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Chemistry

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

Published: January 19, 2020 doi: 10.3791/60199

Summary

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

Abstract

인지질및공중합체에서 얻은 거대 소포는 제어 및 표적 약물 전달, 진단을 위한 바이오센서 내 생체 분자 인식, 인공 세포를 위한 기능성 멤브레인, 바이오영감 마이크로/나노 반응기 개발 등 다양한 응용 분야에서 이용될 수 있습니다. 이러한 모든 응용 분야에서 멤브레인 특성의 특성화는 근본적으로 중요합니다. E. Evans가 개척한 기존 특성화 기술 중 에는 면적 압축성 계수, 굴곡 계수 및 용해 응력 및 변형과 같은 멤브레인의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 여기서, 우리는 지질 또는 공중합체 (또는 둘 다)의 박막에서 거대한 소포를 얻기 위한 모든 방법론 및 상세한 절차, 마이크로파이펫의 제조 및 표면 처리, 및 이전에 언급한 모든 파라미터의 측정으로 이어지는 흡인 절차를 제시한다.

Introduction

인지질(liposomes)으로부터 얻은 거대 소포는 1970년대부터 기본 세포막 모델1로서널리 사용되어 왔다. 1990 년대 후반에, 그들의 지질 유사체2,3에관하여 명명된 폴리머의 자기 조립에서 얻은 포식어는, 급속하게 약한 기계적 안정성 및 가난한 모듈형 화학 기능을 가진 리포좀에 대한 흥미로운 대안으로 나타났습니다. 그러나, 그들의 세포 생모방 특성은 세포막의 주성분인 인지질로 구성되어 있기 때문에 리포좀에 비해 다소 제한적이다. 더욱이, 그들의 낮은 막 투과성은 막을 통해 종의 통제된 확산이 요구되는 약 납품 같이 몇몇 응용에서 문제가 될 수 있습니다. 최근, 하이브리드 폴리머-지질 소포 및 멤브레인을 설계하는 블록 공중합체와 인지질의 연관성이4,5연구의증가의 대상이 되고 있다. 주요 아이디어는 각 구성 요소의 이점 (지질 이중층의 생체 기능 및 투과성 및 폴리머 멤브레인의 기계적 안정성 및 화학적 다양성)을 시너지 효과로 결합하는 법인을 설계하는 것입니다: 제어 및 표적 약물 전달, 진단을위한 바이오 센서 내의 생체 분자 인식, 인공 세포를위한 기능성 멤브레인, 바이오 영감 마이크로 / 나노 반응기 의 개발.

요즘, 다른 과학 공동체 (생화학자, 화학자, 생물 물리학자, 물리 학자, 생물학자)는 더 진보 된 세포막 모델의 개발에 대한 관심이 증가하고있다. 여기서, 우리의 목표는 가능한 한 상세히, 기존의 방법론(전기형성, 마이크로파이펫 흡인)을 획득하고 거대 소포의 기계적 특성을 특성화하는 것 및 하이브리드 폴리머 지질 거대소포인최근 "고급" 세포막 모델을 제시하는것이다.

이러한 방법의 목적은 용해 응력 및 변형뿐만 아니라 멤브레인의 영역 압축성 및 굽힘 계수의 신뢰할 수있는 측정을 얻는 것입니다. 거대 소포의 굽힘 강성을 측정하기 위해 존재하는 가장 일반적인 기술 중 하나는 직접 비디오 현미경 관찰에 기초한 변동 분석6,7입니다. 그러나 이것은 큰 가시적인 막 변동을 요구하고, 두꺼운 막 (예를 들면 폴리머 섬)에 체계적으로 장악되지 않습니다. 면적 압축성 계수는 Langmuir Blodgett 기술을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있지만 대부분의 경우 단층8에서결정됩니다. 마이크로파이펫 흡인 기술은 한 실험에서 거대한 unilamellar 소포 (GUV)를 형성하는 이중층에서 둘 다 moduli의 측정을 허용합니다.

다음 방법은 이중층을 형성할 수 있는 모든 양과성 분자 또는 거대 분자에 적합하며, 결과적으로 전기 형성에 의한 소포에 적합합니다. 이를 위해서는 전기 형성 온도에서 이중층의 유체 특성이 필요합니다.

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Protocol

1. 마이크로 파이펫 제조

참고: 여기에서는 내경이 6~12μm이고 테이퍼 길이가 3-4mm인 마이크로파이펫이 필요합니다. 마이크로파이펫 제조의 상세한 방법은 다음과 같은 것으로 설명되어 있다.

