Summary
プロトコルの目的は、マイクロピペット吸引によって巨大小胞の膜機械的特性を確実に測定することである。
Abstract
リン脂質と共重合体から得られる巨大小胞は、制御および標的薬物送達、診断のためのバイオセンサー内の生体分子認識、人工細胞の機能膜、バイオインスピレーションマイクロ/ナノ反応器の開発など、さまざまな用途で利用できます。これらのすべてのアプリケーションにおいて、膜特性の特徴付けは基本的に重要である。既存の特性評価技術の中でも、E.Evansによって開拓されたマイクロピペット吸引は、領域圧縮率率、曲げ弾性率および溶解応力および歪みなどの膜の機械的特性の測定を可能にする。ここでは、脂質または共重合体(またはその両方)の薄膜から巨大小胞を得るためのすべての方法論と詳細な手順、マイクロピペットの製造および表面処理、および前述したすべてのパラメータの測定につながる吸引手順を提示する。
Introduction
リン脂質から得られる巨大小胞(リポソーム)は、1970年代から塩基性細胞膜モデル1として広く用いられている。1990年代後半には、共重合体の自己集合から得られた小胞形態は、脂質類似体2、3を参照してポリマーソームと命名され、機械的安定性が弱く、モジュラー化学機能が悪いリポソームに代わる興味深い代替手段として急速に登場した。しかし、後者は細胞膜の主成分であるリン脂質から構成されているため、細胞バイオミメティックキャラクターはリポソームに比べてかなり限定的である。さらに、膜透過性が低い場合は、膜を介した種の拡散を制御する薬物送達のような一部の用途で問題となる可能性があります。近年、ハイブリッドポリマー脂質小胞および膜を設計するブロック共重合体とリン脂質の会合は、研究の数が増加している4、5である。主なアイデアは、各成分の利点(脂質二重層の生体機能性と透過性とポリマー膜の機械的安定性および化学的多様性)を相乗的に組み合わせたエンティティを設計することです。
今日、異なる科学コミュニティ(生化学者、化学者、生物物理学者、物理化学者、生物学者)は、より高度な細胞膜モデルの開発に対する関心が高まっています。ここで、我々の目標は、可能な限り詳細に、既存の方法論(電気形成、マイクロピペット吸引)を提示し、ハイブリッドポリマー脂質巨大小胞である最近の「高度な」細胞膜モデルと巨大小胞の機械的特性を得て特徴付ける。
これらの方法の目的は、膜の領域圧縮性および曲げモジュライならびに溶解応力およびひずみの信頼性の高い測定を得るすることである。巨大小胞の曲げ剛性を測定するために存在する最も一般的な技術の1つは、直接ビデオ顕微鏡観察に基づく変動分析6、7です。しかし、これは大きな目に見える膜の変動を必要とし、厚い膜(例えばポリマーソーム)上で体系的に得られません。エリア圧縮率係数は、ラングミュア・ブロジェット技術を使用して実験的に決定できますが、ほとんどの場合、単層8上で。マイクロピペット吸引技術は1つの実験の二重層形成巨大な二重小胞小胞(GUV)の両方のモジュライの測定を可能にする。
以下の方法は、二重層を形成できるすべての両親媒性分子または高分子に対して適切であり、その結果、電気形成によって小胞が生じる。これは、電気形成の温度で二重層の流体特性を必要とします。
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Protocol
1. マイクロピペットの製造
注:ここでは、内径が6~12μmのマイクロピペットと、約3~4mmのテーパ長が必要です。マイクロピペットの製造方法の詳細な方法を以下に説明する。
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーをプーラーのドローバーに入れ、ノブを締めて両端を固定します。
- ヒーター室の側面の穴からガラスを慎重にスライドさせます。
- もう一方の端の締め付けノブを締めます。
- チップのサイズとテーパの長さを制御して、目的の仕様を実現します。そのためには、加熱温度、プル、速度、遅延、圧力などの技術的パラメータを最適化します。使用するプログラムの例を次に示します。
熱:550°C
プル:10(機械の範囲:任意の単位で0-255)
速度:30(範囲:任意の単位で0-255)
