Summary
يصف هذا التقرير أسلوبا قائما علي الرقاقات الصغيرة لاعداد تجربه ثقافة خليه واحده يمكن فيها تحقيق الاقتران العالي الكفاءة والتحليل المجهري للخلايا المفردة المتعددة.
Abstract
وقد استخدمت اختبارات الثقافة المشتركة للخلايا علي نطاق واسع لدراسة تفاعلات خلايا الخلايا بين أنواع الخلايا المختلفة لفهم بيولوجيا الامراض بما في ذلك السرطان بشكل أفضل. ومع ذلك ، فانه من الصعب توضيح اليه المعقدة للتفاعلات بين الخلايا في سكان الخلايا غير المتجانسة بشكل كبير باستخدام نظم الثقافة المشتركة التقليدية لان عدم تجانس الخلايا الفرعية تحجبه القيم المتوسطة ؛ يمكن استخدام أنظمه الثقافة المشتركة التقليدية فقط لوصف اشاره السكان ، ولكنها غير قادره علي تتبع سلوك الخلايا الفردية. وعلاوة علي ذلك ، فان الأساليب التجريبية أحاديه الخلية التقليدية لها كفاءه منخفضه في التلاعب بالخلايا بسبب توزيع بواسون. الاجهزه المجهرية هي التكنولوجيا الناشئة للدراسات خليه واحده لأنها يمكن التلاعب بدقه خلايا واحده في الانتاجيه العالية ويمكن ان تقلل من استهلاك العينات والكاشف. هنا ، ونحن وصف مفهوم وتطبيق رقاقه ميكروفلويدريك لمتعددة خليه واحده الثقافات المشتركة. رقاقه يمكن التقاط بكفاءة أنواع متعددة من خلايا واحده في غرفه الثقافة (~ 46 ٪) ولديها مساحة ثقافيه كافيه مفيده لدراسة سلوك الخلايا (علي سبيل المثال ، الهجرة ، والانتشار ، وما إلى ذلك) تحت التفاعل خليه خليه علي مستوي خليه واحده. تم استخدام خلايا البطانة اللمفاوية وسرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم لاجراء تجربه الثقافة المشتركة أحاديه الخلية علي منصة ميكروفلويديك لدراسات تفاعليه متعددة الخلايا الحية.
Introduction
وهناك حاجه للتقاط الكفاءة للأنواع المختلفة من الخلايا المفردة وتوفير مساحة ثقافيه كافيه لتجارب الاستزراع المشترك للخلايا الواحدة لأنواع متعددة من الخلايا المفردة1. الحد من التخفيف هو الأسلوب الأكثر استخداما لاعداد الخلايا المفردة لمثل هذه التجارب ، وذلك بسبب انخفاض تكلفه المعدات المطلوبة. ومع ذلك ، نظرا لمحدوديه توزيع بواسون ، فان الحد الأقصى لاحتمال اكتساب الخلايا المفردة هو فقط 37% ، مما يجعل العملية التجريبية شاقه وتستغرق وقتا طويلا2. في المقابل ، يمكن استخدام الفرز الخلية المنشطة مضان (FACS) التغلب علي الحد من التوزيع Poisson لاعداد عاليه كفاءه خلايا واحده3. ومع ذلك ، فقد لا يمكن لبعض المختبرات الوصول اليها بسبب تكلفه الاجهزه المكلفة وتكاليف الصيانة. تم تطوير الاجهزه المجهرية مؤخرا لتراكب الخلية الواحدة4، واقتران الخلية المفردة5، وتطبيقات ثقافة الخلية المفردة. هذه الاجهزه هي مفيده استنادا إلى قدرتها علي التلاعب بدقه خلايا واحده6، وأداء التجارب عاليه الانتاجيه ، أو تقليل العينة والاستهلاك كاشف. ومع ذلك ، فان اجراء تجارب الثقافة المشتركة أحاديه الخلية مع أنواع الخلايا المتعددة مع الاجهزه ميكروفلويديك الحالية لا تزال صعبه بسبب الحد من poisson توزيع1،7،8، أو عدم قدره الاجهزه للتقاط أكثر من نوعين من خلايا واحده4،5،6،9،10.