  1. 보로실리케이트 유리 모세관을 풀러의 드로바에 넣고 손잡이를 조여 끝부분 중 하나를 고정시다.
  2. 조심스럽게 히터 챔버의 측면에있는 구멍을 통해 유리를 밀어.
  3. 다른 쪽 끝에 있는 클램핑 노브를 아래로 조입니다.
  4. 원하는 사양을 달성하기 위해 팁의 크기와 테이퍼 길이를 제어합니다. 이를 위해 가열 온도, 당김, 속도, 지연 및 압력과 같은 기술적 파라미터를 최적화합니다. 다음은 사용되는 프로그램의 예입니다.
    열: 550 °C
    당기기: 10 (기계 범위: 임의 의 단위에서 0-255)
    속도: 30 (범위: 0-255 임의의 단위)
    지연: 1 (범위: 0-255 임의의 단위)
    압력: 500 (범위: 0-999 임의 의 단위)
  5. PUL L을 클릭하여 프로그램에서 정의한 이벤트를 실행합니다. 모세관은 두 개의 마이크로 파이펫으로 분리되어 마이크로 포지를 사용하여 치수를 조정해야합니다.
  6. 마이크로포지의 금속 파이펫 홀더에 마이크로파이펫을 삽입합니다(그림 1참조). 10x 대물렌즈를 사용하여 파이펫 팁이 유리 비드 표면에 가까워질 때까지 현미경 스테이지와 파이펫 조작기(수직 및 수평 이동)를 조정합니다.
  7. 발 스위치를 눌러 유리 비드를 녹입니다. 팁을 내리고 용융 유리 비드와 접촉합니다. 용융 유리는 모세관 작용에 의해 파이펫으로 흐를 것입니다. 도 1의삽입과 같이 용융 유리의 레벨이 특정 높이에 도달할 때까지 몇 초 정도 기다립니다.
  8. 발 스위치의 압력을 제거하여 가열을 중지하고 수직 파이펫 조작기를 사용하여 팁을 신속하게 당겨 날카로운 파손을 일으킵니다.
  9. 원하는 직경이 얻어지도록 1.7 및 1.8 단계를 반복합니다(6~12 μm).
    참고: 직경 측정의 정확도를 향상시키기 위해 마지막 단계에서 는 레티클이 장착된 32x 대물렌즈를 사용하십시오.

2. BSA (소 혈청 알부민)와 코팅 파이펫 팁

  1. 순수한 물에 1% wt. BSA를 함유하는 포도당의 0.1 M 용액을 준비한다.
    1. 180 mg의 포도당 분말을 계량하고 15 mL 폴리 프로필렌 원두 튜브에 놓고 10 mL의 순수한 물로 완성하십시오.
    2. 0.1 g의 BSA 파우더를 넣고 시험관 회전 믹서를 사용하여 완전히 용해될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다(약 4시간).
  2. 바늘이 장착 된 10 mL 일회용 Luer 주사기로 용액을 가져 가라. 일단 충전되면, 바늘을 제거하고 0.22 μm 아세테이트 셀룰로오스 필터를 설치한다. 팁을 담그는 데 사용되는 여러 폴리 프로필렌 마이크로 원심 분리튜브 (1.5 mL)를 채웁니다.
  3. 모세혈관을 홀더에 수직으로 놓습니다. 홀더를 내리고 팁을 밤새 포도당/BSA 용액에 담급전시. 용액은 모세관 작용에 의해 약 1cm 높이로 상승해야합니다.
  4. 포도당/BSA 용액에서 파이펫 팁을 제거합니다. 0.1 M 포도당 용액 5 mL (순수한 물 5 mL에서 포도당 분말 90 mg 희석)을 준비하고 0.22 μm 아세테이트 셀룰로오스 필터를 통해 여과하십시오.
  5. 유연한 융합 실리카 모세관이 장착된 500 μL 유리 주사기를 사용하여 포도당 용액으로 파이펫을 채웁니다. 그런 다음 모든 포도당 용액을 다시 빨아서 제거하고 폐기하십시오(그림 2). 이 단계를 여러 번 반복하여 무한BSA를 제거합니다.

