. कार्यक्रम द्वारा परिभाषित घटनाओं को निष्पादित करने के लिए पुलएल पर क्लिक करें। केशिका को फिर दो माइक्रोपाइपेट में अलग किया जाता है, जिनके आयामों को माइक्रोफोर्ज का उपयोग करके समायोजित किया जाना है।
  6. माइक्रोफोर्ज के मेटल पिपेट होल्डर में माइक्रोपाइपेट डालें (फिगर 1देखें) । 10x उद्देश्य का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप चरण और पिपेट जोड़तोड़ (ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज आंदोलन) को तब तक समायोजित करें जब तक कि पिपेट टिप कांच के मनका सतह के करीब न हो।
  7. कांच के बीड को पिघलाने के लिए पैर स्विच दबाएं। टिप को कम करें और इसे पिघले हुए ग्लास बीड के संपर्क में रखें। पिघला हुआ ग्लास केशिका कार्रवाई से पिपेट में प्रवाहित होगा। कुछ सेकंड रुको जब तक पिघला हुआ कांच का स्तर एक निश्चित ऊंचाई तक पहुंच जाता है जैसा कि चित्रा 1के सम्मिलन में दिखाया गया है।
  8. पैर स्विच पर दबाव को दूर करके हीटिंग बंद करो, और जल्दी से एक तेज ब्रेक का कारण बनाने के लिए ऊर्ध्वाधर पिपेट जोड़तोड़ का उपयोग करटिप को दूर खींचें।
  9. वांछित व्यास प्राप्त होने तक चरण 1.7 और 1.8 दोहराएं (6 से 12 माइक्रोन)।
    नोट: व्यास माप की सटीकता में सुधार करने के लिए, अंतिम चरण के दौरान, एक रेटिकल से लैस 32x उद्देश्य का उपयोग करें।

2. बीएसए के साथ कोटिंग पिपेट टिप्स (गोजातीय सीरम एल्बुमिन)

  1. शुद्ध पानी में 1% wt. बीएसए युक्त ग्लूकोज का 0.1 एम समाधान तैयार करने के लिए।
    1. 180 मिलीग्राम ग्लूकोज पाउडर का वजन करें, 15 मिलीग्राम पॉलीप्रोपाइलीन शंकुई ट्यूब में रखें और 10 मिलीग्राम शुद्ध पानी के साथ पूरा करें।
    2. बीएसए पाउडर के 0.1 ग्राम जोड़ें और पूर्ण विघटन (लगभग 4 घंटे) तक एक परीक्षण ट्यूब घूर्णन मिक्सर का उपयोग कर धीरे हिलाएं।
  2. सुई के साथ लगे 10 मिलीआर डिस्पोजेबल लूयर सिरिंज के साथ समाधान लें। एक बार भर जाने के बाद, सुई निकालें और 0.22 माइक्रोन एसीटेट सेल्यूलोज फिल्टर स्थापित करें। कई पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब (1.5 mL) भरें जिनका उपयोग टिप को विसर्जित करने के लिए किया जाएगा।
  3. केशिकाओं को धारकों में खड़ी रखें। धारक को कम करें और टिप को रात भर ग्लूकोज/बीएसए समाधान में विसर्जित कर दें। समाधान केशिका कार्रवाई से लगभग 1 सेमी ऊंचा उठना चाहिए।
  4. ग्लूकोज/बीएसए समाधान से पिपेट टिप निकालें। 0.1 एम ग्लूकोज समाधान (शुद्ध पानी के 5 मिलीग्राम में ग्लूकोज पाउडर के 90 मिलीग्राम पतला) के 5 मिलीग्राम तैयार करें और 0.22 माइक्रोन एसीटेट सेल्यूलोज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. एक लचीला फ्यूजसिलिका केशिका से लैस 500 माइक्रोन ग्लास सिरिंज का उपयोग करके ग्लूकोज समाधान के साथ पिपेट भरें। फिर, इसे वापस चूसने और इसे त्यागने(चित्र ा 2)द्वारा सभी ग्लूकोज समाधान निकालें। असीम बीएसए को हटाने के लिए इस कदम को कई बार दोहराएं।

3. इलेक्ट्रोफॉर्मेशन द्वारा जीयूवी और जीएचयूवी का गठन

नोट: इलेक्ट्रोफॉर्मेशन एक आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला टेक्नीक है जोएंजेलोवा 9द्वारा विकसित किया गया है। इलेक्ट्रोफॉर्मेशन चैंबर प्राप्त करने की प्रक्रियाएं, एक लिपिड या बहुलक फिल्म जमा करें (या दोनों GHUVs (विशाल हाइब्रिड Unilamellar Vesicles) के लिए) और एक वैकल्पिक बिजली के क्षेत्र के तहत फिल्म हाइड्रेट निम्नलिखित में वर्णित हैं । प्राप्त जीयूवी को एकत्र करने की प्रक्रिया भी वर्णित है।

