Summary
Her præsenterer vi ilt gradient ektacytometri, en hurtig og reproducerbar metode til at måle røde blodlegemer deformabilitet i prøver fra patienter med seglcellesygdom under kontrolleret deoxygenering og reoxygenation. Denne teknik giver en måde at studere røde blodlegemer sickling og til at overvåge seglcellesygdom behandling effektivitet.
Abstract
I seglcellesygdom (SCD), en enkelt punkt mutation i genet kodning for beta-globin forårsager produktion af unormale hæmoglobin S (HbS). Når deoxygenated, HbS kan polymerisere, danner stive stænger af hæmoglobin, resulterer i sickling af røde blodlegemer (RBCs). Disse sickled RBCs har signifikant reduceret deformabilitet, forårsager vaso-okklusion, hvilket fører til talrige SCD-relaterede kliniske komplikationer, herunder smerter, slagtilfælde, og organskader. RBC deformabilitet er også reduceret ved RBC dehydrering, resulterer i tætte røde blodlegemer, der er mere tilbøjelige til at segl. Til dato, der er ikke en enkelt bredt tilgængelige, hurtig, og reproducerbare laboratorieanalyse i stand til at forudsige sygdommens sværhedsgrad eller direkte overvågning af behandlingseffekterne for nye, ikke-føtale hæmoglobin inducerende terapier. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol til måling af RBC-deformabilitet som en funktion af pO2 , der giver mulighed for kvantitering af sikdrende adfærd hos SCD-patienter. Oxygen gradient ektacytometri måler RBC deformabilitet, udtrykt som langstrakt indeks (EI), som funktion af pO2. RBCs udsættes for en fast forskydningsbelastning på 30 PA under en runde af deoxygenering og reoxygenering. Der produceres seks udlæseligt parametre. Af disse er punktet af sickling (PoS), defineret som pO2 , hvor maksimum EI (EIMax) viser en 5% fald, og minimum ei under deoxygenering (EImin) er de mest informative, afspejler en individuel patients pO2 , hvor og den minimale deformabilitet af patientens røde blodlegemer. PoS er forbundet med en individuel patients hæmoglobin affinitet for ilt, mens EImin viser en stærk korrelation med føtal hæmoglobinniveauer. Vi konkluderer, at ilt gradient ektacytometri er en lovende teknik til at overvåge behandlingen af patienter med SCD, som en biomarkør for anti-sickling agenter i kliniske og prækliniske forsøg, og et vigtigt redskab til at studere sikdrende opførsel af RBCs fra personer med SCD og seglcelletræk.
Introduction
I SCD resulterer en enkeltpunkts mutation i produktionen af Hb'er, som kan polymerisere ved deoxygenering. HbS polymerisering forårsager sickling af RBCs og reducerer RBC deformabilitet. Kombinationen af RBC sickling og RBC overholdelse af endotelet fører til forskellige SCD komplikationer, herunder vaso-okklusive kriser (VOC), slagtilfælde, organskader, og kronisk hæmolytisk anæmi. Selv ved normoxiske forhold er RBC deformabilitet kompromitteret hos patienter med SCD. Deformabilitet reduceres yderligere ved lave iltkoncentrationer. Nøglespillere, der afgør deformabilitet ved normoxia er tætte celler, irreversibelt sickled celler (ISC), og dehydrerede celler, som alle har en nedsat overflade-til-volumen ratio1,2,3.
Ektacytometri er en etableret metode til at måle RBC deformabilitet, der anvendes i vid udstrækning til diagnosticering af arvelige hæmolytiske anemier, især membranopathies4. Det kan også bruges til at studere hemorheologi5,6,7,8,9. Osmotisk gradient ektacytometri, hvor RBC deformabilitet måles under en kontinuerlig ændring i osmolalitet, er blevet brugt til at studere SCD i over et årti10,11. Procentdelen af føtal hæmoglobin (Hbf) er en af de stærkeste hæmmere af HBS polymerisering, fordi hverken Hbf eller dens blandede hybrid transthyretin (∝ 2βsγ) kan komme ind i deoxyhbs polymer fase12. Nylige undersøgelser tyder på, at stigende HbF niveauer i SCD patienter fører til en bedre overflade-til-volumen ratio, og dermed forbedre hydrering tilstand og dermed deformabilitet hos ikke transfvant patienter11.