فعلي سبيل المثال ، ابلغ يون وآخرون عن جهاز ميكروفلوريك لدراسة التفاعل بين الخلايا الخلوية11. يستخدم هذا الجهاز أسلوب احتماليه لاقران الخلايا في غرفه واحده. ومع ذلك ، فانه يمكن فقط تحقيق الاقتران بين نوعين مختلفين من الخلايا بسبب القيود الهندسية في بنيه الجهاز. واظهر تقرير آخر من لي وآخرون طريقه قطعيه للتقاط واقران الخلايا المفردة12. يزيد هذا الجهاز من كفاءه الاقران بواسطة الطريقة القطعية ولكنه محدود بوقت التشغيل المطول المطلوب لاقران الخلايا. وعلي وجه التحديد ، يمكن اجراء عمليه التقاط الخلية الثانية فقط بعد إرفاق الخلية الملتقطة الاولي بالسطح بعد 24 ساعة. وابلغ جاو وآخرون عن وجود جهاز ميكروفلويدريك يستند إلى القطرات للتقاط نوعين من الخلية الواحدة13. يمكننا العثور علي ان الجهاز ميكروفلويديك القائم علي الحبريه لا يزال يقتصر علي توزيع poisson ويمكن استخدامها فقط علي الخلايا غير المرفقة ، وانه ليس من الممكن لتغيير الحل الثقافة اثناء عمليه الزراعة.
في السابق ، قمنا بتطوير "رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية" التي تستخدم قوي هيدروديناميكية حتمية للتقاط أنواع متعددة من خليه واحده في غرفه الثقافة ويمكن ان تؤدي في وقت لاحق تجربه الخلية المشتركة في الثقافة لتحليل سلوك ترحيل الخلية الفردية ضمن تفاعلات خليه الخلية14. وتتالف رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية من مجموعات من الوحدات التي تحتوي كل منها علي قناه ملتوية بتمريره ، وموقع للتقاط الصور ، وغرفه للثقافة. باستخدام الفرق في مقاومه التدفق بين القناة التي يمر بها اعوج وغرفه الثقافة ، وإجراءات التشغيل المصممة خصيصا ، يمكن التقاط أنواع مختلفه من الخلايا المفردة بشكل متكرر في غرفه الثقافة. ومن الجدير بالملاحظة ان المساحة الوافرة للغرفة الثقافية لا يمكن ان تمنع الخلية من ان يتم مسحها اثناء التقاط الخلايا فحسب ، بل توفر أيضا مساحة كافيه للخلايا للانتشار والتكاثر والهجرة ، مما يسمح بمراقبه التفاعلات الحية أحاديه الخلية. في هذه المقالة ، ونحن نركز علي إنتاج هذا الجهاز وخطوات بروتوكول مفصله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع قالب رقاقه عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة
ملاحظه: تتوفر بيانات نمط القناع في المنشور السابق14.
- ديهيدرات رقاقه السيليكون 4 بوصه في فرن 120 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
- تدور معطف 4 ز من سو-8 2 الصور السلبية مقاومه علي رقاقه السيليكون 4 بوصه في 1,000 rpm لمده 30 ثانيه لإنشاء طبقه سميكه 5 μm (طبقه #1).
- لينه خبز طبقه #1 علي 65 درجه مئوية موقد لمده 1 دقيقه ومن ثم نقل طبقه #1 إلى 95 درجه مئوية موقد لمده 3 دقائق.
- طبقه بارده #1 إلى درجه حرارة الغرفة ، وضعه علي حامل القناع التلقائي النصف الألى ، ومحاذاة مع طبقه #1 الكروم مطلي ضوئي (طبقه موقع التقاط).
- فضح طبقه #1 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 150 mJ/سم2.
- أزاله طبقه #1 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد ل 1 دقيقه. نقل طبقه #1 إلى 95 درجه مئوية موقد لمده دقيقه واحده.