  1. एम्फीफाइल, सुक्रोज और ग्लूकोज समाधान तैयारकरना
    1. 1 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता पर एक अखाड़ा समाधान तैयार करें । 10 मिलीग्राम एम्फीफाइल का वजन करें और क्लोरोफॉर्म के 10 मिलीग्राम में भंग हो जाए। सॉल्वेंट वाष्पीकरण से बचने के लिए समाधान को सीलबंद शीशियों में रखें।
    2. क्लोरोफॉर्म में 1 मिलीग्राम/mLपर 1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोथेनॉलमाइन-एन-(लिसामाइन रोडामाइन बी सल्फोनाइल) (डोप-रोड) का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें ।
    3. एम्फीफाइल समाधान के लिए फ्लोरोसेंट लिपिड समाधान के 10 μL जोड़ें। सॉल्वेंट वाष्पीकरण से बचने के लिए समाधान ों को सीलबंद शीशियों में रखें।
    4. 0.1 एम. वजन 342 मिलीग्राम और 180 मिलीग्राम सुक्रोज और ग्लूकोज की एकाग्रता पर सुक्रोज और ग्लूकोज समाधान तैयार करें, और उन्हें शुद्ध पानी के 10 मिलीग्राम में भंग करें।
  2. विद्युत रचना कक्ष की तैयारी
    नोट: विभिन्न चालक्की सामग्री का उपयोग इलेक्ट्रोफॉर्मेशन डिवाइस (जैसे, प्लेटिनम तार10,स्टेनलेस सुई11)बनाने के लिए किया जा सकता है। इलेक्ट्रोफॉर्मेशन चैंबर एक ओ-रिंग रबर स्पेसर द्वारा अलग दो ITO स्लाइड से बना है जिसे एपर्चर बनाने के लिए एक तरफ काटा गया है। स्लाइड्स में है दो बिजली के तारों के जरिए एक वोल्टेज जनरेटर(चित्रा 3 और चित्रा 4ए)से जुड़े हैं ।
    1. ऑर्गेनिक सॉल्वेंट (जैसे, क्लोरोफॉर्म) के साथ आइटीओ स्लाइड्स को साफ करें। ओममीटर का उपयोग करके चालक्टिव सतह की पहचान करें।
    2. चिपकने वाला टेप का उपयोग करचाली पक्ष पर बिजली के तारों को संलग्न करते हैं।
    3. एम्फीफाइल समाधान जमाव
      1. समाधान में एक केशिका डुबकी जब तक स्तर केशिका कार्रवाई से बढ़ जाती है और समाधान के बारे में 5 μL इकट्ठा।
      2. केशिका को आइटीओ ग्लास प्लेट के केंद्र के संपर्क में रखें और धीरे-धीरे समाधान फैलाएं। पूर्ण सॉल्वेंट वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए 10 सेकंड रुको(चित्रा 4ए)।
      3. इस प्रक्रिया को प्रत्येक पक्ष के लिए 3 बार दोहराएं।
    4. खोला ओ अंगूठी स्पेसर के दोनों ओर सिलिकॉन मुक्त तेल की एक परत जोड़ें । इसे बयान के क्षेत्र के आसपास रखो। स्पेसर के शीर्ष पर दूसरी आइटीओ ग्लास प्लेट का चालक्करने वाला चेहरा रखें।
    5. कार्बनिक विलायक के किसी भी निशान को हटाने के लिए 3 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत इलेक्ट्रोफॉर्मेशन चैंबर रखें।
  3. विद्युत रचना प्रक्रिया
    1. बिजली के तारों को जनरेटर से प्लग करें।
    2. जनरेटर के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें:
      वैकल्पिक सिनसॉइडल तनाव
      आवृत्ति: 10 हर्ट्ज
      आयाम: 2 वीपीक-टू-पीक
      नोट: इष्टतम वोल्टेज आवृत्ति और अवधि प्रत्येक प्रणाली के लिए पाया जाना चाहिए ।
    3. सुनिश्चित करें कि कक्ष में समाधान के इंजेक्शन से पहले वोल्टेज लागू किया जाता है।
    4. कक्ष को भरने के लिए 0.8 मिमी आंतरिक व्यास सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करके समाधान का 1 मिलील इंजेक्ट करें। अंतिम बुलबुले निकालें।
    5. 75 मिन(चित्रा 4बी)के लिए लागू वोल्टेज/आवृत्ति के तहत कक्ष चलो ।
  4. जीयूवी हार्वेस्ट
    1. जनरेटर बंद कर दें।
    2. 0.8 मिमी आंतरिक व्यास सुई के साथ 1 मिलीग्राम सिरिंज का उपयोग करना, कक्ष के अंदर एक हवा बुलबुला पैदा करने के लिए समाधान का एक छोटा सा हिस्सा चूसना। कक्ष के अंदर इस बुलबुले को स्थानांतरित करने के लिए कक्ष को थोड़ा झुकाएं। यह जीयूवी को ईटीओ सतह(चित्रा 4सी)से अलग करने में मदद कर सकता है।
    3. सभी समाधान चूसना और यह एक 1 mL प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं।
    4. तारों को हटाएं और कार्बनिक सॉल्वैंट्स (टोल्यूईन तो क्लोरोफॉर्म) के साथ आईटीओ स्लाइड्स को साफ करें।