3. 전기형성에 의한 ROV 및 GUV 형성

참고 : 전기 형성은 안젤로바9에의해 개발 된 일반적으로 사용되는 기술이다. 전기 형성 챔버를 획득하고, 지질 또는 폴리머 필름(또는 GHUVs(자이언트 하이브리드 Unilamellar Vesicles)에 대해 둘 다)를 증착하고 대체 전기장 하에서 필름을 수화하는 절차는 다음과 같습니다. 얻어진 GUV를 수집하는 절차도 설명된다.

  1. 양과필, 자당 및 포도당 용액 준비
    1. 1 mg /mL의 농도로 양서류 용액을 준비하십시오. 10 mg의 양서류의 무게를 측정하고 10 mL의 클로로포름에 용해하십시오. 용매 증발을 방지하기 위해 밀봉 된 바이알에 용액을 보관하십시오.
    2. 클로로포름에서 1 mg/mL에서1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)(DOPE-Rhod)의 스톡 용액을 준비합니다.
    3. 양서류 용액에 10 μL의 형광 지질 용액을 추가하십시오. 용매 증발을 방지하기 위해 밀봉 된 바이알에 용액을 보관하십시오.
    4. 자당과 포도당 용액을 0.1 M. 무게 342 mg과 180 mg의 자당과 포도당을 각각 준비하고 순수한 물 10 mL에 녹입니다.
  2. 전기 형성 챔버의 준비
    참고 : 다른 전도성 재료는 전기 성형 장치를 만들기 위해 사용될 수있다 (예를 들어, 백금 와이어10,스테인레스 바늘11). 전기 형성 챔버는 조리개를 만들기 위해 한쪽에 절단 된 O 링 고무 스페이서로 분리 된 두 개의 ITO 슬라이드로 구성됩니다. 슬라이드는 두 개의 전선을 통해 전압 발생기에 연결됩니다(그림3그림 4A).
    1. 유기 용매 (예 : 클로로포름)로 ITO 슬라이드를 청소하십시오. 옴미터를 사용하여 전도성 표면을 식별합니다.
    2. 접착제 테이프를 사용하여 전도성 측에 전선을 부착합니다.
    3. 양서류 용액 증착
      1. 모세관 작용에 의해 레벨이 증가할 때까지 용액에 모세관을 담그고 용액의 약 5 μL을 수집합니다.
      2. 모세관을 ITO 유리 판의 중앙과 접촉시키고 용액을 부드럽게 펴십시오. 완전한 용매 증발을 보장하기 위해 10 초 동안 기다립니다(그림 4A).
      3. 이 절차를 각 면에 대해 3번 반복합니다.
    4. 열린 O-링 스페이서의 양쪽에 실리콘 프리 그리스 레이어를 추가합니다. 증착 부위에 두어 두어 두어 두어 두어 두어 두는다. 스페이서 의 상단에 두 번째 ITO 유리 판의 도전성 면을 놓습니다.
    5. 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 3 시간 동안 진공 아래에 전기 형성 챔버를 놓습니다.
  3. 전기 형성 절차
    1. 전선을 발전기에 연결합니다.
    2. 생성기의 다음 설정을 사용합니다.
      대체 정현파 장력
      주파수: 10 Hz
      진폭: 2V피크-피크
      참고: 각 시스템에 대해 최적의 전압 주파수와 지속 시간을 찾아야 합니다.
    3. 챔버에 용액을 주입하기 전에 전압이 가해지도록 하십시오.
    4. 챔버를 채우기 위해 0.8 mm 내경 바늘이있는 주사기를 사용하여 용액 1 mL을 주입하십시오. 최종 거품을 제거합니다.
    5. 챔버를 75분 동안 인가된 전압/주파수 아래에 놓습니다(그림4B).
  4. 굽스 수확
    1. 발전기를 끕지.
    2. 0.8 mm 내경 바늘로 1 mL 주사기를 사용하여 챔버 내부에 기포를 생성하기 위해 용액의 작은 부분을 빨아. 이 거품이 챔버 내부로 이동하기 위해 챔버를 약간 기울입니다. 이렇게 하면 GUV가 ITO 표면에서 분리하는 데 도움이 될 수있습니다(그림4C).
    3. 모든 용액을 빨아 1mL 플라스틱 튜브로 옮김하십시오.
    4. 와이어를 제거하고 유기 용매 (톨루엔 다음 클로로포름)로 ITO 슬라이드를 청소하십시오.