遅延: 1 (範囲: 0 から 255 任意の単位)
圧力:500(範囲:任意の単位で0-999) - PUL Lをクリックして、プログラムによって定義されたイベントを実行します。毛細血管は2つのマイクロピペットに分けられ、その寸法はマイクロフォージを使用して調整する必要があります。
- マイクロピペットをマイクロフォージの金属ピペットホルダーに挿入します(図1を参照)。10倍の目的を使用して、ピペット先端がガラスビーズ表面に近づくまで、顕微鏡ステージとピペットマニピュレータ(垂直および水平移動)を調整します。
- フットスイッチを押してガラスビーズを溶かします。先端を下げ、溶融ガラスビーズに合わせます。溶融ガラスは毛細血管作用によりピペットに流れ込みます。図 1の挿入に示すように、溶融ガラスのレベルが特定の高さに達するまで数秒待ちます。
- フットスイッチの圧力を取り除いて加熱を停止し、垂直ピペットマニピュレータを使用して先端を素早く引き離して急激なブレークを引き起こします。
- 目的の直径(6~12μm)が得られるまで、手順1.7と1.8を繰り返します。
注:直径測定の精度を向上させるには、最後のステップで、レチクルを装備した32倍の目的を使用します。
2.BSA(ウシ血清アルブミン)でピペットチップをコーティング
- 純水中に1%重量BSAを含むグルコースの0.1M溶液を調製した。
- 180mgのブドウ糖粉末の重量を量り、15 mLポリプロピレン円錐チューブに入れ、10 mLの純水を完備した。
- 0.1gのBSA粉末を加え、試験管回転式ミキサーを使用して溶解(約4時間)になるまで穏やかに振ります。
- 針を取り付けた10 mL使い捨てルアー注射器で溶液を取ります。充填したら、針を取り外し、0.22μmの酢酸セルロースフィルターを取り付けます。先端を浸すのに使用するいくつかのポリプロピレンマイクロ遠心管(1.5 mL)を充填します。
- 毛細血管をホルダーに垂直に配置します。ホルダーを下げ、チップをブドウ糖/BSA溶液に一晩浸します。溶液は、毛細血管作用によって約1cm高く上昇する必要があります。
- ブドウ糖/BSA溶液からピペットチップを取り外します。0.1Mグルコース溶液(純水5mLで90mgのグルコース粉末を希釈)の5mLを調製し、0.22μmの酢酸セルロースフィルターを通して濾過する。
- 柔軟な融合シリカキャピラリーを装備した500°Lガラスシリンジを使用して、ピペットにブドウ糖溶液を充填します。次に、すべてのグルコース溶液を吸い戻して取り除き、廃棄します(図2)。この手順を数回繰り返して、無制限の BSA を削除します。
3. 電気形成によるGUVとGHUVの形成
注:電気形成は、アンジェロバ9によって開発された一般的に使用される技術です。電気形成チャンバを得る手順は、脂質またはポリマーフィルム(またはGHUV(ジャイアントハイブリッドユニラメラ小胞)の両方)を堆積させ、代替電界の下でフィルムを水和する手順を以下に説明する。得られたGUVを収集する手順についても説明する。
- 両親媒性、スクロースおよびグルコース溶液調製
- 1mg/mLの濃度で両親媒性溶液を調製する。10mgの両親媒性物質を重量を量り、クロロホルムの10mLに溶解する。溶剤の蒸発を避けるために、溶液を密閉されたバイアルに保管してください。
- 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミンロダミンBスルホニル)(DOPE-Rhod)のストック溶液をクロロホルム中の1mg/mLで調製する。
- 両親媒性溶液に10μLの蛍光脂質溶液を加えます。溶剤の蒸発を避けるために、溶液を密閉されたバイアルに保管してください。
- スクロースとグルコース溶液をそれぞれ0.1Mの濃度で調製し、それぞれ342mgと180mgのスクロースとグルコースを調製し、純水10mLに溶解する。
- 電気形成室の準備
注:異なる導電性材料は、電気形成装置(例えば、白金線10、ステンレス針11)を作るために使用することができる。電気形成チャンバは、開口部を作成するために片側に切断されたOリングゴムスペーサーによって分離された2つのITOスライドで構成されています。スライドは、2本の電線を介して電圧発生器に接続されています(図3と図4A)。- ITOスライドを有機溶媒(例えば、クロロホルム)で洗浄します。オームメーターを使用して導電性表面を識別します。