4. माइक्रोजोड़ स्थापित

नोट: माइक्रोपाइपेट आकांक्षा का सिद्धांत अवसाद लागू करके ग्लास माइक्रोपाइप्ट के माध्यम से एक ही वेसिकल चूसना है। पिपेट के अंदर जीभ की लंबाई को सक्शन प्रेशर के एक समारोह के रूप में मापा जाता है। बीएसए के साथ पिपेट कोटिंग, पहले वर्णित है, वेसिकल्स झिल्ली और पिपेट के बीच किसी भी आसंजन को रोकने या कम करने के लिए आवश्यक है।

प्रोटोकॉल नीचे सचित्र है।

  1. पिपेट और पानी भरा जलाशय कनेक्शन
    नोट: पानी से भरी टंकी और माइक्रोमीटर एक फिसलने वाली प्लेट के लिए तय कर रहे हैं । माइक्रोमीटर हेड वाला डिजिटल काउंटर 0 से 2.5 सेमी की रेंज में डिवाइस के वर्टिकल विस्थापन और 1 माइक्रोन की सटीकता की अनुमति देता है। एल्यूमीनियम ऑप्टिकल रेल के साथ विस्थापन लंबाई में 1 मीटर तक संभव है। एक सिलिकॉन ट्यूबिंग जलाशय और केशिका धारक(चित्रा 5ए)को जोड़ता है।
    1. टंकी को शुद्ध पानी से भर दें। धारक को टैंक से पानी का प्रवाह बनाने के लिए सिलिकॉन ट्यूबिंग और एस्पिरेट के माध्यम से केशिका धातु धारक के लिए एक डिस्पोजेबल 5 मिलीएल सिरिंज कनेक्ट करें।
    2. हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए ट्यूब को थोड़ा स्पर्श करें। साथ ही सकारात्मक दबाव बनाने के लिए पानी की टंकी को उठाएं। 5 मिलीआर सिरिंज अभी भी धारक से जुड़ी हुई है।
    3. पहले वर्णित कोटिंग और सफाई चरणों के बाद (चरण 2 देखें), अंत में एक बूंद रूपों तक ग्लूकोज समाधान के साथ एक केशिका भरें। इसके अंत में थोड़ा पानी का प्रवाह बनाने के लिए मेटल होल्डर से सिरिंज ट्यूबिंग निकालें।
    4. केशिका को उल्टा घुमाएं और ग्लूकोज की बूंद को धारक से पानी के प्रवाह से जोड़ें। केशिका और धारक को एक साथ पंगा करठीक करें।
  2. एक पिपेट की स्थिति
    नोट: इस ऑपरेशन के दौरान, पानी की टंकी अभी भी एल्यूमीनियम रेल पर तैनात है एक सकारात्मक दबाव बनाए रखने के लिए ।
    1. दो ग्लास स्लाइड (पहले इथेनॉल से साफ) से लैस घर का बना एल्यूमीनियम चरण लें और उन्हें प्रत्येक तरफ वैक्यूम तेल के साथ गोंद करें। इसे माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्थापित करें और चित्रा 5बी, सीमें दिखाए गए ग्लूकोज के 0.1 मीटर वाली 1 मिलीस सिरिंज का उपयोग करके दो स्लाइडों के बीच एक मेनिस्कस बनाएं।
    2. पिपेट और उसके धारक को माइक्रोजोड़क की मोटर यूनिट पर रखें और क्लैंपिंग घुंडी को कस लें।
    3. ग्लूकोज मेनिसकस के पास माइक्रोपाइपेट को कम करने के लिए मोटे मोड में कंट्रोल पैनल जॉयस्टिक का उपयोग करें। ठीक मोड का उपयोग करके मेनिसकस के केंद्र में टिप की स्थिति को समायोजित करें।
    4. अपनी बाहरी और आंतरिक सतह को साफ करने के लिए कुछ मिनटों के लिए ग्लूकोज में डूबे टिप को पकड़ें (जैसे सकारात्मक दबाव बनाए रखा जाता है, पानी का प्रवाह अनकोटेड बीएसए को हटाने के लिए पिपेट की भीतरी सतह को कुल्ला देगा)।
    5. माइक्रोस्पेशलकरने वाले कीबोर्ड पर टिप की स्थिति को स्टोर करें और इसे मेनिसकस से निकाल लें।
    6. ग्लूकोज मेनिसकस निकालें और इसे एक ताजा एक द्वारा बदलें। 0.1 एम सुक्रोज में जीयूवी के 2 माइक्रोन चूसना एक 20 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके और इसे ताजा ग्लूकोज मेनिसकस में डाल दिया। सीआईसी मोड (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) में देखें सुक्रोज (मुख्य रूप से जीयूवी के अंदर) और ग्लूकोज (मुख्य रूप से जीयूवी के बाहर) के बीच घनत्व के अंतर के कारण नीचे स्थित जीयूवी।
    7. जब वेसिकल्स थोड़े हवा निकाल रहे हैं, तो सक्शन पिपेट को फिर से डालें और टिप पर ध्यान केंद्रित करें। पानी की टंकी की ऊंचाई एच0 सेट करें जिसके लिए दबाव लगभग 0 है। इसके लिए, छोटे वेसिकल्स या कणों का लाभ उठाएं जो प्राकृतिक रूप से समाधान में मौजूद हैं और पानी की टंकी की ऊंचाई को तब तक समायोजित करें जब तक कि इन कणों की गति बंद न हो जाए।
    8. इस बिंदु पर, पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए खनिज तेल के साथ meniscus चारों ओर, चित्रा 5डीदेखें ।
      नोट- कमरे के तापमान को एयर कंडीशनिंग का उपयोग करके 20-22 डिग्री सेल्सियस के बीच नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  3. माइक्रोपिपेट आकांक्षा प्रयोग
    1. पिपेट टिप (व्यास में 6-12 माइक्रोन) को कम करें और एक वेसिकल (व्यास में 15-30 माइक्रोन) को एस्पिरेट करने के लिए एक छोटा सक्शन (-1 सेमी) बनाएं। चयनित वेसिकल की झिल्ली में थोड़ा उतार-चढ़ाव होना चाहिए, और किसी भी दृश्य दोष (कोई कली या फिलामेंट)(चित्रा 6)पेश नहीं करना चाहिए।
    2. माइक्रोजोड़क का उपयोग करके और पूरे प्रयोग के दौरान इस स्थिति को बनाए रखने के लिए अन्य वेसिकल से एस्पिरेटेड वेसिकल को अलग करने के लिए पिपेट को उच्च स्तर तक बढ़ाएं।