4. 마이크로 조작 설정

참고 : 마이크로 파이펫 포부의 원리는 우울증을 적용하여 유리 마이크로 파이펫을 통해 단일 소포를 빨아하는 것입니다. 파이펫 내부의 혀 길이는 흡입 압력의 함수로 측정됩니다. 앞서 설명한 BSA의 피펫 코팅은 소포 막과 파이펫 사이의 접착을 방지하거나 최소화하는 데 필수적입니다.

프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다.

  1. 파이펫 및 물 충전 저수지 연결
    참고 : 물 채워진 탱크와 마이크로 미터는 슬라이딩 플레이트에 고정되어 있습니다. 마이크로미터 헤드가 있는 디지털 카운터는 0~2.5cm 범위의 장치의 수직 변위를 허용하고 알루미늄 광학 레일을 따라 1μm의 정확도를 제공합니다. 실리콘 튜브는 저수지와 모세관 홀더를 연결합니다(그림5A).
    1. 탱크에 순수한 물을 채웁니다. 일회용 5mL 주사기를 실리콘 튜브를 통해 모세관 금속 홀더에 연결하고 흡인하여 탱크에서 홀더로의 물 흐름을 만듭니다.
    2. 튜브를 약간 터치하여 기포를 제거합니다. 동시에 물 탱크를 올려 양압을 만듭니다. 5mL 주사기는 여전히 홀더에 부착되어 있습니다.
    3. 앞서 설명한 코팅 및 세척 단계(2단계 참조)를 마친 후, 모세관을 포도당 용액으로 채우고, 마지막에 방울이 형성될 때까지 채웁니다. 금속 홀더에서 주사기 튜브를 제거하여 끝에 약간의 물 흐름을 만듭니다.
    4. 모세관을 거꾸로 뒤집고 홀더의 물 흐름과 포도당 강하를 연결합니다. 모세관과 홀더를 함께 나사로 고정시고 고정합니다.
  2. 파이펫 배치
    참고 : 이 작업 동안 물 탱크는 여전히 양압을 유지하기 위해 알루미늄 레일에 배치됩니다.
    1. 두 개의 유리 슬라이드 (이전에 에탄올로 청소)가 장착 된 수제 알루미늄 무대를 가지고 양쪽에 진공 그리스로 접착제. 현미경 단계에 설치하고 도 5B,C에도시된 바와 같이 0.1 M의 포도당을 함유하는 1 mL 주사기를 사용하여 두 슬라이드 사이에 반월상 연골을 형성한다.
    2. 파이펫과 홀더를 마이크로 매니더의 모터 유닛에 놓고 클램핑 노브를 조입니다.
    3. 거친 모드에서 제어판 조이스틱을 사용하여 포도당 반월 상 연골 근처의 마이크로 파이펫을 낮춥시됩니다. 미세 모드를 사용하여 팁의 위치를 반월 상 연골의 중심으로 조정합니다.
    4. 포도당에 침지된 팁을 몇 분 간 유지하여 외부 및 내부 표면을 청소합니다(양압이 유지됨에 따라 물의 흐름이 피펫의 내부 표면을 헹구어 코팅되지 않은 BSA를 제거합니다).
    5. 마이크로 매니더키보드에 팁의 위치를 저장하고 반월 상 연골에서 철회.
    6. 포도당 반월 상 연골을 제거하고 신선한 것으로 대체하십시오. 20 μL 마이크로파이펫을 사용하여 0.1 M 자당에서 GUV 2 μL을 빨아 신선한 포도당 반월 상 연골에 넣습니다. DIC 모드 (차동 간섭 대비)에서 자당 (주로 GUV 내부)과 포도당 (주로 GUV 외부)의 밀도 차이로 인해 하단에위치한 GUV를 관찰하십시오.
    7. 소포가 약간 수축되면 흡입 파이펫을 다시 삽입하고 팁에 초점을 맞춥니다. 압력이 거의 0인 물 탱크의 높이 H0을 설정합니다. 이를 위해 용액에 자연적으로 존재하는 작은 소포 또는 입자를 활용하고 이러한 입자의 움직임이 멈출 때까지 물 탱크 높이를 조정하십시오.
    8. 이 시점에서 반월 상 연골을 미네랄 오일로 둘러싸서 물 증발을 방지하고 그림 5D를참조하십시오.
      참고: 에어컨을 사용하여 실온을 20-22°C 사이에서 조절해야 합니다.
  3. 마이크로파이펫 흡인 실험
    1. 파이펫 팁(직경 6-12 μm)을 낮추고 작은 흡입(-1cm)을 만들어 소포(직경 15-30 μm)를 흡인합니다. 선택한 소포의 멤브레인은 약간 변동되어야하며 눈에 보이는 결함 (싹이나 필라멘트가 없음)을 제시해서는 안됩니다(그림 6).