RBC deformabilitet er blevet undersøgt i fortiden som en biomarkør for SCD komplikationer, men med modstridende resultater. I undersøgelser udført på tværs af sektionelt og i en steady state, personer med højere niveauer af RBC deformabilitet fandtes at have en højere forekomst af osteonekrose og mere smerte kriser13,14,15. I modsætning til disse fund, sammenlignet med Steady State værdier under en akut VOC, RBC deformabilitet blev reduceret i longitudinale undersøgelser inden for de samme personer16. Denne afvigelse kan være resultatet af at studere RBC deformabilitet under forskellige forhold (dvs. under Steady State versus VOC). Andelen af sickled celler er høj ved starten af en VOC, og cellerne ødelægges hurtigt, når krisen skrider frem, hvilket kan forklare forskellen mellem steady state tværsnits incidens data og longitudinel data opnået under VOC. Men andre faktorer, såsom overholdelse af RBC subpopulationer til endotel overflade, kan også være vigtige i forekomsten af VOC. I SCD er det mere klinisk relevant at måle deformabilitet under deoxygenationen, fordi vaso-okklusion typisk forekommer i de hypoxiske postkapillær venoler og ikke i det mindre hypoxiske mikrokapillær netværk17. Desuden, tilstedeværelsen af ISCs kan ændre evnen af en ektacytometer til at måle deformabilitet ved normoxia. Forvrængning af diffraktions mønsteret skyldes ISCs, som er resultatet af den manglende justering under flowet1,2,3.
Alternative tilgange til at studere Patofysiologi af VOC omfatter målinger af RBC tilslutning til en kunstig overflade18, enkelt celle elektrisk impedans microflow flowcytometri19, microfluidic-baserede modeller, der kombinerer kvantitative målinger af celle sikdrende og usikdrende med enkelt celle rheologi20, og Laser-induceret polymerisering21. Selvom lovende, disse teknikker er dyre, arbejdskraftintensive, og kræver omfattende operatør uddannelse. Desuden, de assays, der er morfologi-baserede mangler evnen til at studere cellulære adfærd, såsom deformabilitet, som en funktion af en ilt gradient.
I dette studie beskriver vi en hurtig og reproducerbar funktionel analyse udført med et ektacytometer. Dette er en næste generations ektacytometri måling, der måler de forskellige kvalitative aspekter af RBC deformabilitet udtrykt som EI under deoxygenering (1.300 s) og hurtig reoxygenation (280 s). Disse tidsintervaller giver mulighed for HbS polymer dannelse, og dermed forekomsten af morfologiske ændringer og derefter opsving. Deoxygenation opstår ved at indføre nitrogen gas, som langsomt nedsætter iltspændingen i blodprøven i kløften mellem Bob og kop af ektacytometer. RBC deformabilitet måles kontinuerligt, mens iltspændingen måles hver 20 s ved hjælp af en lille O2-spot til stede i væggen af koppen. Under testen er ca. 80 pO2 målinger KOBLET til ei målt på det pågældende tidspunkt. Ilttrykket falder til under 20 mmHg under deoxygenationen, og reoxygenering lettes ved passiv diffusion af omgivende luft. Den eksperimentelle opsætning af modulet ektacytometer og oxygen gradient ektacytometri er beskrevet i figur 1 og figur 2. Princippet om ektacytometri er baseret på RBC-induceret spredning af lys fra en laserstråle. Dette resulterer i et elliptisk diffraktion mønster, når forskydnings stress påføres på samme tid (figur 1).
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af det etiske udvalg i University Medical Center Utrecht (UMCU) og i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. Patienter indskrevet på Texas children's Hematology Center (TCHC) blev godkendt af den lokale IRB og i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki.
1. generelle betragtninger
- Begynd med at udføre en test måling for at opvarme Bob og Cup. Sørg for, at temperaturen af Bob og Cup er 37 °C. Dette er vigtigt for god reproducerbarhed.
- Sørg for, at PVP-opløsningen (viskøs polyvinylpyrrolidon) falder inden for de strenge grænser for osmolaritet (282 – 286 mOsm/kg), pH (7.35 – 7.45) og viskositet (27,5 – 32,5 MPa) ved stuetemperatur (22 °C).
Bemærk: PVP skal anvendes ved stuetemperatur. Hvis det opbevares ved en lavere temperatur, skal du sørge for, at det har varmet op til stuetemperatur, før du tager nogen målinger.