    3. पानी से भरे टैंक को लगभग -10 सेमी तक कम करके वेसिकल को पूर्व-तनाव दें, फिर इसके प्रारंभिक मूल्य (-1 सेमी) पर लौटने के दबाव को कम करें। झिल्ली से झिल्ली की अधिकता और छोटे दोषों को दूर करने के लिए इस चरण को कई बार दोहराएं।
    4. पानी की टंकी की स्थिति द्वारा परिभाषित -0.5 सेमी की ऊंचाई से, धीरे-धीरे माइक्रोमीटर के साथ सक्शन दबाव को कम करने के लिए एक शासन तक पहुंचने के लिए जिसमें झिल्ली में उतार-चढ़ाव होता है। फिर एक महत्वपूर्ण प्रक्षेपण लंबाई (कुछ माइक्रोन) के साथ टिप में जीभ की स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए दबाव बढ़ाएं।
      नोट: सबसे कम लागू दबाव (पी0)जो सबसे छोटी झिल्ली प्रक्षेपण लंबाई (एल0)को चूसने की अनुमति देता है, संदर्भ बिंदु α0 (चित्रा 7ए)को परिभाषित करेगा। वक्र के सभी बिंदुओं को इस संदर्भ के अनुसार मापा जाएगा (एल-एल0 और पी-पी0)।
    5. माइक्रोमीटर के साथ सक्शन प्रेशर को चरणबद्ध तरीके से बढ़ाकर 0.5-0.8 एमएन/मीटर तक पहुंचने तक बढ़ाएं। हर स्टेप पर 5 एस का इंतजार करें और जीभ का स्नैपशॉट लें। कम तनाव पर यह प्रक्रिया झुकने वाले मॉड्यूलस के निर्धारण को सक्षम बनाती है।
    6. रेल पर फिसलने से भरे पानी की ऊंचाई को समायोजित करके 0.5 एमएन/एम से टूटना तनाव तक सक्शन दबाव को बढ़ाते रहें (-2 से -50 सेमी तक)(चित्रा 7बी-डी)। हाईटेंशन शासन में हुए इस प्रयोग से क्षेत्र संपीड़न, लाइस तनाव और लिसिस तनाव को मापा जाएगा।
    7. महत्वपूर्ण आंकड़े प्राप्त करने के लिए लगभग 15-20 वेसिकल्स को फैलाें। प्रत्येक माइक्रोपिपेट आकांक्षा प्रयोग 7 और 10 मिनट के बीच लेता है। जीभ की प्रक्षेपण लंबाई, वेसिकल्स के व्यास और केशिका के त्रिज्या को मापने के लिए LASAF सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण करें।
  4. झुकने मोडलस को मापने, क्षेत्र संपीड़न मॉड्यूलस, lysis तनाव और lysis तनाव
    1. इन मापदंडों तक पहुंचने के लिए ई इवांस12द्वारा स्थापित औपचारिकता का उपयोग करें । समीकरण 1 से झिल्ली पर लागू सक्शन दबाव की गणना करें:
      Hindi तरहकी बात है।
      जहां जी गुरुत्वाकर्षण त्वरण (9.8 मीटर एस−2),डब्ल्यू पानी का घनत्व है (1 जी 1 सेमी−3),एच पानी की टंकी की स्थिति है और एच0 प्रारंभिक स्थिति है जहां दबाव शून्य के बराबर है।
    2. लैप्लेस समीकरण से झिल्ली तनाव की गणना करें:
      Equation 1(2)
      जहां माइक्रोपाइपेट पर सक्शन का दबाव है, वहीं आरपी और आरवी क्रमशः माइक्रोपाइपेट और वेसिकल रेडी (माइक्रोपाइपेट के बाहर) हैं। झिल्ली के सतह क्षेत्र तनाव (α) के रूप में परिभाषित किया गया है:
      Equation 2(3)
      Equation 3निचले सक्शन दबाव पर वेसिकल का झिल्ली क्षेत्र होने के नाते।
    3. समीकरण 412के अनुसार केशिका टिप के अंदर वेसिकल की प्रक्षेपण लंबाई में वृद्धि से α की गणना करें:
      Equation 4(4)
    4. एक बहुत ही कम तनाव व्यवस्था के तहत, थर्मल झुकने undulations की चौरसाई स्पष्ट विस्तार हावी है । प्लॉट ln (α) बनाम α । कम मूल्यों पर (आमतौर पर 0.001-0.5 mN.m−11), यह एक सीधी रेखा देता है जिसकी ढलान झुकने वाले मॉड्यूलस, कश्मीरबी (समीकरण का पहला कार्यकाल 5)14से जुड़ी हुई है:
      Equation 5(5)
      नोट: उच्च तनाव (> 0.5m.m−1)के तहत, झिल्ली लहरपूरी तरह से दबा दी जाती है और अणुओं के बीच बढ़ी हुई अंतर के परिणामस्वरूप झिल्ली क्षेत्र बढ़ जाता है। इस शासन में, समीकरण 5 का दूसरा कार्यकाल हावी है और क्षेत्र संपीड़न मोडलस कश्मीरए (चित्रा 8 और चित्रा 9)तक पहुंच देता है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के साथ उपरोक्त, हमने फॉस्फोलिपिड से प्राप्त विभिन्न सिंथेटिक विशाल यूनिमेलर वेसिकल (जीयूवी) का अध्ययन किया है: 2-ओलियोइल-1-पामिटोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओसी), एक ट्राइब्लॉक कोपॉलिमर: पॉली (एथिलीनऑक्साइड)बी-पॉली(डाइमिथिलसिलिक्सेन) -बी-पॉली (एथिलीनऑक्साइड) (पीईओ12-बी- पीडीएम43-बी-पीईओ12)पिछले अध्ययनमेंसंश्लेषित किया गया था, और एक डिब्लॉक कोपॉलिमर पॉली (डाइमेथिलसिलॉक्सेन) -बी-पॉली( एथिलीनऑक्साइड) (पीडीएम27-बी-पीईओ17)। यह पहले हमारे समूह द्वारा दिखाया गया है कि ट्राइब्लॉक कोपॉलिमर पीईओ8-बी-पीडीएम22- बी-पीईओ8 फॉस्फोलिपिड पीओससी के साथ परिणामस्वरूप GHUVs (विशाल हाइब्रिड Unilamellar Vesicles)15की झिल्ली क्रूरता की भारी कमी की ओर जाता है। इस अध्ययन के लिए माप दोहराया गया है और इस डिब्लॉक कोपॉलिमर और पीओसी के संघ से प्राप्त डिब्लॉक कोपॉलिमर और जीएचयूवी से प्राप्त जीयूवी तक बढ़ाया गया है।

