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Medicine

受控自动脱氧过程中与氧梯度压质测定的病带特征

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/60213

Summary

在这里,我们介绍了氧梯度阴氧测量,一种快速和可重复的方法,用于测量在受控解氧和再氧化下,患者在细胞疾病患者的样本中的红细胞变形性。该技术为研究红血球病变和监测刀状细胞疾病治疗效果提供了一种方法。

Abstract

在刀状细胞疾病(SCD)中,β-球蛋白基因编码中的单点突变导致异常血红蛋白S(HbS)的产生。当脱氧时,HbS可以聚合,形成血红蛋白的硬棒,导致红血球(RBCs)生病。这些被病害的红细胞显著降低了可变形性,导致血管闭塞,导致许多与SCD相关的临床并发症,包括疼痛、中风和器官损伤。RBC的可畸性也通过RBC脱水而降低,导致密集的红血球更容易得刀。迄今为止,还没有一个广泛可用、快速和可重复的实验室检测能够预测疾病严重程度或直接监测新型非胎儿血红蛋白诱导疗法的治疗效果。在这项研究中,我们将一种测量RBC畸形性的协议描述为pO2的函数,它允许对SCD患者的病变行为进行定量。氧梯度阴度测量测量RBC的可变形性,表示为伸长指数(EI),作为pO2的函数。在一轮脱氧和再氧化期间,RBC 会接触到 30 Pa 的固定剪切应力。生成了六个读出参数。其中,生病点 (PoS), 定义为 pO2,其中最大 EI (EI最大值)显示 5% 的降低, 和最小 EI 在脱氧期间 (EImin)是信息最丰富的, 反映单个患者的 pO2分别开始生病和患者红血球的最小畸形。PoS 与单个患者的血红蛋白对氧的亲和力相关,而 EImin与胎儿血红蛋白水平有很强的相关性。我们得出结论,氧梯度阴球测定是一种有前途的技术,用于监测SCD患者的治疗,作为临床和临床前试验中抗病剂的生物标志物,是研究来自具有SCD和刀状细胞特征的人。

Introduction

在SCD中,单点突变导致HbS的产生,HbS在脱氧时可以聚合。HbS 聚合会导致 RBC 生病,并降低 RBC 的可变形性。RBC 病变和 RBC 依从内皮的组合会导致各种 SCD 并发症,包括血管闭塞性危机 (VOC)、中风、器官损伤和慢性溶血性贫血。即使在规范条件下,RBC的可畸性在SCD患者中也会受到损害。在低氧浓度下,可变形性进一步降低。决定诺莫夏畸形的关键参与者是致畸细胞、不可逆转的病变细胞(ISC)和脱水细胞,所有这些细胞的表面体积比都有所下降,为1,2,3。

细胞测定法是一种测定RBC畸形性的既定方法,广泛用于遗传性溶血性贫血的诊断,特别是心肌病的诊断4。它也可以用来研究血液学5,6,7,8,9。渗透梯度阴囊测量,其中RBC的可变形性测量期间,渗透性连续变化,已被用来研究SCD超过十年10,11。胎儿血红蛋白(HbF)的百分比是HbS聚合最强的抑制剂之一,因为HbF及其混合四聚体([2]S+)都不能进入脱氧HbS聚合物相12。最近的研究表明,增加SCD患者的HbF水平可以导致更好的表面体积比,从而改善水化状态,从而改善非转液患者的畸形性11。