- 粘着テープを使用して導電面に電線を取り付けます。
- 両親媒性溶液沈着
- 毛細血管作用によってレベルが上がるまで溶液中に毛細血管を浸し、溶液の約5°Lを収集します。
- 毛細血管をITOガラス板の中心に接触させ、溶液をゆっくりと広げます。10 秒間待って、完全な溶媒蒸発を確認します (図 4A)。
- 両側に対してこの手順を 3 回繰り返します。
- 開いたOリングスペーサーの両側にシリコンフリーグリースの層を追加します。堆積の領域の周りにそれを置きます。2 番目の ITO ガラスプレートの導電面をスペーサーの上部に配置します。
- 電気形成チャンバを真空下に3時間置き、有機溶媒の痕跡を除去します。
- 電気形成手順
- 電線を発電機に差し込みます。
- ジェネレータには次の設定を使用します。
代替弦波張力
周波数:10 Hz
振幅:2Vピークツーピーク
メモ:最適な電圧周波数と持続時間は、各システムに対して見つかる必要があります。 - チャンバー内の溶液を注入する前に電圧が印加されていることを確認します。
- 0.8mmの内径針を用いた注射器を使用して1mLの溶液を注入し、チャンバーを充填します。最終的な気泡を削除します。
- 75分間、印加電圧/周波数の下のチャンバを75分間使用します(図4B)。
- GUVの収穫
- 発電機の電源を切ります。
- 0.8 mmの内径針で1 mLシリンジを使用して、チャンバー内の気泡を生成するために溶液の小さな部分を吸引します。この気泡がチャンバー内を移動させるためにチャンバーをわずかに傾けます。これは、GUV が ITO サーフェスからデタッチするのに役立ちます(図 4C)。
- すべての溶液を吸い、1 mLのプラスチックチューブに移します。
- ワイヤーを取り外し、有機溶媒(トルエン、クロロホルム)でITOスライドをきれいにします。
4. マイクロマニピュレーションの設定
注:マイクロピペット吸引の原理は、うつ病を適用することによってガラスマイクロピペットを介して単一の小胞を吸引することです。ピペット内部の舌の長さは吸引圧力の関数として測定される。前述のBSAによるピペットコーティングは、小胞膜とピペットとの間の接着を防止または最小化するために不可欠です。
プロトコルを次に示します。
- ピペットおよび水満たされた貯水池の関係
メモ:水満タンクとマイクロメータはスライディングプレートに固定されています。マイクロメータヘッド付きのデジタルカウンタは、0~2.5cmの範囲でデバイスの垂直方向の変位を可能にし、アルミニウム光学レールに沿った1μmの変位の精度を可能にし、長さ1メートルまで可能です。シリコンチューブは、貯蔵所と毛細血管ホルダーを接続します(図5A)。- タンクに純水を入れます。使い捨て5 mLシリンジをシリコーンチューブを介してキャピラリーメタルホルダーに接続し、吸引してタンクからホルダーへの水の流れを作り出します。
- 気泡を除去するためにチューブをわずかにタッチします。同時に、水タンクを上げて正の圧力を作り出します。5 mL シリンジはホルダーに取り付けられています。
- 前に説明したコーティングおよび洗浄工程(ステップ2を参照)の後、最後に滴が形成されるまで、毛細血管にブドウ糖溶液を充填する。金属ホルダーからシリンジチューブを取り外し、端にわずかな水の流れを作ります。
- 毛細血管を逆さまにし、グルコースドロップをホルダーからの水の流れと接続します。毛細血管とホルダーをねじ込んで固定します。
- ピペットを配置する
注:この操作中、水タンクは正の圧力を維持するためにアルミニウムレールにまだ置かれます。- 2枚のガラススライド(以前はエタノールで洗浄)を備えた自家製のアルミニウムステージを取り、両側に真空グリースで接着します。顕微鏡ステージに設置し、図5B,Cに示すように0.1Mのグルコースを含む1mLシリンジを用いて2つのスライド間にメニスカスを形成する。
- ピペットとそのホルダーをマイクロマニピュレータのモーターユニットに置き、クランプノブを締めます。