    2. 마이크로 조작기를 사용하여 다른 소포에서 흡인 된 소포를 분리하고 전체 실험 중에이 위치를 유지하기 위해 더 높은 수준으로 파이펫을 올립니다.
    3. 물을 채워진 탱크를 약 -10cm로 낮추어 소포를 미리 응력한 다음 압력을 줄여 초기 값(-1cm)으로 되돌릴 수 있습니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 막에서 막 과잉 및 작은 결함을 제거하십시오.
    4. 물 탱크의 위치에 의해 정의 된 -0.5 cm의 높이에서, 천천히 멤브레인이 변동하는 정권에 도달하기 위해 마이크로 미터와 흡입 압력을 감소. 그런 다음 상당한 투영 길이 (몇 미크론)로 팁의 혀를 명확하게 시각화하는 압력을 증가시다.
      참고: 가장 작은 멤브레인 프로젝션 길이(L0)를빨아 낼 수 있는 가장 낮은 인가 압력(P0)은 기준점 α0(도 7A)을정의합니다. 곡선의 모든 점은 이 기준에 따라 측정됩니다(ΔL = L-L0 및 ΔP = P-P0).
    5. 0.5 -0.8 mN/m에 도달할 때까지 마이크로미터로 흡입 압력을 단계적으로 증가시다. 각 단계에서 5s를 기다렸다가 혀의 스냅 샷을 찍습니다. 낮은 장력에서이 절차는 굽힘 계수의 결정을 가능하게한다.
    6. 레일에 채워진 물의 높이를 조정하여 0.5 mN/m에서 파열 장력까지 흡입 압력을 계속 증가시키십시오(-2에서 -50cm까지)(그림 7B-D). 높은 장력 정권에서이 실험에서, 영역 압축성 계수, 용해 긴장 및 용해 변형이 측정됩니다.
    7. 중요한 통계를 얻기 위해 약 15-20 개의 소포를 늘입니다. 각 마이크로파이펫 흡인 실험은 7~10분 정도 소요됩니다. 혀의 투영 길이, 소포의 직경 및 모세관의 반경을 측정하기 위한 LASAF 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다.
  4. 벤딩 계수, 면적 압축성 계수, 용해 장력 및 용해 변형 측정
    1. 이러한 매개 변수에 액세스하려면 E. Evans12가정한 형식주의를 사용하십시오. 방정식 1에서 멤브레인 위에 가해지는 흡입 압력을 계산합니다.
      Δ P =θ wg (h−h0) (1)
      여기서 g는 중력 가속도(9.8m∙s-2)이고,θw는 물의 밀도(θ = 1 g∙cm-3),h는물탱크의 위치이고h0은 압력이 0과 같은 초기 위치이다.
    2. Laplace 방정식에서 멤브레인 장력을 계산합니다.
      Equation 1(2)
      ΔP는 마이크로파이펫에 대한 흡입 압력, Rp 및 Rv는 각각 마이크로파이펫 및 소포 반경(마이크로파이펫 외부)이다. 멤브레인의 표면적 변형률(α)은 다음과 같이 정의됩니다.
      Equation 2(3)
      Equation 3낮은 흡입 압력에서 소포의 막 영역이되는.
    3. 방정식 412에따라 모세관 팁 내부의 소포의 투영 길이 ΔL 증가에서 α를 계산합니다.
      Equation 4(4)
    4. 매우 낮은 장력 체제하에서, 열 굽힘 기복의 평활화는 명백한 확장을 지배한다. 플롯 ln(σ) α. 낮은 σ 값 (일반적으로 0.001-0.5 mN.m-13)에서,이것은 그 경사가 굽힘 계수, Kb (방정식 5의 첫 번째 용어)에 연결되는 직선을 제공합니다14:
      Equation 5(5)
      참고: 높은 장력(> 0.5mN.m-1)에서는분자 간의 간격이 증가하여 멤브레인 기복이 완전히 억제되고 멤브레인 영역이 증가합니다. 이 정권에서, 수학식 5의 두 번째 용어는 영역 압축성 계수 Ka (그림 8그림 9)에대한 액세스를 지배하고 제공합니다.