RBC的可畸性在过去被研究为SCD并发症的生物标志物,但结果相互矛盾。在横截面和稳定状态的研究中,发现RBC畸形水平较高的个体骨质瘤发病率较高,疼痛危机发生率更高,分别为13、14、15。与这些发现相反,与急性VOC期间的稳定状态值相比,同一个体的纵向研究中的RBC畸形性降低16。这种差异可能是研究RBC在不同条件下的可变形性的结果(即,在稳定状态与VOC之间)。在VOC开始时,被病变的细胞的百分比很高,随着危机的进展,细胞被迅速摧毁,这或许可以解释在VOC期间获得的稳态横截面发生率数据之间的差异。然而,其他因素,如RBC亚群与内皮表面的依从性,在VOC的发生中可能也很重要。在SCD中,测量脱氧过程中的变形性在临床上更相关,因为血管闭塞通常发生在缺氧后毛细管,而不是低氧微毛细管网络17。此外,ISCs 的存在可能会改变电位计测量诺莫夏的可变形性的能力。衍射模式的失真是由ISC引起的,这是由于在流1、2、3期间不对齐造成的。

研究VOC病理生理学的替代方法包括测量RBC附着在人工表面18,单细胞电阻抗微流细胞测定19,微流体模型结合定量测量细胞生病和未生病与单细胞流变20,和激光诱导聚合21。这些技术虽然很有前途,但成本高昂,劳动密集,需要大量的操作员培训。此外,基于形态的测定缺乏研究细胞行为的能力,如畸形性,作为氧梯度的函数。

在这项研究中,我们描述了使用阴基计进行的快速和可重复的功能测定。这是下一代甲氧比克测量,用于测量在脱氧(1,300 s)和快速再氧(280 s)期间以EI表示的RBC可变形性的不同定性方面。这些时间间隔允许HbS聚合物的形成,从而发生形态变化,然后恢复。脱氧通过引入氮气发生,氮气可缓慢地降低血样中血样在气穴计和杯形之间间隙的氧张力。RBC 的可变形性是连续测量的,而氧气张力则每 20 s 通过杯壁上的小 O2点进行测量。在测试期间,大约 80 pO2测量与当时测量的 EI 耦合。脱氧期间,氧气压力降至20 mmHg以下,环境空气的被动扩散促进了再氧化。图1图2描述了氧梯度测量模块的实验设置。阴基测量的原理基于从激光束中引起RBC引起的光散射。当同时施加剪切应力时,这会产生椭圆形衍射模式(图1)。

Protocol

所有程序均由乌得勒支大学医学中心(UMCU)道德委员会批准,并符合《赫尔辛基宣言》。根据《赫尔辛基宣言》,在得克萨斯州儿童血液学中心(TCHC)注册的患者由当地IRB批准。

1. 一般考虑

  1. 首先执行测试测量以预热鲍勃和杯子。确保鲍勃和杯子的温度为37°C。这对良好的可重复性非常重要。
  2. 确保粘性聚苯丙酮 (PVP) 溶液在室温 (22 °C) 下符合渗透性(282~286 mOsm/kg)、pH值(7.35±7.45)和粘度(27.5~32.5 MPa)的严格限制。
    注:PVP 必须在室温下使用。如果储存在较低温度下,请确保在进行任何测量之前,它已加热到室温。

2. 启动电托仪

  1. 从背面打开计算机和电表。启动计算机上的软件程序 (材料表) .
  2. 通过打开氮气缸,确保氮气可用于样品脱氧。
  3. 降低杯子中的鲍勃,确保杯子可以自由转动。用软布和蒸馏水清洁内部和外部的杯子,因为碎屑可能会妨碍 EI 测量。
  4. 当软件程序运行时,检查屏幕上的以下消息:"确保气体阀已打开",然后单击"确定"。
  5. 确保电表启动屏幕上将显示的 pO2自检过程。选择"开始"输入) 。如果失败,通过单击"硬件检查"重新运行自检 |pO2 |自我检查。
    注: 如果自检再次失败,请考虑更换 O2点。O2点被用指尖从杯子内部轻轻推开。将点从外部轻轻推入杯子,放置一个新点。
  6. 从左侧列出的不同测试中选择pO2扫描。选择屏幕右侧的"设置",并确保它们根据表 1中列出的参数进行设置。为每个测量保留相同的设置。
  7. 要保存这些设置,请按"确定" |好的。
    注: 首选设置列在表 1中,但可根据用户首选项和调查目的进行调整。例如,为了更广泛地研究生病行为,可以改变脱氧速度和持续时间。