- طبقه بارده #1 درجه حرارة الغرفة. تزج في محلول خلات الأثير البروبيلين غليكول مونوايثيل لغسل بعيدا الضوئية غير المرتبطة لمده 2 دقيقه. تجف برفق مع غاز النيتروجين للكشف عن طبقه #1 محاذاة علامة.
- تغطيه طبقه #1 محاذاة علامة بواسطة شريط لاصق ، وتدور معطف 4 ز من 8 10 الصور السلبية المقاومة للضوء علي طبقه #1 في 1,230 دوره في الدقيقة ل 30 ثانيه لإنشاء طبقه سميكه 25 μm #2.
- أزاله الشريط ، طبقه خبز لينه #2 علي اللوحة الساخنة 65 درجه مئوية لمده 3 دقائق ، ومن ثم نقل طبقه #2 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 7 دقائق.
- طبقه بارده #2 درجه حرارة الغرفة ، وضع طبقه #2 علي حامل القناع شبه التلقائي ، ومحاذاة طبقه #2 الكروم مطلي ضوئي (تجاوز طبقه القناة) إلى طبقه #1 محاذاة العلامة.
- فضح طبقه #2 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 200 mJ/سم2.
- أزاله طبقه #2 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد لمده دقيقه واحده ونقل طبقه #2 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
- طبقه بارده #2 درجه حرارة الغرفة ، وتغطيه طبقه #1 محاذاة علامة بواسطة شريط لاصق. تدور معطف 4 ز من 8 2050 الصور السلبية المقاومة للضوء علي طبقه #2 في 1,630 دوره في الدقيقة لمده 30 ثانيه لخلق طبقه سميكه 100 μm #3.
- أزاله الشريط ، طبقه خبز لينه #3 علي اللوحة الساخنة 65 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ومن ثم نقل طبقه #3 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
- طبقه بارده #3 درجه حرارة الغرفة ، وضع طبقه #3 علي حامل القناع شبه التلقائي ، ومحاذاة طبقه #3 الكروم مطلي ضوئي (طبقه غرفه الثقافة) إلى طبقه #1 محاذاة العلامة.
- فضح طبقه #3 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 240 mJ/سم2.
- أزاله طبقه #3 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد لمده 5 دقائق. نقل طبقه #3 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
- طبقه بارده #3 درجه حرارة الغرفة. تزج في محلول خلات الأثير البروبيلين غليكول مونوايثيل لغسلها بعيدا الضوئية غير المرتبطة لمده 10 دقيقه ، وتجف برفق مع غاز النيتروجين.
2. PDMS اعداد الجهاز للتقاط خليه واحده متعددة
- وضع العفن رقاقه والصحن وزنها تحتوي علي 100 μL من ثلاثي كلورو سيليكات في المجفف (فقط للسلنه) وتطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 15 دقيقه.
ملاحظه: Silanize سطح رقاقه مع ثلاثي كلورو سيليكات لخلق خصائص سطح مسعور قبل PDMS castingso انه يمكن بسهوله ان مقشر قباله العفن PDMS رقاقه. - وقف الفراغ ، ومن ثم silanize العفن رقاقه في المجفف (فقط للسينه) في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
- مزيج PDMS قاعده وعامل معالجه PDMS في نسبه 10:1. صب ما مجموعه 20 غرام من PDMS مختلطة علي قالب رقاقه في صحن 15 سم.
- وضع الطبق 15 سم في المجفف وتطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 1.5 دقيقه. ثم قم بازاله الطبق الذي طوله 15 سم من المجفف. يحفظ لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. وأخيرا ، أزاله فقاعات الهواء المتبقية في PDMS مع غاز النيتروجين.
- وضع الطبق 15 سم في فرن في 65 درجه مئوية ل 2-4 h لعلاج PDMS.
- أزاله النسخة المتماثلة PDMS من العفن رقاقه ، ومن ثم لكمه مدخل مم 1.5 ومنفذ 0.5 مم علي PDMS باستخدام 1.5 مم القطر الداخلي والداخلي القطر 0.5 مم (الشكل 1ج).