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Representative Results

앞서 언급한 프로토콜을 통해 우리는 인지질에서 얻은 다른 합성 거대 단일 라멜라 소포 (GUV)를 연구했습니다 : 2-oleoyl-1-팔미토일 -sn-glycero-3-phophocholine (POPC), 삼중합체: 폴리 (에틸렌 옥사이드)-b-Poly (디메틸실록산)-b-폴리(에틸렌옥사이드) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)이전 연구에서 합성된13,및 디블록 공중합체 폴리(디메틸실록산)-b-폴리( 에틸렌옥사이드) (PDMS27-b-PEO17). 인지질 POPC를 가진 삼중블록 공중합체 PEO8-b-PDMS22-b-PEO8의 협회가 생성된 GHUV(Giant hybrid Unilamellar Vesicles)의 막 인성의 큰 감소로 이어진다는 것을 우리 그룹에 의해 이전에 나타났다(Giant Hybrid Unilamellar Vesicles)15. 측정은 본 연구를 위해 반복되고 이 디블록 공중합체 및 POPC의 협회로부터 얻어진 디블록 공중합체 및 GHUV로부터 얻어진 GUV로 확장되었다.

결과는 그림 10표 1에나와 있습니다. POPC에 대한 영역 압축성 계수 및 용해 균주는 문헌16과완벽하게 일치합니다. 하이브리드 소포의 굽힘 계수의 측정은 아직 실험실에서 수행되지 않았습니다. 일반적인 값은 수득된 중합체에 대해 주어집니다. 디블록 공중합체로부터 얻어진 멤브레인(Ec)의인성은 삼중합체로 얻은 것 이상이라는 것을 언급할 가치가 있다. 더 흥미롭게도, 디블록 공중합체를 사용하면 이러한 협회의 주요 관심사인 리포좀보다 더 높은 인성을 나타내는 거대한 하이브리드 unilamellar 지질 /폴리머 소포를 얻을 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 파이펫 팁을 연마하기 위한 마이크로 포지. 그림은 장치의 상이한 부분을 나타낸다: 금속 파이펫홀더(a),유리 모세관(b), 마이크로조작기 히터존(c),광원(d), 10x, 32x, 40x 목표(e), 및 현미경경구(f). 인서트에서 유리 비드에 침지된 파이펫 팁은 레티클이 있는 32x 객관을 통해 관찰됩니다. 팁에 용융 된 유리의 수준은 냉각 후 중간 높이 (H)로 고정되었습니다. 팁을 멀리 당기면 날카로운 휴식이 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 피펫 코팅 및 충전 팁에 대한 실험 설정. (A)500 μL 유리 주사기는 유연한 실리카 모세관을 장착하여 마이크로파이펫을 포도당 용액으로 채웁니다. (B)모세관 하부의 배율. 하룻밤 침수 하는 동안, BSA 솔루션 수준 상승 모 세관 동작에 의해 최대 1 cm 길이. 파이펫은 다음 비접촉 BSA를 제거하기 위해 유연한 모세관을 삽입하여 포도당으로 채워진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: ITO 기반 전기 형성 장치를 구축하는 재료. 이 장치는 인듐 주석 산화물(a)로한쪽에 코팅 된 두 개의 유리 슬라이드로 구성됩니다. 고무 O-링은 챔버 내부의 용액을 적재하고 GUV 서스펜션(b)의수확을 허용하기 위해 한쪽에 절단되었습니다. 고무 O-링은 두 개의 슬라이드를 분리하는 스페이서로 사용됩니다. 슬라이드는 전선(c)을통해 전압 발생기에 연결되고 접착제 테이프(d)에의해 표면에 부착됩니다. 실리콘 프리 그리스는 슬라이드(e)로스페이서를 밀봉하는 데 사용됩니다. 옴미터는 ITO 코팅 면을 식별하고 전도도(f)를 확인하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 전기 형성 설정. (a)양서류 용액은 유리 판의 ITO 코팅 면에 유리 모세관을 사용하여 증착된다. (B)조립 및 건조 단계 후, 챔버는 전압 발생기(10 Hz, 2V)에 연결되고 자당 용액으로 채워진다. (C)전기 형성 후, 공기 기포는 GUV가 표면에서 분리하는 데 도움이 챔버 내부에 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 마이크로파이펫 흡인 설정. (a)성분 설명: 형광 현미경 (1), 알루미늄 광학 레일 (2), 실리콘 튜브에서 마이크로 파이펫 (3), 마이크로 조작기 제어판 (4), X, Y 및 Z 변위 (5), 진동 격리 테이블 (6)을 허용하는 마이크로 조작기의 모터 유닛에 대한 물 충전 탱크 및 마이크로 미터 슬라이딩. (B)마이크로조작기의 모터 유닛에 장착된 2개의 유리 슬라이드(7), 피펫(8) 및 피펫 홀더(9)를 장착한 홈메이드 알루미늄 스테이지를 보여주는 배율 및 클램핑 노브(10)에 의해 고정된다. 