- コントロールパネルのジョイスティックを粗いモードで使用して、グルコース半月板の近くのマイクロピペットを下げます。ファインモードを使用して、先端の位置をメニスカスの中心に調整します。
- チップをブドウ糖に数分間浸して外面と内面を清掃します(正圧が維持されると、水の流れがピペットの内面をすすいで未塗布のBSAを除去します)。
- マイクロマニピュレータキーボードに先端の位置を保存し、半月板から引き出します。
- ブドウ糖半月板を取り除き、新鮮なものに置き換えます。20μLマイクロピペットを使用して0.1MスクロースでGUVの2μLを吸引し、新鮮なグルコースメニスカスに入れます。DICモード(差動干渉コントラスト)で、スクロース(主にGUV内部)とグルコース(主にGUVの外側)の密度の違いにより、下部に位置するGUVを観察します。
- 小胞がわずかに膨張したら、吸引ピペットを挿入し直し、先端に焦点を合わせる。圧力がほぼ0である水タンクの高さH0を設定します。そのためには、溶液中に自然に存在する小胞または粒子を利用し、これらの粒子の動きが止まるまで水槽の高さを調整する。
- この時点で、水蒸発を防ぐためにメニスカスをミネラルオイルで囲み、図5Dを参照してください。
メモ:室温は、エアコンを使用して20〜22°Cの間で制御する必要があります。
- マイクロピペット吸引実験
- ピペット先端(直径6~12μm)を下げ、小さな吸引(-1cm)を作成して小胞(直径15~30μm)を吸引します。選択した小胞の膜はわずかに変動する必要があり、目に見える欠陥(芽やフィラメントなし)を示してはならない(図6)。
- ピペットをより高いレベルに上げて、マイクロマニピュレータを使用して他の小胞から吸引された小胞を分離し、実験全体の間にこの位置を維持します。
- 水満タンクを約-10cmに下げて小胞を予め応力し、その後、圧力を下げて初期値(-1cm)に戻します。この手順を数回繰り返して、膜から膜過剰および小さな欠陥を除去します。
- 水タンクの位置によって定義される-0.5cmの高さから、マイクロメータで吸引圧力をゆっくりと下げ、膜が変動する体制に到達する。次に、圧力を上げ、先端の舌をかなりの投影長(数ミクロン)で明確に視覚化します。
注: 最も小さい膜投影長(L0)を吸い上げることができる最も低い加圧(P0)は、基準点α0(図7A)を定義します。曲線のすべての点は、この基準に従って測定されます (ΔL = L-L0および ΔP = P-P0)。 - マイクロメータで吸引圧力を0.5-0.8 mN/mに達するまで段階的に高めます。各ステップで、5 s を待って、舌のスナップショットを取ります。低張力でのこのプロシージャは曲げ弾性率の決定を可能にする。
- レール上でスライディングする水の高さを調整して、吸引圧力を0.5 mN/mから破裂張力まで上げ続けます(図7B-D)。高張力体制におけるこの実験から、領域圧縮率、溶解緊張および溶解株が測定される。
- 有意な統計を得るために約15-20小胞を伸ばす。各マイクロピペット吸引実験は7〜10分かかります。LASAFソフトウェアを使用して、舌の投影長、小胞の直径、毛細血管の半径を測定するための画像解析を行います。
- 曲げ弾性率、面積圧縮率、溶解張力、溶解株の測定
- これらのパラメータにアクセスするには、E. Evans12によって確立された形式主義を使用します。方程式 1 から膜上に適用される吸引圧力を計算します。
Δ P = εwg (h-h0) (1)
ここで、gは重力加速度(9.8 m∙s−2)、εwは水の密度(ε = 1 g∙cm−3)、hは水タンクの位置、h0は圧力がゼロに等しい初期位置です。 - ラプラス方程式から膜張力を計算します。
(2)
ここでΔPはマイクロピペットの吸引圧力であり、RpおよびRvはそれぞれマイクロピペットおよび小胞半径(マイクロピペットの外側)である。膜の表面積ひずみ(α)は次のように定義されます。
(3)
より低い吸引圧力の小胞の膜区域である。 - 式412に従って毛細管先端内の小胞の投影長ΔLの増加からαを計算する:
(4) - 非常に低い張力体制の下で、熱曲げうねりの平滑化は明らかな膨張を支配する。プロット ln(σ) と α をプロットします。低 σ 値(通常 0.001 ~0.5 mN.m-13)では、傾きが曲げ弾性率にリンクされた直線、Kb (方程式 5 の最初の項)14:
(5)
メモ:高張力(>0.5 mN.m−1)では、膜のうulationが完全に抑制され、分子間の間隔が大きくなった結果、膜面積が増加します。この体制では、方程式5の第2項が支配し、面積圧縮率Ka (図8と図9)へのアクセスを与える。
- これらのパラメータにアクセスするには、E. Evans12によって確立された形式主義を使用します。方程式 1 から膜上に適用される吸引圧力を計算します。
(2)
(3)
より低い吸引圧力の小胞の膜区域である。
(4)
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Representative Results
前述のプロトコルでは、 我々は、異なる合成巨大ユニラメラ小胞(GUV)を研究し、リン脂質から得られる:2-オレオロイル-1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、三重黒分子:ポリ(エチレキシド)-b-ポリ(ジメチルシロキサン)-b-ポリ(エチレオキシド)(PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)以前の研究で合成された13、およびジブロック共重合体ポリ(ジメチルシロキサン)-b-ポリ(エチレンオキシド) (PDMS27-b-PEO17)トリブロック共重合体PEO8-b-PDMS22-b-PEO8とリン脂質POPCとの会合は、得られたGHUV(ジャイアントハイブリッドユニラメラベシクレス)15の膜靭性の巨大な減少につながることが以前に我々のグループによって示されている。この研究では測定が繰り返され、このジブロック共重合体とPOPCの会合から得られたジブロック共重合体およびGHUVから得られたGUVにまで及んだ。
結果を図 10および表1に示します。POPCのための領域圧縮率率および溶解株は文献16と完全に一致している。ハイブリッド小胞の曲げ変性の測定は、まだ実験室で行われていない。得られたポリマーに対して典型的な値が与えられる。ジブロック共重合体から得られる膜(Ec)の靭性は、トライブロック共重合体で得られるものをはるかに超えているということを挙げられる。より興味深いことに、ジブロック共重合体を用いることにより、このような関連の主な関心事であるリポソームよりも高い靭性を有する巨大なハイブリッドユニラメラ脂質/ポリマー小胞を得ることができる。
図1:ピペットチップを研磨するためのマイクロフォージ写真は、デバイスのさまざまな部分を示しています:金属ピペットホルダー(a)、ガラスキャピラリー(b)、マイクロマニピュレータヒーターゾーン(c)、光源(d)、10x、32x、40x目標(e)、および顕微鏡用眼(f)。インサートでは、ピペット先端をガラスビーズに浸し、レチクルを用いた32倍の目的を通して観察される。先端への溶融ガラスのレベルは、冷却後の中間高さ(H)で固定されています。先端を引き離すと急激なブレークが発生します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ピペットチップのコーティングと充填のための実験的なセットアップ。(A)フレキシブルなシリカキャピラリーを備えた500μLガラスシリンジを取り付け、マイクロピペットをグルコース溶液で充填する。(B)毛細血管下部の倍率。一晩浸漬の間、BSA溶液レベルは長さ1cmまでの毛細管作用によって上昇する。ピペットは、その後、非吸着BSAを除去するために柔軟な毛細血管を挿入することによってグルコースで満たされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ITOベースの電気形成装置を構築するための材料装置は、酸化インジウムスズ(a)で片側にコーティングされた2つのガラススライドで構成されている。ゴムOリングは、チャンバー内の溶液のロードとGUVサスペンション(b)の収穫を可能にするために片側に切断されています。ゴム製Oリングは、2つのスライドを分離するためのスペーサーとして使用されます。スライドは電線(c)を介して電圧発生器に接続され、粘着テープ(d)によって表面に取り付けられます。