3. 样品收集和制备

注:为了验证该技术,从38名SCD患者和5个健康对照包括在大学医学中心乌得勒支或得克萨斯儿童血液学中心,在不同的临床研究(荷兰试验登记处[NTR]标识符,NTR 6779和NTR 6462),以及从门诊部就诊或住院的病人的匿名剩余血液样本被使用。

  1. 在含有EDTA的管中,通过静脉穿刺(至少300μL/样本)采集血液样本。确保血液在4°C下储存至少30分钟,但不超过24小时。
    注:磷酸二苯醚(CPDA)或肝素也可使用,但这些试剂对样品保存相对于氧梯度的环氧测定的影响并不为人所知。
  2. 通过反转轻轻混合样品,使其均质化。请勿摇动样品。在测量前,让样品在辊台上预热至室温。
    注:在 4°C 下储存超过 1 小时的样品管 (9-10 mL) 必须预热 15 分钟。在 4°C 下储存不到 1 小时时,必须预热 10 分钟。在 4°C 下储存超过 1 小时的样品管 (2~6 mL) 必须预热 10 分钟。在 4°C 下储存不到 1 小时时,必须预热 5 分钟。
  3. 在血液分析仪上测量完整的血液计数。为此,在含有EDTA的管中摄取20~200μL全血。将吸气针放在管中,然后按压血液分析仪指针后面的按钮以开始测量。
    注:在完整的血液计数中,可测量RBC数,这是标准化氧梯度测量的一个重要因素。RBC 计数通过流式细胞测定从正向和侧散射计算。健康对照中的正常 RBC 计数为 3.7*5.0 x10 12/L(女性)和男性 4.2*5.5 x10 12/L。SCD患者的RBC计数一般减少。一些血液学分析仪还将测量致密的红血球(%DRBC),这在解释单个氧梯度血谱曲线时可能具有额外的价值。
  4. 通过调整将添加的样本量,将整个血液样本标准化为 5 mL PVP (200 x 106 RBC/vial) 中的 200 x 106 个RBC 的 RBC 计数。如果 RBC 总数小于 200 x 106,则衍射模式和 EI 将受到影响。
    1. 使用下面的公式执行计数。
      4.0/xx (x 1012/L) x 50 = yy μL 全血/瓶 PVP
      其中 xx 是从步骤 3.3 获得的计算出的 RBC 计数,yy 是实际测量所需的全血量。根据贫血的等级和影响RBC计数的其他因素,所需的全血量为40-90μL。

4. 氧梯度测量

  1. 将计算出的样本体积(血液的yy μL)移入PVP,以获得5 mL的总体积。通过轻轻地重新悬浮血液3x来预湿尖端。使用开口宽的移液器尖端,以避免对RBC造成额外应力。通过倒置手动混合样品,直到样品均匀。
    注:尽可能短的时间打开 PVP 小瓶,以避免空气接触。
  2. 在没有针头的情况下,缓慢地将2.0 mL的血液/PVP混合物抽入3 mL注射器中。按下柱塞以去除任何可见的气泡和过量的样品溶液,直到注射器中保留 1.5~1.8 mL(取决于杯容)。
  3. 通过接头缓慢均匀地将总样品量注入 bob 中。确保样品的液位高于氧传感器(粉红色点)和小吸孔上方。请勿将任何样品溶液留在注射器中。
  4. 单击"新建"并填写 PVP 的示例标识符、备注、捐赠日期和粘度。单击"确定" |吸气.60 s 后,杯子将旋转并吸出样品 15 s。当旋转停止时单击"确定"。关闭机器盖。单击"继续" |现在开始,因为氧梯度的分量测量是用固定增益完成的。测量大约需要 28 分钟。
  5. 测量后,打印显示软件自动计算的曲线和参数的报表。确保原始数据自动存储在"设置"中的指定文件夹中。最大 EI (EI最大值)、最小 EI(EI最小值)、pO2=95%EI (PoS) 和面积(曲线下的面积)将自动计算并添加到打印的报表和原始数据中。
  6. 通过计算 EI最大值和 EI最小值之间的差异,手动获得 _EI。在100~120 mmHg的再氧化期间,采用脱氧前均值EI的差异(pO2 100~120 mmHg)和平均EI值,计算回收百分比。