- تنظيف النسخة المتماثلة PDMS وسطح الشريحة مع الشريط القابل للازاله ومن ثم علاج السطح مع البلازما الأكسجين (100 W ل 14 s).
- محاذاة النسخ المتماثلة PDMS يدويا مع الشريحة وجعلها في اتصال مع بعضها البعض.
- ضع الشريحة PDMS في فرن 65 درجه مئوية لمده يوم واحد.
ملاحظه: يتم تحقيق الترابط الدائم بين الشريحة والنسخة المتماثلة PDMS لتشكيل الجهاز. - تزج الجهاز PDMS في وعاء مملوء بالفوسفات المالحة مخزنه ووضعها في المجفف. ثم تطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 15 دقيقه لأزاله فقاعات الهواء.
- وضع الجهاز PDMS في الخلية الثقافة هود وتعقيم الجهاز مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية (الطول الموجي الخفيفة: 254 nm) لمده 30 دقيقه.
- استبدال المخزن المؤقت للجهاز PDMS مع متوسطه (DMEM-F12 القاعدية التي تحتوي علي 1 ٪ المضادات الحيوية و 10 ٪ الجنين البقري المصل) واحتضان الجهاز PDMS في 4 درجه مئوية لمده 1 يوم. وهذا يمنع الخلايا من الانضمام إلى سطح PDMS.
3-اعداد تعليق الخلية الواحدة
ملاحظه: أنواع الخلايا تشمل الخلايا اللمفاوية الليمفاوية البشرية (LECs) ، الإنسان OSCC TW 2.6 الخلايا التعبير عن WNT5B الخاصة شرانا (WNT5B sh4) ومكافحه ناقلات (pLKO-GFP) التي تم الحصول عليها من دراستنا السابقة15. يرجى الرجوع إلى المنشور السابق للحصول علي خطوات مفصله للزراعة.
- قم بازاله الوسط الثقافي عندما تحقق الخلايا التقاء 70-80%. ثم يغسل برفق الخلايا مع 5 مل من المعقمة تلفزيوني ثلاث مرات.
- أضف 1 مل من المتوسطة التي تحتوي علي صبغه فلورسنت 1 μM إلى WNT5B sh4 وخلايا pLKO-GFP (استخدم MV2 المتوسطة ل LECs) ثم احتضان الخلايا لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: كانت ملطخه lecs مع الأخضر تشلوروميثيلفلوريسسين دياسيتات (cmfda) صبغ ، وكانت ملطخه الخلايا WNT5B sh4 مع الأزرق 7-الامينيه-4-كلوموثيلكومارين (cmac) صبغ والخلايا plko-gfp ملطخه الأحمر ديل الفلورسنت صبغ. - يغسل برفق الخلايا مع 5 مل من المعقمة تلفزيوني ثلاث مرات.
- أزاله تلفزيوني وأضافه 2 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا (0.05 ٪ تريبسين-أدتا ل LECs).
- احتضان الخلايا لمده 4 دقائق في درجه حرارة الغرفة ثم اضغط برفق علي طبق ثقافة الانسجه لتعزيز انفصال الخلايا.
- أضافه 4 مل من DMEM-F12 المتوسطة لتفريق WNT5B sh4 و pLKO-GFP الخلايا (ل LECs استخدام 3 مل من MV2 المتوسطة و 1 مل من الحل المحايد التريبسين). ثم نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل ، وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق.
- أزاله supernatant ، وأعاده التعليق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة DMEM-F12 بلطف. عد عدد الخلايا الحية في مقياس الكريات الدموية باستخدام طريقه الاستبعاد الأزرق القياسية تريبان16. اعداد 1 مل من تعليق الخلية في 3 × 105 خلايا/مل تركيز في dmem-F12 المتوسطة ، ومن ثم الحفاظ علي الخلايا علي الجليد لمنع تراكم الخلايا.