シリコンフリーグリースは、スライド(e)でスペーサーを密封するために使用されます。オームメータは、ITO被覆面を識別し、導電率(f)をチェックするために使用されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:電気形成を設定する。(A) 両親媒性溶液は、ガラス板のITO被覆面にガラスキャピラリーを用いて堆積する。(B)組み立ておよび乾燥工程の後、チャンバを電圧発生器(10Hz、2V)に接続し、スクロース溶液で満たします。(C) 電気形成後、チャンバー内に気泡が作成され、GUV が表面から取り外されるのに役立ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイクロピペット吸引セットアップ。(A)成分説明:蛍光顕微鏡(1)、アルミニウム光学レール上の水充填タンクおよびマイクロメータスライド、貯留槽からマイクロピペットへの水流を伝導するシリコーンチューブ(3)、マイクロマニピュレータコントロールパネル(4)、X、Y及びZ変位を可能にするマイクロマニピュレータのモータユニット(5)、振動絶縁テーブル(6)。(B)2枚のガラススライド(7)、ピペット(8)及びピペットホルダー(9)をマイクロマニピュレーターのモータユニットに取り付けた自家製アルミニウムステージを示す倍率を、クランプノブ(10)で固定した。なお、ピペット先端は、グルコースメニスカスの中心に浸漬され、(C)各辺に真空グリースで接着されたガラススライド(側面図)を可能にする。(D)水蒸発を防ぐためにミネラルオイルに囲まれたグルコース半月板(上図)この図の大きなバージョンを見てください。
図6:マイクロピペット吸引を用いた張力下のGUVの画像ローダミンタグ付き脂質と透過チャネル(DIC)から蛍光を収集する赤チャネルが融合した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:異なる吸引圧力でのGUVの画像。(A)舌形成を誘導する最も低い加圧張力は、初期舌長(L0)と小胞半径(Rv)を決定するための基準として用いられる。(B)関連する舌長(L)を有する中間加圧値を加えた。(C) 非常に高い適用張力。(D) ピペット半径を測定した膜破裂直後の画像(Rp)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:マイクロピペット吸引により得られたGUVの代表的な応力-ひずみプロット。ln(σ) = f(α) と σ = f(α) をプロットするために同じデータセットが使用されています。低張力体制では、ln(σ)はα(緑色の線形適合)で直線的に変化し、曲げ弾性率(Kc)へのアクセスを与えます。高張力体制ではσはα(赤線線形適合)で直線的に変化し、面積圧縮率モジュラス(Ka)へのアクセスを与えます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:伸張体制におけるマイクロピペット吸引により得られたGUVの代表的な応力-ひずみプロット。実験曲線から、GUVのいくつかの機械的パラメータを決定することができる。面積圧縮率係数(Ka)は初期勾配に対応し、曲線を直線的にフィットさせることによって測定されます。最後の測定点は、Lysisひずみ(αL)とリシス応力(σL)値を示します。最後に、凝集密度エネルギー(Ec)は、曲線の下の面積(オレンジ色の領域)を統合することによって推定することができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:リポソーム、ポリマーおよびハイブリッドポリマー/脂質小胞について得られた代表的な応力-ひずみプロット。POPC(赤三角形)、トライブロック共重合体(緑色の円)、二ブロック共重合体(青い正方形)、三ブロックベースのハイブリッド(明るい緑色の円)、およびディブロックベースのハイブリッド(ライトブルーの正方形)で構成されるGUV。曲線は、各システムについて少なくとも15のGUVの測定値を平均化することによって得られた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| Ka | αL | σL | Ec | Kb | |