5. 清洁电托仪

  1. 取出样品注射器,用装满蒸馏水或去离子水的注射器更换。
  2. 清洁,在冲洗过程中缓慢冲洗接头。确保朝两个方向齐平。
  3. 取出注射器并提起鲍勃。用软布彻底擦干鲍勃、杯子和接头。
  4. 使用大型注射器(10~50 mL)冲洗接头,以去除管中残留的任何水。堵住鲍勃的下部入口/出口,使管子中承受回压,从而去除剩余的水。
  5. 放下杯子里的鲍勃。机器现已准备好进行下一次测量。

6. 机器的停机

  1. 确保机器在上次测量后正确冲洗,如上所述。确保正确的管与清洁溶液相关。
  2. 关闭软件,按"关闭",然后按"开始"以启动当天的清洁程序。
  3. 完成整个清洁程序后,取出注射器并提起鲍勃。用大注射器冲洗接头。
  4. 倒空废瓶,用软布擦干鲍勃和杯子。冲洗接头,以去除管中剩余的水。堵住鲍勃的下部入口/出口,使管子有回压,从而去除任何剩余的水。
  5. 关闭机器盖。关闭氮气缸。关闭计算机和机器。

Representative Results

氧梯度阴度测量可用于描述SCD患者的患病行为。在这项研究中,共包括38名SCD患者和5个健康对照的血液样本。在健康对照中,衍射模式在静止时呈圆形,在较高的剪切应力4时为椭圆形。从椭圆衍射模式中,根据衍射图案的高度和宽度计算伸长指数(EI)。在氧梯度气氧测量中,氮气对样品进行缓慢和连续的脱氧,然后由环境空气快速再氧化。在这些条件下,RBC在脱氧下可以观察到。这将导致衍射模式失真,因为生病的红细胞在施加的剪切应力下无法正确对齐。因此,与健康的RBC相比,它们似乎不太可变形(图2)。

图 3A显示了脱氧时,在氧氧化时,在氧梯度压切测量中模拟条件时,sickle RBC 的形状如何变化,而不脱氧的控制 RBC 则显示形状没有变化。这个过程导致氧梯度分量测定期间衍射模式的变形,从而降低了EI。图 3B显示了生成不同参数的不同衍射模式。

图3C显示了由阴度计获得的代表性曲线。六个参数反映了RBC的吸病行为的不同特征:EI最大值是脱氧前测量开始时的最大EI。此参数表示基线位置,并反映环境空气中 RBC 总体的总体变形性。EImin是最小 EI,表示脱氧后最小变形性。此参数反映了脱氧时(刀状)RBC 的形状和方向的变化。*EI 是 EI最大值和 EI最小值之间的差值,表示在一轮脱氧过程中有多少细胞可以打刀。5% 的病变点 (PoS5%)是 pO2 (mmHg), 在脱氧期间测量 EI最大值降低 5%。这表示吸氧过程开始处的氧张力。面积反映曲线下方的面积,通过 100 mmHg 和 pO2分钟 (mmHg) 之间的 EI 和 pO2测量的积分计算来确定。这是前面描述的参数EI最大值、EI最小值和PoS的结果。 恢复表示EI在再氧化的最后部分与基线EI的差异。两个 EI 值均以 100*120 mmHg 的 pO2测量。该参数反映了在脱氧期间使氧化的RBC在再氧化22期间逆转生病的能力。重复测量的参数通常具有变异系数 (CV) <5%(中位数 1.83%)。如果获得 CV > 5%,则进行第三次测量。参数 EI最大值和恢复性是可重现的,其中值 CV 为 <1%。