परिणाम चित्र 10 और तालिका 1में सचित्र हैं । पीओपी के लिए क्षेत्र संपीड़न और लिसिस तनाव साहित्य16के साथ सही समझौते में हैं । हाइब्रिड वेसिकल के झुकने वाली मोडली की माप अभी तक प्रयोगशाला में नहीं की गई है। प्राप्त बहुलकों के लिए विशिष्ट मूल्य दिए जाते हैं। यह उल्लेख करने लायक है कि डिब्लॉक कोपॉलिमर से प्राप्त झिल्ली (ईसी)की क्रूरता ट्राइब्लॉक कोपॉलिमर के साथ प्राप्त लोगों से कहीं आगे है। इससे भी दिलचस्प बात यह है कि डिब्लॉक कोपॉलिमर के साथ विशाल हाइब्रिड अनइलामेलर लिपिड/बहुलक वेसिकल्स प्राप्त करना संभव है जो लिपोसोम्स की तुलना में उच्च क्रूरता पेश करते हैं, जो इस तरह के संघ का मुख्य हित है ।

Figure 1
चित्रा 1: पिपेट युक्तियों को चमकाने के लिए माइक्रोफोर्ज। तस्वीर डिवाइस के विभिन्न भागों से पता चलता है: धातु पिपेट धारक(ए),ग्लास केशिका(बी),माइक्रोजोड़क हीटर जोन(सी),प्रकाश स्रोत(डी),10x, 32x, 40x उद्देश्यों(ई),और माइक्रोस्कोप नेत्र(एफ)। डालने में, कांच के माक में डूबे पिपेट टिप को रेटिकल के साथ 32x उद्देश्य के माध्यम से मनाया जाता है। टिप में पिघले हुए ग्लास का स्तर ठंडा होने के बाद इंटरमीडिएट हाइट (एच) पर तय किया गया है। टिप को दूर खींचने से तेज ब्रेक होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कोटिंग और पिपेट युक्तियों को भरने के लिए प्रायोगिक सेट अप करें। (A)ग्लूकोज के घोल से माइक्रोपाइपेट को भरने के लिए फ्लेक्सिबल सिलिका केशिका से लैस 500 माइक्रोन ग्लास सिरिंज लगाई जाती है। (ख)केशिका निचले हिस्से का आवर्धन । रात भर विसर्जन के दौरान बीएसए समाधान स्तर लंबाई में 1 सेमी तक केशिका कार्रवाई से बढ़ जाता है। इसके बाद बिना शबद बीएसए को हटाने के लिए लचीली केशिका डालकर पिपेट को ग्लूकोज से भर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक आइटीओ आधारित विद्युत रचना उपकरण बनाने के लिए सामग्री। डिवाइस दो ग्लास स्लाइड से बना है जो एक तरफ इंडियम टिन ऑक्साइड(ए)के साथ लेपित है। चैंबर के अंदर समाधान की लोडिंग और जीयूवी सस्पेंशन(बी)की फसल की अनुमति देने के लिए एक तरफ रबर ओ-रिंग काटा गया है । रबर ओ-रिंग को दो स्लाइड्स को अलग करने के लिए स्पेसर के तौर पर इस्तेमाल किया जाता है । स्लाइड बिजली के तारों(सी)के माध्यम से वोल्टेज जनरेटर से जुड़े हुए हैं और चिपकने वाला टेप(डी)द्वारा सतह से जुड़े हैं। स्लाइड्स(ई)के साथ स्पेसर को सील करने के लिए सिलिकॉन-फ्री तेल का इस्तेमाल किया जाता है । ओममीटर का उपयोग आइटीओ कोटेड पक्षों की पहचान करने और चालकता(एफ)की जांच करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विद्युत रचना की स्थापना की। (A)एम्फीफाइल समाधान कांच की प्लेटों के आइटीओ लेपित किनारों पर एक ग्लास केशिका का उपयोग करके जमा किया जाता है। (ख)विधानसभा और सुखाने के कदम के बाद, चैंबर वोल्टेज जनरेटर (10 हर्ट्ज, 2 वी) से जुड़ा हुआ है और फिर सुक्रोज समाधान से भरा है। (ग)विद्युतरूपण के बाद, जीयूवी को सतह से अलग करने में मदद करने के लिए कक्ष के अंदर एक हवा का बुलबुला बनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोपिपेट आकांक्षा की स्थापना की । (क)घटक विवरण: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (1), पानी