2. opstart af ektacytometer
- Tænd for computeren og ektacytometer fra bagsiden. Start softwareprogrammet (tabel over materialer) på computeren.
- Sørg for, at nitrogen er til rådighed til at deoxygenere prøven ved at åbne nitrogen cylinderen.
- Sænk Bob i koppen og sørg for, at koppen kan dreje frit. Rengør koppen indvendigt og udvendigt med en blød klud og destilleret vand, fordi snavs kan hæmme EI målinger.
- Når softwareprogrammet kører, skal du kontrollere, om følgende meddelelse vises på skærmen: "Sørg for, at gasventilen er åben" , og klik på OK.
- Sørg for, at ektacytometer starter selvkontrol processen for pO2 , der vises på skærmen. Vælg Start (Enter). Hvis det mislykkes, skal du køre selv kontrollen igen ved at klikke på hardware check | pO2 | Selvkontrol.
Bemærk: Hvis selv kontrollen mislykkes igen, skal du overveje at udskifte O2-spot. O2-spot er erstattet af forsigtigt at skubbe plet ud fra indersiden af koppen med en fingerspids. Et nyt sted er placeret ved forsigtigt at skubbe stedet udefra i koppen. - Vælg pO2 -scanning fra de forskellige test, der er angivet til venstre. Vælg Indstillinger til højre på skærmen, og sørg for, at de er indstillet som angivet i de parametre, der er anført i tabel 1. Behold de samme indstillinger for hver måling.
- For at gemme disse indstillinger skal du trykke på OK | Det er okay.
Bemærk: de foretrukne indstillinger er angivet i tabel 1 , men kan justeres i henhold til brugerpræferencer og testformål. For eksempel, at studere den sickling adfærd mere omfattende, iltsvind hastighed og varighed kan ændres.
3. indsamling og klargøring af prøver
Bemærk: til validering af teknikken, ethylenediamin tetraeddikesyre (ETA)-behandlet blod fra 38 SCD patienter og 5 sunde Kontroller inkluderet på University Medical Center Utrecht eller Texas children's Hematology Center, i forskellige kliniske studier ( Nederlandene retssag indskrive [NTR] Identifier, NTR 6779 og NTR 6462), samt anonymiserede rester af blodprøver fra patienter, der besøgte ambulante klinik eller blev indlagt blev anvendt.
- Blodprøver opsamles ved venepunktur (mindst 300 μL/prøve) i et rør, der indeholder EDTA. Sørg for, at blodet har været opbevaret i mindst 30 minutter ved 4 °C, men ikke længere end 24 timer.
Bemærk: citrat fosfat dextrose adenin (CPDA) eller heparin kan også anvendes, men indflydelsen af disse reagenser på prøve konservering med hensyn til Oxygen gradient ektacytometri er ikke velkendt. - Bland prøven forsigtigt ved inversion for at homogenisere. Ryst ikke prøven. Lad prøven varme op til stuetemperatur på en rulle bænk før målingen.
Bemærk: et prøveglas (9 – 10 mL), der opbevares i mere end 1 time ved 4 °C, skal varme op i 15 minutter. Når den opbevares i mindre end 1 time ved 4 °C, skal den varme op i 10 minutter. Et prøveglas (2 – 6 mL), der opbevares i mere end 1 time ved 4 °C, skal varme op i 10 minutter. Når det opbevares i mindre end 1 time ved 4 °C, skal det varme op i 5 min. - Måle den komplette blodtælling på en Hematology Analyzer. For at gøre dette skal du tage 20 – 200 μL fuldblod i et rør, der indeholder EDTA. Placer Aspirations nålen i røret og tryk på knappen bag nålen på Hematology Analyzer for at starte målingen.
Bemærk: i den komplette blodtælling måles RBC-nummeret, hvilket er en vigtig faktor for standardisering af målinger af iltgradient ektacytometri. RBC Count beregnes ud fra fremad-og horisontalt-scatter ved flowcytometri. Normale RBC-tal i raske kontroller er 3,7 – 5,0 x 1012/l for hunner og 4,2 – 5,5 x 1012/l for mænd. RBC-tælling hos patienter med SCD er generelt nedsat. Nogle Hematology analysatorer vil også måle procent tætte røde blodlegemer (% DRBC), som kan være af ekstra værdi i fortolkningen af individuelle ilt gradient ektacytometry kurver. - Standardisere hele blodprøven til en RBC tælling af 200 x 106 RBCs i 5 ml PvP (200 x 106 RBCs/hætteglas) ved at justere mængden af prøve, der vil blive tilsat. Hvis det totale antal RBC er mindre end 200 x 106, påvirkes diffraktions MØNSTERET og ei.