健康对照的RBC、HbS特征患者(异构性HbS)和同源性SCD患者的代表性曲线如图4A所示。HbSC 患者的代表性曲线显示较低的恢复率,这可能表示不同的生病过程(图 4B)。使用羟基尿素(HU)和输血治疗的HbSS患者的代表性曲线如图4C图4D所示。显然,通过输血治疗的HBSS患者的HS状(HbAS细胞)和RBC的代表性曲线(由同源性刀(HbSS)和同源正常(HbAA)细胞的混合物组成,图4AD )。未经治疗的SCD患者和HU和输血治疗患者的曲线明显差异,凸显了这种测定的效用(图4C,D)。HbF 和 HbS 水平与 EI最小值显著相关,在较小程度上与 PoS 相关(图 5A=D)。这表明,那些对患者评价中重要的实验室参数也反映在氧梯度的阴度测量中。诺莫夏的病变细胞数量和致密RBC(DRBC)的百分比都会影响EImax值,因为它们显著相关(图5E=F),这表明EImax反映了生病的过程。这些结果表明,这些不同特性具有 %HbS、%HbF、诺莫夏的病变细胞和 %DRBC 如何影响不同的参数。

Figure 1
图 1.电表的原理设置。阴度计使用库埃特系统对细胞施加剪切应力。旋转外缸(杯)和静态内缸(bob)用于在37°C下产生层流来诱导剪切应力。在鲍勃和杯子之间有一个小的间隙,其中血液悬浮液被注射。激光束从鲍勃穿过血悬架,由RBC的存在散射。衍射模式由摄像机投影和分析。伸长指数 (EI) 使用衍射模式4的高度 (a) 和宽度 (b) 进行计算。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2.具有氧梯度的氧梯度测量模块的电表的原理设置。模块的原理图,显示随着氮气(N2)注入而缓慢地对血液悬浮液进行脱氧氧气张力通过从 LED 光纤发送到 O2点发出的光泳信号的淬火量进行测量。脱氧后,sickle RBC 将开始发生病变,其变形性将下降,并且不再与椭圆 RBC 对齐。被病变的RBC会扭曲衍射图案,将其形状从椭圆更改为菱形或菱形。衍射模式形状的此变化会导致 EI 的降低。pO2和 EI 的测量在杯中不在同一高度执行。这确保了在脱氧和再氧化曲线之间有更好的区分,从而更好地解释曲线。此图已由 Rab 等人22修改,请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3.代表性氧梯度阴度测定曲线和衍射模式。A) 在类似氧梯度的氧分仪条件下脱氧时,是固定的。在控制刀状RBC中,使用相同的条件,但没有氮气。脱氧的 SICKe RBC 与控制 RBC 相比,其形状发生了变化。 (B) 在脱氧和剪切应力 (30 Pa) 时,衍射模式从椭圆变为菱形。(C) 氧梯度测量的代表性曲线.最大伸长指数 (EImax) 表示基线位置,并显示总 RBC 总体的整体可变形性。最小 EI ( EImin) 表示最小变形性, 这是由脱氧时 RBC 的形状和方向变化引起的.[EI (dEI, EI最大值和 EI最小值之间的 EI 差异) 显示在一轮脱氧过程中有多少细胞可以打刀。当第一个 RBC 开始吸刀时,吸孔点(PoS,pO2在 5% EI 降低时)显示氧气张力。曲线下的面积(从 pO2 分钟= 100 mmHg)在参数区域中计算。这总结了 EI最大值、EI最小值和 PoS。在再氧化期间,被病化的细胞对无节制的能力在参数恢复(再氧化期间达到的EI最大值百分比)中表示。为了辅助解释,每个单个实验中的所有数据点都通过一条线连接,以图形方式呈现结果。此图已由 Rab 等人22修改,请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4.氧梯度阴热测量参数与SCD患者的基因型和治疗方案相关。A) HbS携带者(HbS特征)的RBC代表性图和与未经治疗的HbSS患者有关的健康对照图。(B) 血红蛋白SC病患者与未治疗HbSS患者有关的红蛋白SC患者的红细胞代表性图。(C) 羟基尿素治疗同源性SCD患者(HbSS HU)与未治疗HbSS患者有关的红细胞的代表性图。(D) 接受输血(HbSS输血)治疗的HbSS患者与未经治疗的HbSS患者有关的红细胞红细胞的代表性图。此图已由 Rab 等人22修改,请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5.氧梯度阴基测量参数与 %HbF、%HbS、%病变细胞和 %密集 RBC 相关。A) 15个HbSS或HbS/β-地中海贫血患者的最小伸长指数(EImin)和%HbF的线性相关性。(B) EI最小和 %HbS 的线性相关性 (C) PoS 和 %HbF 的线性相关性 (D) PoS 和 %HbS 的线性相关性 (E)最大 EI (EI最大值)的线性相关性和患病细胞百分比用数字显微镜测量的诺莫夏。(f) 21例HbSS患者EI最大和致密RBC(%DRBC)的线性相关性。此图已由 Rab 等人22修改,请点击此处查看此图的较大版本。