ملاحظه: من أجل تحسين كفاءه التقاط أحاديه الخلية ، يلزم اعداد دقيق لتعليق الخلية الواحدة مع فصلها جيدا.
4. متعددة خليه واحده التقاط والثلاثي ثقافة خليه واحده
- توصيل أنبوب بولي-تيترافلوروثيني (PTFE) بين مخرج الجهاز ومضخة حقنه. أزاله المتوسطة وأضافه 1 μL من تعليق الخلية في تركيز 3 × 105 خلايا/مل في مدخل الجهاز pdms.
- تحميل تعليق الخلية في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق 0.3 μL/min (الشكل 2ا). تدفق الاتجاه هو من مدخل إلى منفذ.
ملاحظه: تحميل مباشره بعد أضافه تعليق الخلية في مدخل لمنع ترسب الخلايا. - أضافه 1 μL من DMEM-F12 المتوسطة في مدخل الجهاز PDMS بعد الخطوة 4.2. تحميل المتوسطة DMEM-F12 في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق 0.3 μL/min (الشكل 2ب). تدفق الاتجاه كان يتدفق من مدخل إلى منفذ.
- تحميل 0.3 μL من DMEM-F12 المتوسطة في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق من 10 μL/min (الشكل 2ج). تدفق الاتجاه كان يتدفق من منفذ إلى مدخل.
- كرر الخطوات 4.1 إلى 4.4 لتحميل أنواع الخلايا الأخرى في الجهاز.
- بعد الانتهاء من التقاط الخلية ، استخدم المجهر مع عدسه 4x لصوره كل غرفه الثقافة.
ملاحظه: تم استخدام الانبعاثات الفلورية من الخلايا لتحديد وحساب عدد الخلايا الفردية في كل غرفه الثقافة. - أزاله أنبوب PTFE وختم مدخل ومنفذ مع بولي tape لإنشاء نظام ثقافة مغلقه.
- نقل الجهاز PDMS إلى صحن ثقافة 10 سم وأضافه 10 مل من العقيمة تلفزيوني حول الجهاز PDMS لتجنب تبخر المتوسطة من الجهاز.
- نقل طبق الثقافة إلى حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 و 95 ٪ الرطوبة) للثقافة خليه واحده ثلاثية.
- مجهريا مراقبه وتصوير نمو الخلايا كل 12 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحتوي الجهاز علي بنيه ثلاثية الطبقات كما هو مبين في صوره المقطع العرضي لجهاز PDMS قطع (الشكل 1ا). الطبقة الاولي تحتوي علي موقع التقاط (6.0 μm في العرض و 4.6 μm في الارتفاع) الذي يربط بين غرفه الثقافة والقناة التي يمر بها. يؤدي الاختلاف في مقاومه التدفق بين الغرفة الثقافية والقناة التي تمر بتمريره إلى تدفق الخلايا إلى موضع التقاط وملء مدخل المسار الصغير. بعد التقاط خليه في موقف التقاط ، يتم زيادة مقاومه تدفق المسار الصغير ، مما تسبب في الخلية القادمة المقبلة للذهاب نحو ومن خلال قناه بتمريره إلى المصب التالي التقاط الموقع. يتم استخدام تصميم اعوج من قناه بتمريره (25.0 μm في العرض و 26.4 μm في الارتفاع) من الطبقة الثانية لزيادة مقاومه تدفق. تم تصميم ابعاد غرفه الثقافة في الطبقة الثالثة (500.3 ميكرومتر في القطر و 111.3 μm في الارتفاع) لتوفير مساحة كافيه لتجربه ثقافة الخلية ، والحد من معدل التدفق في الغرفة للحفاظ علي الخلايا من يجري مسح خارج الغرفة.