- Brug ligningen nedenfor til at udføre optællingen.
4.0/xx (x 1012/l) x 50 = åå μl fuldblod/HÆTTEGLAS PvP
hvor xx er det beregnede RBC-tal opnået fra trin 3,3 og åå er den mængde fuldblod, der kræves til den faktiske måling. Afhængigt af karakteren af anæmi og andre faktorer, der påvirker RBC tæller, mængden af fuldblod kræves er 40 – 90 μL.
- Brug ligningen nedenfor til at udføre optællingen.
4. måling af iltgradient ektacytometri
- Den beregnede prøvevolumen (yy μL blod) afpipetteres i PVP for at opnå et samlet volumen på 5 mL. Forvåd spidsen ved forsigtigt at resuspendere blodet 3x. Brug en pipettespids med en bred åbning for at undgå yderligere stress på RBCs. Bland forsigtigt prøven manuelt ved inversion, indtil den er homogen.
Bemærk: Åbn PVP-hætteglasset i så kort tid som muligt for at undgå luft kontakt. - Træk langsomt 2,0 mL af blodet/PVP-blandingen til en 3 mL sprøjte uden nålen. Tryk stemplet for at fjerne eventuelle synlige luftbobler og en overdreven prøveopløsning, indtil 1,5 – 1,8 mL er tilbage i sprøjten (afhængigt af Koppens volumen).
- Injicer den totale prøvevolumen langsomt og jævnt i Bob gennem stikket. Sørg for, at prøve niveauet er over iltsensoren (Pink spot) og over det lille sugehul. Efterlad ikke nogen prøveopløsning i sprøjten.
- Klik på ny , og udfyld eksempel-id'et, bemærkningerne, datoen for donation og PvP-viskositet. Klik på OK | Aspirere. Efter 60 s, vil koppen rotere og aspirere prøven for 15 s. Klik på OK , når rotationen stopper. Luk maskinens låg. Klik på Fortsæt | Start nu, da oxygen gradient ektacytometri udføres med en fast gevinst. Målingen vil tage ca. 28 min.
- Efter målingen udskrives rapporten, der viser den kurve og de parametre, der automatisk beregnes af softwaren. Sørg for, at de rå data automatisk gemmes i den udpegede mappe i Indstillinger. Maksimal EI (EIMax), minimum EI (EImin), pO2@ 95% ei (POS) og område (område under kurven) beregnes automatisk og føjes til den udskrevne rapport og rå data.
- Du kan manuelt få ΔEI ved at beregne forskellen mellem EIMax og eimin. Beregn den procentvise restitution ved at tage forskellen i gennemsnitlig EI før deoxygenering (pO2 100 – 120 mmHg) og gennemsnitlige ei værdier under reoxygenering ved 100 – 120 mmHg.
5. rengøring af ektacytometer
- Fjern prøve sprøjten og Udskift den med en sprøjte fyldt med destilleret vand eller deioniseret vand.
- Tryk på Clean, og træk langsomt stikket ud under skylning. Sørg for at skylle i begge retninger.
- Fjern sprøjten og løft Bob. Tør Bob, kop og stik grundigt med en blød klud.
- Brug en stor sprøjte (10 – 50 mL) til at skylle stikket for at fjerne eventuelt resterende vand i rørene og Bob. Bloker den nedre indløb/udløb af Bob for at komme tilbage trykket i rørene, og dermed fjerne resterende vand.
- Sænk Bob i koppen. Maskinen er nu klar til næste måling.
6. nedlukning af maskinen
- Sørg for, at maskinen er korrekt skyllet efter den sidste måling, som beskrevet ovenfor. Sørg for, at de rigtige rør er relateret til rengøringsopløsningen.
- Luk softwaren, tryk på Luk, og tryk på Start for at starte rengøringsprogrammet til dagen.
- Efter at have afsluttet hele rengøringsprogrammet, fjerne sprøjten og løft Bob. Skyl stikket med en stor sprøjte.