设置
文件 存储目录
常规选项 默认介质粘度 PVP 的粘度
pO2 扫描 最短吸入时间(s) 60
pO2 扫描剪切应力 (Pa) 30
确定每 (S) pO2 20
移动平均大小 2
pO2扫描步骤;编辑 0 -关;60 -on;1360 =关;1640 -关
之间的面积(毫米汞柱) 10 和 100
pO2 控制 关闭(未选中)

表 1.心托仪的首选设置。

Discussion

在这里,我们描述了氧梯度阴热度测定法,一种可用于研究SCD患者在氧浓度范围内的病变行为的方法(图4图5)。为了获得可重复的结果,确定影响结果的因素非常重要。例如,温度对RBC的可变形性影响很大,主要是因为它对粘性溶液(PVP)厚度的影响。我们建议在一天开始时执行测试测量,将机器彻底加热到 37°C。这将提高结果的可重复性。粘度溶液的渗透性应在较窄范围内(PVP 为 282~286 mOsm/kg),因为渗透会影响水化状态,进而影响 RBC 的变形性。PVP的pH值和粘度也应严格调节。pH和温度的差异可以显著影响曲线22。此外,杯、鲍勃和管中剩余的水可能会导致红SC的变幻,从而导致不正确的数据,因为将测量杯中存在的完整RBC较少。

可以调整用于执行氧梯度的阴度测定的设置,以解决特定的调查问题。首选设置列在表 1中。根据观察结果,选择1,300秒的脱氧时间,表明氧化氧的延长并没有导致大多数患者的EI分钟降低。相反,缩短脱氧时间会妨碍氧梯度氧分计的鉴别力。由于再氧化过程中HbS聚合物快速溶解,并同时EI在脱氧前测量值恢复,因此再氧化时间被设定为280s。剪切应力设置为 30 Pa,这类似于渗透梯度压射仪。降低此参数可能会妨碍区分力。如果对每个患者样本应用了一组脱氧速度,则可以使用脱氧控制。在我们首选设置中,此选项已关闭,因为由于独特的血红蛋白解离曲线,脱氧率是特定于患者的。因此,打开脱氧控制将消除测定中的这一特性。然而,氧梯度的这种特征仍在研究之中。