से भरा टैंक और एक एल्यूमीनियम ऑप्टिकल रेल (2), सिलिकॉन ट्यूबिंग जलाशय से माइक्रोपाइपपेट (3), माइक्रोजोड़क नियंत्रण कक्ष (4), माइक्रोजोड़क की मोटर इकाई जो एक्स, वाई और जेड विस्थापन (5), कंपन अलगाव तालिका (6) की अनुमति देता है पर फिसलने । (ख)आवर्धन दो ग्लास स्लाइड (7), पिपेट (8) और पिपेट धारक (9) से लैस घर का बना एल्यूमीनियम चरण दिखा माइक्रोजोड़क की मोटर इकाई पर घुड़सवार और घुंडी (10) क्लैंपिंग द्वारा तय की गई । ध्यान दें कि पिपेट टिप ग्लूकोज मेनिसकस के केंद्र में डूबी हुई है। (सी)ग्लास स्लाइड प्रत्येक तरफ वैक्यूम तेल से चिपके हुए ग्लूकोज मेनिसकस (साइड व्यू)के गठन की अनुमति देता है । (D)पानी के वाष्पीकरण (टॉप व्यू) को रोकने के लिए मिनरल ऑयल से घिरा ग्लूकोज मेनिसकस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: माइक्रोपिपेट आकांक्षा का उपयोग कर तनाव के तहत एक GUV की छवि । रोडामिन टैग लिपिड और ट्रांसमिशन चैनल (डीआईसी) से फ्लोरेसेंस इकट्ठा करने वाले रेड चैनल को मर्ज कर दिया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: अलग चूषण दबाव पर एक GUV की छवियां । (A)जीभ के गठन को प्रेरित करने वाले सबसे कम लागू तनाव का उपयोग प्रारंभिक जीभ की लंबाई (एल0)और वेसिकल त्रिज्या (आरवी)निर्धारित करने के संदर्भ के रूप में किया जाता है। (ख)इंटरमीडिएट ने संबद्ध जीभ की लंबाई (एल) के साथ तनाव मूल्य लागू किया । (ग)बहुत अधिक लागू तनाव। (D)झिल्ली टूटने के ठीक बाद छवि जहां पिपेट त्रिज्या मापा जाता है (आरपी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: माइक्रोपाइप्ट आकांक्षा द्वारा प्राप्त जीयूवी के प्रतिनिधि तनाव-तनाव साजिश। इसी डेटा सेट का उपयोग एलएन (एफ)= एफ (α) और एफ (α) को प्लॉट करने के लिए किया गया है। कम तनाव व्यवस्था में, एलएन (एलएन) α (ग्रीन रैखिक फिट) के साथ लिलक्ड बदलता है और झुकने वाले मॉड्यूलस (केसी)तक पहुंच प्रदान करता है; जबकि हाईटेंशन शासन में, α (लाल रैखिक फिट) के साथ लिलक्ड भिन्न होता है और क्षेत्र संपीड़न मोडलस (केए)तक पहुंच प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: गूवी के प्रतिनिधि तनाव-तनाव साजिश खींच शासन में माइक्रोपिपेट आकांक्षा द्वारा प्राप्त की । प्रयोगात्मक वक्र से जीयूवी के कई यांत्रिक मापदंडनिर्धारित किए जा सकते हैं। क्षेत्र संपीड़न मोडलस (कश्मीरए)प्रारंभिक ढलान से मेल खाती है और वक्र फिटिंग द्वारा मापा जाता है। अंतिम मापा बिंदु Lysis तनाव (αएल)और Lysis तनाव(l)मूल्यों देता है । अंत में, वक्र (नारंगी क्षेत्र) के तहत क्षेत्र को एकीकृत करके एकजुट घनत्व ऊर्जा (ईसी)का अनुमान लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: प्रतिनिधि तनाव-तनाव Liposome, बहुलक और हाइब्रिड बहुलक/लिपिड वेसिकल के लिए प्राप्त भूखंडों । पीओओसी (लाल त्रिकोण), ट्राइब्लॉक कोपॉलिमर (हरे घेरे), डिब्लॉक कोपॉलिमर (नीले वर्ग), ट्राइब्लॉक आधारित हाइब्रिड (हल्के हरे घेरे) और डाइब्लॉक-आधारित हाइब्रिड (हल्के नीले वर्ग) से बना जीयूवी। घटता प्रत्येक प्रणाली के लिए कम से 15 GUVs पर माप औसत द्वारा प्राप्त किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