الاداات اللازمة لاجراء العملية (الشكل 2) شائعه في المختبرات العامة ، بما في ذلك المجهر ، ومضخة المحاقن ، وحقنه زجاجيه ، وأنبوب الطرد المركزي ، والأنابيب ، والماصة. الجهاز هو تقريبا 1/5 من المشبك مع سماكه 2 ملم ومناسبه لمراقبه تحت المجهر مع 4x إلى 20x عدسه. مع هذا الأسلوب ، يمكن التقاط نوع واحد للخلايا المفردة في غرف الثقافة تحت 7 دقائق ، التالي فان الوقت الإجمالي للتشغيل للخلايا المفردة الثلاثية كان اقل من 21 دقيقه. وكانت كفاءه التقاط الخلايا الوحيدة للخلايا الثلاثة الموضحة 70.83% ± 15.42% (LECs) ، 73.96% ± 14.09% (WNT5B sh4) و 78.13% ± 3.13% (pLKO-GFP) ، علي التوالي. وكانت كفاءه التقاط الثلاثي للخلايا المفردة 47.92% ± 7.86% (الشكل 3ب). يتم استخدام الخطوة عمليه الارتداد للإفراج عن الخلايا من مواقع التقاط في وقت واحد وتدفق الخلايا في غرف الثقافة (الشكل 2ج). خلال هذه العملية ، إذا لم يتم تحرير خليه من موقع التقاط الخاص به ، فان الخلية التي تم إطلاقها في موقع التقاط المتلقي للمعلومات لن تدخل الغرفة الثقافية بسبب القناة التي تمر بمقاومه تدفق اقل من الغرفة الثقافية. هذا هو السبب الرئيسي لماذا HSC لديه خليه واحده الثلاثي كفاءه التقاط فقط 47.92 ± 7.86 ٪ ، والتي لا تزال أكبر بكثير من احتمال توزيع Poisson (~ 5 ٪).
أظهرت نتائج ثقافة الخلية انه يمكن اجراء عده ثقافات مشتركه أحاديه الخلية للخلايا الغشائية اللمفاوية والخلايا السرطانية الحرشفية لمده 24 ساعة ، ويمكن ملاحظه انتشار الخلايا والمورفولوجية تحت المجهر (الشكل 4، فيديوهات تكميليه 1-3). في وجود خلايا pLKO-GFP ، وأظهرت خلايا WNT5B sh4 و LECs قدره أفضل التكاثري وأظهرت ان المورفولوجية اقترب lamellipodia. توضح هذه النتائج قدره هذا الجهاز علي التقاط أنواع متعددة من الخلايا المفردة بكفاءة عاليه في غرفه الثقافة وتوفير مساحة ثقافيه كافيه مفيده لدراسة التفاعلات متعددة الخلايا أحاديه النوع.
الشكل 1: صوره ومجهر صور رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية. (ا) صوره المجهر لعرض المقطعية pdms. (ب) وحده لمحاصره خليه واحده من المنظر المكبر. (ج) ظهور الرقاقة التي تحتوي علي 48 وحده. شريط المقياس: 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراءات تشغيل الرقاقات الهيدروليكية الديناميكية. (ا) بسبب المقاومة الهيدروديناميكية العالية للقناه الثانوية ، توجد زنزانة واحده محصورة في موقع التقاط. (ب) بعد ان حوصرت الخلية الاولي ومسدود موقع التقاط ، تتدفق الخلايا التالية باتجاه القناة التي تمر بمرور الوقت بسبب زيادة مقاومه التدفق. استخدام المتوسطة لغسل الخلايا المتبقية في القناة. (ج) ارتداد الخلية إلى غرفه الثقافة. شريط المقياس: 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كفاءه التقاط خليه واحده من LECs ، WNT5B sh4 و pLKO-GFP في رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية. (ا) صوره المجهر من الخلايا الثلاث الوحيدة الملتقطة في غرفه الثقافة. (ب) تمثل القضبان الخضراء والزرقاء والحمراء كفاءه التقاط الخلايا الفردية ، علي التوالي ، وتمثل القضبان الصفراء كفاءه التقاط للخلية الاحاديه الثلاثية. شريط المقياس: 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اقتران الخلية الواحدة