피펫 팁은 포도당 반월 상 연골의 중심에침지된다 . (C) 유리 슬라이드는 포도당 반월 상 연골의 형성을 허용 양쪽에 진공 그리스로 접착 (측면보기). (D)미네랄 오일로 둘러싸인 포도당 반월 상 연골은 물 증발을 방지하기 위해 (상단보기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 마이크로파이펫 흡인을 이용한 장력 하에서 GUV의 이미지. 로다민 태그 지질 및 전송 채널(DIC)으로부터 형광을 수집하는 적색 채널이 병합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 다른 흡입 압력에서 GUV의 이미지. (a)혀 형성을 유도하는 가장 낮은 적용 장력은 초기 혀 길이(L0) 및 소포 반경(Rv)을결정하는 기준으로 사용된다. (B)중간 적용 된 장력 값 관련 혀 길이 (L). (C)매우 높은 인가 장력. (D)피펫 반경이 측정되는 멤브레인 파열 직후의 이미지(Rp). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 마이크로파이펫 흡인에 의해 얻어진 GUV의 대표적인 응력-스트레인 플롯. 동일한 데이터 세트가 ln(σ) = f(α) 및 σ= f(α)를 플롯하는 데 사용되었다. 낮은 장력 정권에서, ln(σ)은 α(녹색 선형 맞춤)로 선형으로 변화하며 굽힘 계수(Kc)에대한 액세스를 제공합니다. 높은 장력 정권에서 σ는 α(적색 선형 맞춤)로 선형으로 변화하고 영역 압축성 계수(Ka)에대한 액세스를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
도 9: 스트레칭 정권에서 마이크로파이펫 흡인에 의해 얻어진 GUV의 대표적인 응력-스트레인 플롯. 실험 곡선으로부터 ROV의 여러 기계적 파라미터가 결정될 수 있다. 면적 압축성 계수(Ka)는초기 경사에 해당하며 곡선을 선형으로 피팅하여 측정됩니다. 마지막 측정점은 Lysis 변형률(αL)과Lysis 응력(σL)값을 제공합니다. 마지막으로, 응집밀도에너지(Ec)는곡선 아래의 영역(주황색 영역)을 통합하여 추정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10: 리포좀, 폴리머체 및 하이브리드 폴리머/지질 소포에 대해 얻어진 대표적인 응력-스트레인 플롯. POPC(적색 삼각형), 삼중블록 공중합체(녹색 원), 디블록 공중합체(파란색 사각형), 삼중블록 기반 하이브리드(연한 녹색 원) 및 디블록 기반 하이브리드(연한 파란색 사각형)로 구성된 GUV. 곡선은 각 시스템에 대해 최소 15개의 GUV에 대한 측정값을 평균화하여 얻어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

αL σL Ec Kb
(mN.m-1) (%) (mN.m-1) (mN.m-1) (kT)
팝 (주) 194 ± 15 4 ± 1 8 ± 2 0.17 ± 0.09 21.1±0.4
PDMS27-b-PEO17 121 ± 8 16 ± 4 15 ± 3 1.37 ± 0.67 10.6 ± 3.5
PDMS27-b-PEO17 132 ± 13 9 ± 4 10 ± 3 0.50 ± 0.38 -
+ 5 wt.% POPC
PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 84 ± 13 7 ± 1 6 ± 2 0.50 ± 0.38 -
PEO12-b-PDMS43-b-PEO12 91 ± 11 3 ± 1 2 ± 1 0.03 ± 0.01 -
+ 5 wt.% POPC

표 1: 인지질, 공중합체 또는 둘 다로 구성된 GUV에서 마이크로파이펫 흡인 기술을 사용하여 결정된 기계적 파라미터.