का αL एल ईसी Kb
(mN.m-1) (%) (mN.m-1) (mN.m-1) (केटी)
पीओपीसी 194 ± 15 4 ± 1 8 ± 2 0.17 ± 0.09 21.1 ± 0.4
पीडीएम27-बी-पीईईओ17 121 ± 8 16 ± 4 15 ± 3 1.37 ± 0.67 10.6 ± 3.5
पीडीएम27-बी-पीईईओ17 132 ± 13 9 ± 4 10 ± 3 0.50 ± 0.38 -
+ 5 wt.% POPC
पीईईओ12-बी-पीडीएम43-बी-पीईईओ12 84 ± 13 7 ± 1 6 ± 2 0.50 ± 0.38 -
पीईईओ12-बी-पीडीएम43-बी-पीईईओ12 91 ± 11 3 ± 1 2 ± 1 0.03 ± 0.01 -
+ 5 wt.% POPC

तालिका 1: फॉस्फोलिपिड, कोपॉलिमर या दोनों से बने जीयूवी पर माइक्रोपाइपेट आकांक्षा तकनीकों का उपयोग करके निर्धारित यांत्रिक मापदंड।

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Discussion

माइक्रोपाइपेट का कोटिंग विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए प्रमुख बिंदुओं में से एक है। माइक्रोपाइपेट के लिए वेसिकल के आसंजन को रोका जाना चाहिए, और एक कोटिंग आमतौर पर बीएसए, केसिन या सर्फासिल के साथसाहित्य 17,18,19,20,21में उपयोग की जाती है। कोटिंग प्रक्रिया के विवरण का उल्लेख शायद ही कभी किया जाता है।