- Tøm affaldsflasken og tør Bob og kop med en blød klud. Skyl stikket for at fjerne det resterende vand i rørene og Bob. Bloker den nedre indløb/udløb af Bob for at komme tilbage trykket i rørene, og dermed fjerne eventuelle resterende vand.
- Luk låget på maskinen. Luk nitrogen cylinderen. Sluk computeren og maskinen.
Representative Results
Oxygen gradient ektacytometri kan bruges til at karakterisere sickling adfærd hos patienter med SCD. I dette studie blev der inkluderet blodprøver fra i alt 38 SCD-patienter og fem raske kontroller. I sunde Kontroller, diffraktion mønster er cirkulær i hvile og elliptisk ved højere shear stress4. Fra det elliptiske diffraktions mønster beregnes elongationsindekset (EI) ud fra højden og bredden af diffraktions mønsteret. I oxygen gradient ektacytometri efterfølges langsom og kontinuerlig deoxygenering af prøven med nitrogen gas ved hurtig reoxygenering i luften. Under disse betingelser, RBC sickling kan observeres under deoxygenering. Dette vil forårsage en forvrængning af diffraktion mønster, fordi siklede røde celler ikke vil tilpasse sig korrekt under den anvendte shear stress. Derfor synes de at være mindre deformerbare i modsætning til raske RBCs (figur 2).
Figur 3A viser, hvordan segl RBCs ændrer form ved deoxygenering, som efterligner forholdene under iltgradient ektacytometri, mens kontrol segl RBCs uden deoxygenering ikke viser nogen ændring i form. Denne proces resulterer i forvrængning af diffraktion mønster under ilt gradient ektacytometri, og dermed i et fald i EI. Figur 3B viser de forskellige diffraktions mønstre, hvorfra der genereres forskellige parametre.
En repræsentativ kurve opnået ved ektacytometer er vist i figur 3C. Seks parametre afspejler forskellige egenskaber ved sikdrende opførsel af RBCs: EIMax er den maksimale ei ved starten af målingen før deoxygenering. Denne parameter repræsenterer den oprindelige position og afspejler den samlede deformabilitet af den samlede RBC-population i luften. EImin er den mindste ei, som repræsenterer minimal deformabilitet efter deoxygenering. Denne parameter afspejler ændringer i form og retning af (Sickle) RBCs ved deoxygenering. Δei er forskellen mellem eiMax og eimin, hvilket indikerer, hvor mange celler kan segl under en runde af deoxygenering. 5 procent point af sickling (PoS5%) er pO2 (mmHg), hvor en 5% fald i eiMax under deoxygenering måles. Dette repræsenterer den iltspænding, hvor den sickling proces starter. Arealet afspejler arealet under kurven, som bestemmes ved en integreret beregning af EI og pO2 målinger mellem 100 mmHg og po2min (mmHg). Dette er resultatet af tidligere beskrevne parametre EIMax, eimin, og pos. Recovery repræsenterer forskellen i ei i den sidste del af REOXYGENATION sammenlignet med ei ved baseline. Begge EI-værdier måles ved en pO2 på 100 – 120 mmHg. Denne parameter afspejler kapaciteten af RBCs, der segl under deoxygenering at vende sickling under reoxygenation22. Parametre fra dobbelte målinger havde generelt en variationskoefficient (CV) < 5% (median 1,83%). Hvis der blev opnået et CV > 5%, blev der udført en tredje måling. Parametrene EIMax og Recovery er de mest reproducerbare med median CVS < 1%.
Repræsentative kurver for RBCs af raske Kontroller, patienter med HbS træk (heterozygot HbS), og en homozygot SCD patient er vist i figur 4a. Den repræsentative kurve for HbSC-patienten viser en lavere bedring, hvilket kan indikere en anden kvaler ende proces (figur 4B). De repræsentative kurver for HbSS-patienter behandlet med Hydroxyurea (HU) og transfusion er vist i figur 4C og figur 4D. Der er tydeligvis en stor forskel mellem de repræsentative kurver for HS-træk (Hbaceller) og RBCs hos HbSS-patienter behandlet med transfusion (bestående af en blanding af homozygot segl (HbSS) og homozygot normale (HbAA) celler, figur 4a ,D). De tydelige forskelle i kurverne for den ubehandlede SCD-patient og de hu-og transfusions behandlede patienter fremhæver nytten af denne analyse (figur 4C,D). Niveauerne af HbF og HbS korrelerede signifikant med EImin og i mindre grad med pos (figur 5a–D). Dette indikerer, at de laboratorieparametre, der er vigtige i vurderingen af patienten, også afspejles i oxygen gradient ektacytometri. Antallet af sickled celler ved normoxia og procentdelen af tætte RBCs (DRBCs) påvirker begge EImax-værdier, da de er signifikant korrelerede (figur 5E–F), hvilket indikerer, at eimax afspejler en anden vigtig faktor i syg proces. Disse resultater viser, hvordan forskellige egenskaber som har% HbS,% HbF, sickled celler ved normoxia, og% DRBCs påvirke forskellige parametre.