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Discussion

마이크로파이펫 코팅은 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위한 핵심 포인트 중 하나입니다. 마이크로파이펫에 소포의 부착을 방지해야 하며, 코팅은 BSA, β-카제인 또는 서파실과 함께 문헌17,18,19,20,21에서일반적으로 사용된다. 코팅 절차의 세부 사항은 거의 언급되지 않습니다.

BSA의 용해는 좋은 용해화를 달성하기 위해 교반 하에서 적어도 4 시간 동안 수행되어야한다. 그럼에도 불구하고, 여과 단계는 여전히 마이크로파이펫 팁을 방해할 수 있는 임의의 응집체를 제거하기 위해 요구된다. BSA가 잘 용해되지 않은 경우, 그것의 대부분은 여과에 의해 제거되며, 코팅은 효과가없을 것입니다. 이상적인 농도 및 용해 시간은 각각 0.8-1 wt. % 및 4 시간입니다.

또 다른 중요한 점은 측정 중에 소포 내부와 외부의 일정한 삼투압을 보장하는 것입니다. 실험 동안 수분 증발로 인한 포도당 농도의 증가는 소포의 디플레이션을 유발하고 측정을 교란시킬 수있다(Ka,등). 이러한 현상을 방지하기 위해 오일 층의 증착은 필수적입니다(그림3D). 오일 층의 효율을 확인하기 위해 몇 mN∙m-1의 일정한 흡인 압력이 5 분 동안 소포에 적용 될 수 있으며 모세관 내부의 혀 길이 L은 일정해야합니다.

마지막 임계점은 문헌20에서거의 언급되지 않는 사전 응력 단계(섹션 3.3)입니다. 이 단계는 꽃 봉기, 튜브 및 소포의 과잉 표면적을 제거하고 소포에서 다른 소포로 재현 가능한 결과를 얻는 데 필요합니다.

마이크로파이펫 흡인 방법은 유체 멤브레인(예: 지질의 T전기형성 >Tm)을 제시하고 100kT 이하의 굽힘 계수를 보유하는 한 모든 GUV에 적용할 수 있습니다. 두껍고 점성이 있는 멤브레인의 경우, 유체 상태에서도, 2개의 피펫을 사용하여계수(22)를측정할 수 있다. 마이크로파이펫 흡인 기술은 여러 파라미터(굽힘 및 면적 압축성 모듈리)에 대한 액세스를 제공하는 데 큰 이점을 제공하며, 이는 GUV 멤브레인의 영역 압축성 계수에 직접 접근할 수 있는 유일한 기술입니다.

이 기술은 오랫동안 잘 알려져 있지만 여전히 수많은 과학 공동체 (생물 물리학자, 물리 화학자, 화학자 등)에 의해 일반적으로 사용됩니다. 마이크로파이펫 흡인 방법은 특히 고급 합성 세포(예: 하이브리드 폴리머/지질 소포 및 프로토셀)의 추가 막 특성을 조사하기 위해 미래에 중요한 기술이 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 감사하게 금융 지원 (ANR Sysa)에 대한 ANR을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4 external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed Sutter Instrument Co. FB255B 2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Microforge NARISHGE Co. MF-900 fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) Sigma-Aldrich 10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip Codan 626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip Codan 62.5607
Disposable acetate cellulose filter Cluzeau Info Labo L5003SPA Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing Polymicro Technologies. TSP530660 Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose Sigma-Aldrich G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT Hamilton Syringe Company 1750
Test tube rotatory mixer Labinco 28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series Newport
Damped Optical Table Newport used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP 2 The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer Mitutoyo Corporation 350-354-10 Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml) Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Sigma-Aldrich
Chloroform VWR 22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) Sigma-Aldrich 810146C Rhodamine tagged lipid
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps Hirschmann 9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip Codan 62.1612
H Grease Apiezon Apiezon H Grease Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides Sigma-Aldrich 703184
Needle Terumo AN2138R1 0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter) Voltcraft VC140
Toluene VWR 28676.297
Voltage generator Keysight 33210A

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References

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화학 문제 155 거대한 unilamellar 소포 마이크로 파이펫 공중 합체 지질 하이브리드 폴리머 / 지질 소포 막 특성 영역 압축성 계수 굴곡 계수 전기 형성 이중층
마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention
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Ibarboure, E., Fauquignon, M., LeMore

Ibarboure, E., Fauquignon, M., Le Meins, J. F. Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration. J. Vis. Exp. (155), e60199, doi:10.3791/60199 (2020).

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