बीएसए को भंग करने के लिए आंदोलन के तहत कम से कम 4 घंटे तक प्रदर्शन किया जाना चाहिए ताकि अच्छा घुलनशीलता हासिल किया जा सके। फिर भी, फिल्ट्रेशन कदम अभी भी किसी भी समुचेव को हटाने के लिए आवश्यक है जो माइक्रोपाइपेट टिप में बाधा डाल सकता है। यदि बीएसए अच्छी तरह से भंग नहीं हुआ है, तो इसमें से अधिकांश को निस्पंदन द्वारा हटा दिया जाएगा, और कोटिंग अप्रभावी होगी। आदर्श एकाग्रता और विघटन का समय क्रमशः 0.8-1 wt. % और 4 घंटे हैं।

एक और महत्वपूर्ण बिंदु माप के दौरान वेसिकल के अंदर और बाहर एक निरंतर ऑस्मोटिक दबाव का बीमा करना है। प्रयोग के दौरान पानी के वाष्पीकरण के कारण ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि से वेसिकल का अपस्फीति हो सकता है और माप (कश्मीरएका कम अनुमान, आदि) परेशान हो सकता है। इस घटना(चित्रा 3डी)को रोकने के लिए तेल की परत का जमाव अनिवार्य है। तेल परत की दक्षता की जांच करने के लिए, कुछ एमएन एम-1 का निरंतर आकांक्षा दबाव 5 मिन के लिए वेसिकल पर लागू किया जा सकता है, और केशिका के अंदर जीभ की लंबाई एल स्थिर होनी चाहिए।

अंतिम महत्वपूर्ण बिंदु पूर्व तनाव कदम (धारा 3.3), शायद ही कभी साहित्य20में उल्लेख किया है । यह कदम कलियों, ट्यूबों और वेसिकल के अतिरिक्त सतह क्षेत्र को हटाने और एक वेसिकल से दूसरे में प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

माइक्रोपिपेट आकांक्षा विधि को सभी जीयूवी पर लागू किया जा सकता है, जब तक कि वे एक तरल झिल्ली (जैसे, टीइलेक्ट्रोफॉर्मेशन एंड जीटीटीएम लिपिड) पेश करते हैं और 100 केटी से नीचे झुकने वाले मॉड्यूलस के अधिकारी होते हैं। एक मोटी और चिपचिपा झिल्ली के मामले में, यहां तक कि द्रव स्थिति में, मोडुली22को मापने के लिए दो पिपेट का उपयोग किया जा सकता है। माइक्रोपाइपेट आकांक्षा तकनीक कई मापदंडों (झुकने और क्षेत्र संपीड़न मोडली) तक पहुंच देने के लिए एक बड़ा लाभ प्रस्तुत करती है और यह एकमात्र तकनीक है जो सीधे गुव की झिल्ली के क्षेत्र संपीड़न मोडलस तक पहुंचने के लिए उपलब्ध है।

हालांकि इस तकनीक को लंबे समय से अच्छी तरह से जाना जाता है, लेकिन इसका उपयोग अभी भी कई वैज्ञानिक समुदायों (जैव भौतिकविज्ञानियों, भौतिकविज्ञानियों, दवा की दुकानों, दवा विक्रेताओं आदि) द्वारा किया जाता है। माइक्रोपिपेट आकांक्षा विधि भविष्य में एक महत्वपूर्ण तकनीक बनी रहेगी, विशेष रूप से उन्नत सिंथेटिक सेल (जैसे हाइब्रिड पॉलिमर/लिपिड वेसिकल्स और प्रोटोसेल) के आगे झिल्ली गुणों की जांच करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता से वित्तीय सहायता (एएनआर Sysa) के लिए एएनआर स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4 external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed Sutter Instrument Co. FB255B 2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Microforge NARISHGE Co. MF-900 fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Sigma-Aldrich 10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip Codan 626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip Codan 62.5607
Disposable acetate cellulose filter Cluzeau Info Labo L5003SPA Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing Polymicro Technologies. TSP530660 Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose Sigma-Aldrich G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT Hamilton Syringe Company 1750
Test tube rotatory mixer Labinco 28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series Newport
Damped Optical Table Newport used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP 2 The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer Mitutoyo Corporation 350-354-10 Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml) Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Sigma-Aldrich
Chloroform VWR 22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) Sigma-Aldrich 810146C Rhodamine tagged lipid
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps Hirschmann 9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
H Grease Apiezon Apiezon H Grease Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides Sigma-Aldrich 703184
Needle Terumo AN2138R1 0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter) Voltcraft VC140
Toluene VWR 28676.297
Voltage generator Keysight 33210A

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References

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Ibarboure, E., Fauquignon, M., Le Meins, J. F. Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration. J. Vis. Exp. (155), e60199, doi:10.3791/60199 (2020).

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