Figur 1. Skematisk opsætning af ektacytometer. Ektacytometer bruger et Couette system til at anvende forskydningsbelastning på cellerne. En roterende ydre cylinder (Cup) og en statisk indercylinder (Bob) bruges til at fremkalde forskydningsbelastning ved at oprette laminar flow ved 37 °C. Mellem Bob og Cup er der et lille hul, hvor blod suspensionen injiceres. En laserstråle skinner fra Bob gennem blod suspensionen og er spredt af tilstedeværelsen af RBCs. Diffraktion mønsteret projiceres og analyseres af et kamera. Elongations indekset (EI) beregnes med højden (a) og bredden (b) af diffraktion mønsteret4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk opsætning af ektacytometer med oxygen gradient ektacytometri modul. Skematisk diagram af modulet, der viser deiltning af blod suspensionen langsomt med infusion af nitrogen gas (N2). Iltspændingen måles ved hjælp af dæmpningen af det luminophore signal, der sendes fra LED-fiber til O2-spot. Ved deoxygenering vil segl RBCs begynde at segl, deres deformabilitet vil falde, og de vil ikke længere tilpasse sig elliptiske RBCs. De sikøjede RBCs forvrænger diffraktions mønsteret og ændrer dets form fra en ellipse til en rhomboideus-eller diamantlignende form. Denne ændring i form af diffraktion mønster resulterer i et fald i EI. Målinger af pO2 og ei udføres ikke i samme højde i koppen. Dette sikrer bedre diskrimination mellem deoxygenering og reoxygenations kurver og dermed en bedre fortolkning af kurven. Dette tal er blevet ændret fra Rab et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentativ oxygen gradient ektacytometri kurve og diffraktion mønstre. (A) ved deoxygenering under forhold svarende til Oxygen gradient ektacytometri blev der fastsat segl RBCs. I kontrol segl RBCs, de samme betingelser blev anvendt, men uden nitrogen gas. Deoxygenerede segl RBCs viser en ændring i form i modsætning til kontrol af RBCs. (B) ved deoxygenering og forskydningsbelastning (30 PA) ændres diffraktions mønsteret fra en ellipse til en rhomboid. C) repræsentativ kurve for iltgradient ektacytometri. Det maksimale elongations indeks (EIMax) repræsenterer udgangspositionen og viser en overordnet deformabilitet af den totale RBC-population. Minimum EI (EImin) repræsenterer minimal deformabilitet, som er forårsaget af ændringen i form og retning af RBCs ved deoxygenering. Δei (dEI, forskellen i ei mellem eiMax og eimin) viser, hvor mange celler kan segl under en runde af deoxygenering. Punkt af sickling (PoS, pO2 ved 5% ei fald) viser iltspændingen, når den første RBCs begynder at segl. Arealet under kurven (fra pO2min = 100 mmHg) beregnes i Parameterområdet. Dette opsummerer EIMax, eimin, og pos. Kapaciteten af sickled celler til at unsickle under reoxygenation er repræsenteret i parameter Recovery (procentdel af EIMax nået under reoxygenation). Til støtte for fortolkningen blev alle datapunkter forbundet i hvert enkelt eksperiment med en linje for at præsentere resultaterne grafisk. Dette tal er blevet ændret fra Rab et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Parametre for iltgradient ektacytometri korrelerer med genotype-og behandlingsregimer for SCD-patienter med SCD. A) repræsentativ graf over RBCs af HBS-bærere (HBS Trait) og sunde Kontroller i forhold til ubehandlede hbss-patienter. B) repræsentativ graf over RBCs af patienter med Hæmoglobinsygdom (hbsc) i forhold til ubehandlede hbss-patienter. C) repræsentativ graf over RBCs af Hydroxyurea-behandlede HOMOZYGOT SCD-patienter (HBSS HU) i forhold til ubehandlede hbss-patienter. D) repræsentativ graf over RBCs af hbss-patienter, som blev behandlet med blodtransfusion (hbss-transfusion) i