| (mN.m-1) | (%) | (mN.m-1) | (mN.m-1) | (kT) | |
| POPC | 194 ± 15 | 4 ± 1 | 8 ± 2 | 0.17 ± 0.09 | 21.1±0.4 |
| PDMS27-b-PEO17 | 121 ± 8 | 16 ± 4 | 15 ± 3 | 1.37 ± 0.67 | 10.6 ± 3.5 |
| PDMS27-b-PEO17 | 132 ± 13 | 9 ± 4 | 10 ± 3 | 0.50 ± 0.38 | - |
| + 5重量%POPC | |||||
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 84 ± 13 | 7 ± 1 | 6 ± 2 | 0.50 ± 0.38 | - |
| PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 | 91 ± 11 | 3 ± 1 | 2 ± 1 | 0.03 ± 0.01 | - |
| + 5重量%POPC |
表 1:リン脂質、共重合体、またはその両方からなるGUV上のマイクロピペット吸引技術を用いて決定される機械的パラメータ。
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Discussion
マイクロピペットのコーティングは信頼できる測定を得るための重要なポイントの1つである。小胞のマイクロピペットへの付着を防止する必要があり、コーティングは、BSA、β-カゼインまたはサーファシルを用いて文献17、18、19、20、21で一般的に使用される。塗布手順の詳細はめったに言及されない。
BSAの溶解は、良好な可溶化を達成するために攪拌下で少なくとも4時間行われるべきである。それにもかかわらず、濾過工程は、マイクロピペット先端を妨げる可能性のある凝集体を除去するために依然として必要である。BSAが十分に溶解しない場合、そのほとんどは濾過によって除去され、コーティングは効果がありません。理想的な濃度および溶解時間はそれぞれ0.8-1重量%および4時間である。
もう一つの重要なポイントは、測定中に小胞の内側と外側に一定の浸透圧を保証することです。実験中の水蒸発によるグルコース濃度の上昇は、小胞のデフレにつながり、測定を摂動する(Ka等の過小評価)。この現象を防ぐために、油層の堆積が必須です(図3D)。油層の効率を確認するために、少数のmN∙m-1の一定の吸引圧力は5分間小胞に加えることができる、と毛細血管の内部の舌の長さLは一定でなければならない。
最後の重要なポイントは、プレストレスステップ(セクション3.3)であり、文献20ではめったに言及されていません。このステップは、芽、チューブおよび小胞の余分な表面積を除去し、小胞から別のものに再現可能な結果を得るために必要である。
マイクロピペット吸引法は、流体膜(例えば、T電気形成>Tmの脂質)を有し、100kT未満の曲げ弾性率を有する限り、すべてのGUVに適用することができる。厚く粘性膜の場合には、流体状態であっても、2つのピペットを用いてモジュライ22を測定することができる。マイクロピペット吸引技術は、いくつかのパラメータ(曲げと領域圧縮性モジュライ)へのアクセスを与える大きな利点を提示し、これはGUVの膜の領域圧縮性弾性率に直接アクセスするために利用可能な唯一の技術です。
この技術は長い間よく知られていますが、多くの科学界(生物物理学者、物理化学者、化学者など)で一般的に使用されています。マイクロピペット吸引法は、特に高度な合成細胞(例えばハイブリッドポリマー/脂質小胞および原始細胞)のさらなる膜特性を調査するために、将来的に重要な技術であり続ける。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者たちは、ANRの財政支援(ANR Sysa)を感謝して認めた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
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