بالثقافة المشتركة والثقافة المشتركة الثلاثية الخلية الواحدة في رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية لمده 24 ساعة. (ا) صوره المجهر من خلايا واحده ثلاثية الثقافة المشتركة ل 0, 12 و 24 ح. (ب) صوره المجهر من PLKO-gfp و WNT5B sh4 خلايا الثقافة المشتركة ل 0, 12 و 24 h. وكانت ملطخه الملونة مع الأخضر cmfda صبغ ، وكانت ملطخه WNT5B Sh4 الخلايا مع صبغ cmac الأزرق و وكانت ملطخه الخلايا pLKO-GFP مع احمر الصبغة الفلورية. شريط المقياس: 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: تحميل الخلية. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
فيديو تكميلي 2: أعاده تدفق الخلية. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيديو التكميلية 3: الارتداد نوع الخلية الثانية في غرفه الثقافة. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يلعب ال [اينترخلوي] تفاعلات من خلايا مختلفه في الورم [ميكروبيئه] دور مهمة في التقدم من الورم17. ومن أجل فهم اليه تفاعلات الخلايا الخلوية ، تستخدم نظم الثقافة المشتركة كطريقه تحليليه مشتركه. ومع ذلك ، فان أنواع الخلايا المتعددة وتباين الخلايا نفسها قد أدت إلى تعقيدات تجريبية وصعوبات تحليليه.
وتسمح الرقاقة المتحركة الهيدروديناميكية بتحميل متعدد الخلايا الواحدة في غرفه الثقافة بطريقه قطعيه ، دون ان تكون مقيده بقيود توزيع بواسون في طريقه التخفيف ومنصة microwell. من خلال توفير عاليه ثلاثية خليه واحده كفاءه التقاط (أكبر من 45 ٪ ، وطريقه التوزيع Poisson هو 5 ٪) وإثبات انه في غرفه الثقافة ، يكفي الفضاء لنمو الخلايا وانتشارها (الشكل 4). نظرا لقدرته علي أداء متعددة بكفاءة يلتقط خليه واحده والملاحظات الحية ثقافة الخلية مع الاعداد والبروتوكول بسيطه ، ونحن نتصور هذه الاجهزه ميكروفلويديك كاداات مفيده لمجموعه واسعه من التطبيقات ، بما في ذلك خليه خلوية التفاعلات بين خلايا متعددة18، فحص المخدرات19، والبيولوجيا السرطان20. ومن ناحية أخرى ، فان هيكل الجهاز قابل للتشكيل ، ويمكن تغيير هيكل وحجم موقع التقاط وتطبيقه علي مجالات أخرى مثل الكائنات الدقيقة والخلايا النباتية. من الناحية النظرية ، طريقتنا هي أيضا قابله للتكيف لإنشاء وتتبع الجراثيم المشتركة الثقافات (علي سبيل المثال ، البكتيريا ، الخمائر ، الخ).
الحد الرئيسي لهذا النهج هو ان مستوي الدقة المطلوبة لتصنيع الجهاز عاليه. ويرجع ذلك أساسا إلى ان مقاومه تدفق أصغر قناه يمكن تغييرها بشكل كبير إذا تم أزاحه ابعادها ملفقه قليلا. السيطرة علي المقاومة من القناات الدقيقة هي حاسمه للتقاط ذات الكفاءة العالية خليه واحده من الجهاز. من ناحية أخرى ، خلال ثقافة الخلية ، لا يوجد إغلاق بين الغرف. لذلك ، قد ينتشر إفراز الخلايا في الغرفة في الحجرات الأخرى للتاثير علي الخلايا الأخرى. وأخيرا ، يجب إيلاء الاهتمام لنظافة القناة والأنابيب اثناء اعداد الجهاز. يجب تصفيه وسيطه الثقافة وأي عازل مستخدم في التجربة لمنع الجزيئات والحطام من حجب القناة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من وزاره العلوم والتكنولوجيا (105-2628-400-001-MY2) ، وبرنامج الدكتوراه في هندسه الانسجه والطب التجديدي ، وجامعه تشونغ شينج الوطنية ، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