forbindelse med ubehandlede hbss-patienter. Dette tal er blevet ændret fra Rab et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Parametre for iltgradient ektacytometri er forbundet med% HbF,% HbS,% sickled celler ved normoxia og% tætte RBCs. A) lineær korrelation mellem det mindste forlængede indeks (EImin) og% Hbf af 15 Hbss-eller hbs/β-thalassemia-patienter uden transfusion. B) lineær korrelation af eimin og% HBS.C) lineær korrelation mellem POS og% Hbf.d) lineær korrelation mellem POS og% HBS. (E) lineær korrelation af maksimal ei (EIMax) og procent af sickled celler ved normoxia målt med digital mikroskopi. (F) lineær korrelation af eiMax og procent tætte RBCs (% drbcs) af 21 patienter med hbss. Dette tal er blevet ændret fra Rab et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Indstillinger | ||
| Filer | Opbevaring bibliotek | |
| Generelle indstillinger | Standard medium viskositet | Viskositet af PVP |
| pO2 Scan | Mindste Aspirations tid (r) | 60 |
| pO2 Scan shear stress (PA) | 30 | |
| Fastlæg pO2 hver (e) | 20 | |
| Glidende gennemsnit størrelse | 2 | |
| pO2 scannings trin; Redigere | 0-FRA; 60-ON; 1360 – FRA; 1640-FRA | |
| Cal. område mellem (mmHg) | 10 og 100 | |
| pO2 Control | Fra (ikke markeret) |
Tabel 1. Den foretrukne indstilling af ektacytometer.
Discussion
Her beskriver vi oxygen gradient ektacytometri, en metode, der kan bruges til at undersøge den sikdrende opførsel af røde blodlegemer fra SCD-patienter under en række iltkoncentrationer (figur 4 og figur 5). For at opnå reproducerbare resultater er det vigtigt at identificere de faktorer, der påvirker resultaterne. For eksempel, temperatur har en stor indvirkning på RBC deformabilitet, mest på grund af dens virkninger på tykkelsen af den viskøse opløsning (PVP). Vi anbefaler, at du udfører en test måling i starten af dagen for at varme maskinen grundigt til 37 °C. Dette vil forbedre reproducerbarhed af resultaterne. Osmolariteten af den viskøse opløsning skal være inden for et snævert område (282 – 286 mOsm/kg for PVP), fordi osmolaritet påvirker hydrering status, hvilket igen påvirker RBC deformabilitet. PH og viskositet af PVP bør også reguleres stramt. Forskelle i pH og temperatur kan påvirke kurver dramatisk22. Desuden kan resterende vand i koppen, Bob, og rør, forårsage lysis af RBCs, hvilket resulterer i ukorrekte data, fordi færre intakte RBCs til stede i koppen vil blive målt.
Indstillinger til at udføre oxygen gradient ektacytometri kan justeres for at løse specifikke undersøgelsesspørgsmål. Foretrukne indstillinger er angivet i tabel 1. En deoxygenationstid på 1.300 s blev valgt på baggrund af observationer, der viste, at forlængelsen af deoxygenationen ikke resulterede i en lavere EImin for de fleste patienter. I modsætning hertil ville afkortning af deoxygenationstid hæmme den diskriminerende effekt af oxygen gradient ektacytometri. Reoxygenationstid blev sat til 280 s på grund af de hurtigt løse HbS polymerer under reoxygenering, og samtidig restaurering af EI mod værdier målt før deoxygenationen. Forskydnings stress blev sat til 30 PA, hvilket svarer til den osmotiske gradient ektacytometri. Hvis denne parameter sænkes, kan det hæmme den diskriminerende magt. Der kan anvendes deoxygenations kontrol, hvis der anvendes et sæt deoxygenations hastighed på alle patientprøver. I vores foretrukne indstillinger, denne mulighed blev slukket, fordi satsen for iltsvind er patient-specifikke på grund af den unikke hæmoglobin dissociation kurve. Derfor, at tænde for deoxygenations kontrol ville eliminere denne egenskab fra analysen. Men denne funktion af oxygen gradient ektacytometri er stadig under undersøgelse.