几个众所周知的因素影响氧梯度的阴度测量参数,即pH、温度和渗透性。乙酸酯,特别是PoS,受2,3-二磷甘油酸盐(2,3-DPG)22的影响。此外,%HbF 和 EImin之间有明显的相关性,在较小程度上存在 PoS(图 5A=D)。EImax与诺莫夏的刀状细胞相关,这可以解释在 VOC 后不久,在诺莫夏 (EI最大值)的 RBC 变形性较高。后者是由最生病的细胞的破坏引起的,因此在VOC16期间,RBC的变形性较差。如图5F所示,高 %密集式 RBC(定义为血红蛋白浓度 >1.11 mg/mL 的 RBC)与较低的 EI最大值密切相关。这表明致密细胞是红细胞在诺莫夏的可变形性的重要因素,与先前报告的结果1类似。

样品标准化对于获得可重复的结果和区分不同的基因型和治疗方法非常重要。对 RBC 计数进行校正非常重要,因为 RBC 的数量会影响衍射模式的强度。如果鲍勃和杯子之间的间隙中存在较低的 RBC 数,曲线将向上向左移动。此外,曲线将波动,妨碍参数的精确计算,尤其是 PoS。

此技术的一个限制是 EI 值表示所有单元格的平均值,包括不同的子群体。对SCD患者的RBC种群异质性及其对细胞测定学测量的影响进行了深入的研究。这导致了标准化,其中衍射模式的大小调整为固定值,而不是对 RBC 计数23、24进行校正。目前,是否还应将这种标准化方法应用于氧梯度测量中。

在缺氧条件下测量RBC变形的几项技术是在25、26、27号甲氧计外发生的脱氧步骤基础上开发的。在这些条件下,HbS特征患者和生理pH25下的健康对照组之间未观察到细胞行为的差异。然而,在具有HbS特征的个体中,氧梯度的阴度测量清楚地显示低但明显的PoS(图4A)。迄今为止,在常规临床实践中,测量单个患者的红细胞在体外生病的倾向的唯一替代方法包括基于形态的刀状测定:在促进HbS聚合的条件下孵育,例如低氧张力或低pH。培养后添加固定剂,使用光显微镜手动或数字计数被病变细胞的百分比。许多临床前和早期药理学试验使用病变测定产生继发结果变量,以预测SCD28、29、30、31的临床疗效, 32.然而,它很耗时,可变性高,灵敏度低,技术不是自动化的,因此是劳动密集型的。此外,由于病变引起的形态变化可能与生理参数(如RBC可变形性)没有很好的关联,因为它是二维静态测定2。

氧梯度分度测定提供快速和可重复的病倒功能测定。这是一个体外测试,不考虑内皮表面。然而,它确实提供了病变行为和RBC特征的功能方面,使其成为一个有前途的技术,为刀状细胞研究。该技术的未来应用包括监测SCD患者的治疗效果,作为新治疗策略的生物标志物,研究生病行为,以及监测SCD干细胞移植后的血病。

Disclosures

作者声明没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作部分得到了欧洲之星公司estar18105的资助和RR机电一体化公司提供的无限制赠款的支持。作者感谢西索·亨德里克斯和扬·德·佐伊滕的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADVIA 120 Hematology Analyzer Siemens 067-A004-14 Instrument
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer Abbott 8H00-01 Instrument
Lorrca RR Mechatronics LORC109230 or LORC109110 Instrument
Lorrca Software version V5.08 RR Mechatronics - Software
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 Local -
O2-spot RR Mechatronics PO2S020153 O2 measurement
Oxygenscan module (pO2scan) RR Mechatronics PO2S109000 Add-on
Oxy-ISO RR Mechatronics QRR 030905 Viscous solution
X-Clean RR Mechatronics QRR 010946 Cleaning solution Lorrca

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References

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医学, 问题 153, 生病, RBC 变形, 脱氧, 阴孔测定, 刀状细胞疾病, 衍射模式, 血红蛋白
受控自动脱氧过程中与氧梯度压质测定的病带特征
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Rab, M. A. E., van Oirschot, B. A.,More

Rab, M. A. E., van Oirschot, B. A., Bos, J., Kanne, C. K., Sheehan, V. A., van Beers, E. J., van Wijk, R. Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry. J. Vis. Exp. (153), e60213, doi:10.3791/60213 (2019).

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