Flere kendte faktorer påvirker oxygen gradient ektacytometri parametre, nemlig pH, temperatur og osmolaritet. Ektacytometri, især PoS, påvirkes af 2,3-diphosphoglycerat (2,3-DPG)22. Der er også en klar sammenhæng mellem% HbF og EImin, og i mindre grad pos (figur 5a–D). EIMax er forbundet med segl celler ved normoxia, som kan forklare den observation, at kort efter en VOC, RBC deformabilitet på normoxia (EIMax), er højere. Sidstnævnte er forårsaget af ødelæggelsen af de mest sickled celler, og dermed mindre deformerbare RBCs under VOC16. Som vist i figur 5F, højere% tætte RBCs (defineret som RBCs med en hæmoglobinkoncentration ≫ 1.11 mg/ml) korrelerer kraftigt med en lavere eiMax. Dette indikerer, at tætte celler er en vigtig faktor i RBC deformabilitet ved normoxia, svarende til tidligere rapporterede resultater1.
Standardisering af prøver er meget vigtig for at opnå reproducerbare resultater og for at skelne mellem forskellige genotyper og behandlinger. Korrektion for RBC Count er vigtigt, da antallet af RBCs påvirke intensiteten af diffraktion mønster. Hvis der er lavere RBC-tal i mellemrummet mellem Bob og Cup, vil kurven skifte opad og til venstre. Desuden vil kurven svinge, hæmmer nøjagtig beregning af parametrene, især PoS.
En begrænsning af denne teknik er, at EI-værdien repræsenterer et gennemsnit af alle celler, herunder forskellige delpopulationer. Heterogenitet af RBC-populationer hos patienter med SCD og dens indflydelse på ektacytometri-målingen er blevet intensivt undersøgt. Dette resulterede i standardisering, hvor størrelsen af diffraktion mønster justeres til en fast værdi i stedet for korrigeret for RBC Count23,24. Hvorvidt denne metode til standardisering også bør anvendes på Oxygen gradient ektacytometri målinger er i øjeblikket under undersøgelse.
Flere teknikker til at måle RBC deformabilitet under hypoksiske betingelser blev udviklet baseret på en iltsvind trin, der fandt sted uden for ektacytometer25,26,27. Under disse betingelser blev der ikke observeret forskelle i cellulær adfærd mellem patienter med HbS-træk og sunde Kontroller under fysiologisk pH25. Oxygen gradient ektacytometri viser imidlertid tydeligt en lav, men tydelig PO'er hos personer med HbS-egenskaber (figur 4a). Til dato, i rutinemæssig klinisk praksis, de eneste alternative metoder til at måle tendensen af en individuel patients RBCs til segl in vitro omfatter en morfologi-baserede sickling assay: RBCs inkuberet under forhold, der fremmer HbS polymerisering, såsom lav iltspænding eller lav pH-værdi. En fiksering tilsættes efter inkubation, og procentdelen af sickled celler er manuelt eller digitalt tælles ved hjælp af let mikroskopi. Mange prækliniske og tidlige fase farmakologiske forsøg anvender sickling assay til at generere en sekundær resultat variabel for at kunne forudsige klinisk effekt i SCD28,29,30,31 ,32. Men det er tidskrævende, variabilitet er høj, og følsomheden er lav, teknikken er ikke automatiseret og derfor arbejdskraftintensiv. Desuden kan morfologiske ændringer på grund af sickling ikke korreleres godt med fysiologiske parametre, såsom RBC deformabilitet, fordi det er en 2-dimensionel statisk analyse2.
Oxygen gradient ektacytometri giver en funktionel analyse af sickling, der er hurtig og reproducerbar. Dette er en in vitro-test, der ikke betragter endotel overflade. Men det giver funktionelle aspekter af sickling adfærd og RBC egenskaber, hvilket gør det en lovende teknik til seglcelle undersøgelser. Fremtidige anvendelser af teknikken omfatter overvågning behandling effekt i SCD patienter, tjener som en biomarkør for nye behandlingsstrategier, studere sickling adfærd, og overvågning chimerisme efter stamcelletransplantation i SCD.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvis støttet af et Eurostars Grant estar18105 og af et ubegrænset tilskud fra RR mechatronics. Forfatterne takker Sisto Hendriks og Jan de Zoeten for deres tekniske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
